時(shí)間：2023-05-24 14:35:05
開(kāi)篇：寫(xiě)作不僅是一種記錄，更是一種創(chuàng)造，它讓我們能夠捕捉那些稍縱即逝的靈感，將它們永久地定格在紙上。下面是小編精心整理的12篇干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，希望這些內(nèi)容能成為您創(chuàng)作過(guò)程中的良師益友，陪伴您不斷探索和進(jìn)步。
2010年諾貝爾生物醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)授予英國(guó)生理學(xué)家羅伯特•愛(ài)德華茲，以表彰他在“體外受精”技術(shù)領(lǐng)域做出的開(kāi)創(chuàng)性貢獻(xiàn)。
1978年，羅伯特•愛(ài)德華教授和同事一起成功地使第一例試管嬰兒誕生，從此開(kāi)創(chuàng)了生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的新紀(jì)元。試管嬰兒在20多年前也曾被世界輿論界視為洪水猛獸而大加抨擊，但時(shí)至今日，這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)被全世界絕大多數(shù)國(guó)家承認(rèn)，堪稱醫(yī)學(xué)史上的一大奇跡。迄今為止，全球已有上百萬(wàn)試管嬰兒誕生。
被譽(yù)為“試管嬰兒之父”的英國(guó)劍橋大學(xué)教授羅伯特•愛(ài)德華說(shuō)：“克隆單純從技術(shù)上講非常簡(jiǎn)單，就是把卵細(xì)胞中DNA去掉，然后將體細(xì)胞中的DNA移入其中。這在世界上任何一個(gè)試管嬰兒實(shí)驗(yàn)室中都可以完成，困難在于如何降低克隆的危險(xiǎn)。”
本文以此熱點(diǎn)問(wèn)題作為命題材料，對(duì)2011年高考生物試題進(jìn)行單項(xiàng)預(yù)測(cè)。預(yù)測(cè)材料及其涉及的知識(shí)、試題如下：
1．試管嬰兒
【知識(shí)鏈接】要做好有關(guān)“試管嬰兒”的試題，除了書(shū)本上的知識(shí)外，還要掌握“試管嬰兒”技術(shù)的有關(guān)知識(shí)?！霸嚬軏雰骸奔夹g(shù)是通過(guò)將不孕夫婦的和卵細(xì)胞取出在試管中完全受精，并在試管中培養(yǎng)使其發(fā)育到囊胚期，再將胚胎移入女性子宮內(nèi)使其發(fā)育成胎兒。
體外受精步驟包括：的采集與培養(yǎng)、卵母細(xì)胞的獲取與培養(yǎng)、體外受精等操作技術(shù)。具體過(guò)程如下圖:
哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育的過(guò)程大體概括如下圖：
例1 下列關(guān)于關(guān)試管嬰兒的說(shuō)法，不正確的是（）
A. 從良種母牛體內(nèi)采集的卵母細(xì)胞都需要進(jìn)行體外培養(yǎng)
B. 從良種公牛采集的需進(jìn)行獲能處理
C. 早期胚胎移植的意義在于提高優(yōu)良母畜的繁殖率
D. 早期胚胎指的是由受精卵發(fā)育至原腸胚時(shí)期的胚
解析：本題考查了試管嬰兒的相關(guān)知識(shí)。根據(jù)體外受精和胚胎發(fā)育過(guò)程圖解可知，早期胚胎指的是由受精卵發(fā)育至囊胚時(shí)的胚。
答案：D
例2 據(jù)2008年1月17日《干細(xì)胞》雜志報(bào)道，某科學(xué)家使用了進(jìn)行試管受精的年輕女性捐獻(xiàn)的卵子，以及2名志愿者的皮膚成纖維細(xì)胞，成功克隆出了5個(gè)人體胚胎，進(jìn)而可以開(kāi)發(fā)出有研究?jī)r(jià)值的干細(xì)胞。請(qǐng)回答：
（1）上述過(guò)程中主要應(yīng)用到的兩項(xiàng)動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)為；若將某經(jīng)過(guò)修飾的基因?qū)肫渲械牟糠峙咛ジ杉?xì)胞，常用的方法是。
（2）在使用合成培養(yǎng)基進(jìn)行胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，通常需要加入等天然成分；在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，要保證被培養(yǎng)的細(xì)胞處于一定的氣體環(huán)境，所需要的氣體主要有 。
（3）科學(xué)家欲進(jìn)行胚胎分割移植，則應(yīng)該選擇發(fā)育良好、形態(tài)正常的或囊胚，將其移入盛有操作液的培養(yǎng)皿中，然后用分割針進(jìn)行分割。
答案：（1）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞核移植顯微注射技術(shù)（法）
（2）血清（血清、血漿） 氧氣和二氧化碳 （3）桑葚胚
2．克隆人研究
【知識(shí)鏈接】克隆人的基本原理是動(dòng)物細(xì)胞核的全能性，包括胚胎細(xì)胞核移植和體細(xì)胞核移植。其基本過(guò)程為：
細(xì)胞核移植技術(shù)中注入去核卵母細(xì)胞中的不是供體細(xì)胞核，而是整個(gè)細(xì)胞，伴隨著兩細(xì)胞融合，體現(xiàn)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：具有一定的流動(dòng)性。該技術(shù)形成重組細(xì)胞繼而發(fā)育成一個(gè)新個(gè)體，體現(xiàn)了細(xì)胞核的全能性而非動(dòng)物細(xì)胞的全能性。
例3 下圖為克隆人的示意圖，據(jù)圖回答：
（1）圖中所涉及的現(xiàn)代生物技術(shù)有、和
等。
（2）下列有關(guān)胚胎移植的敘述正確的有（）
A.沖卵指的是從子宮中沖出胚胎，而非沖出卵子
B.只有供、受體生理環(huán)境高度一致，移入受體的胚胎才能被接受，并繼續(xù)發(fā)育
C.供體和受體要進(jìn)行免疫檢查，防止發(fā)生免疫排斥反應(yīng)
D.不同動(dòng)物其胚胎移植的時(shí)間不同，人的胚胎移植最好在四個(gè)細(xì)胞階段進(jìn)行
（3）圖中兩個(gè)嬰兒長(zhǎng)大后，外貌、性格和其他特征與原型男人相同，這說(shuō)明 具有全能性。
（4）使用培養(yǎng)基進(jìn)行胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，通常要加入等天然成分，除了保證被培養(yǎng)細(xì)胞處于無(wú)菌、無(wú)毒及充足氧氣的環(huán)境中，還需要保證細(xì)胞生活所需的；早期胚胎發(fā)育在階段以前的細(xì)胞是全能細(xì)胞。
（5）圖中從“內(nèi)細(xì)胞團(tuán)到胚胎干細(xì)胞”的培養(yǎng)過(guò)程中，必須用處理內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，使之分散成單個(gè)細(xì)胞。干細(xì)胞形成組織、器官必須要進(jìn)行 和 。
（6）在體外培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞能否獲得動(dòng)物器官?
。為什么？
解析：（1）該圖利用了細(xì)胞核移植、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)、胚胎分割移植等技術(shù)。（2）沖卵一般是指是胚胎收集中的沖卵――胚胎、早期胚胎。供體和受體只有保證具有相同的生理狀態(tài)，才能保證胚胎的正常發(fā)育。（3）克隆過(guò)程說(shuō)明動(dòng)物細(xì)胞核具有全能性。（4）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液的成分包括葡萄糖、氨基酸、無(wú)機(jī)鹽、維生素和動(dòng)物血清等。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的條件：無(wú)菌、無(wú)毒的環(huán)境；營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（合成培養(yǎng)基）；溫度和pH（36.5±0.5℃，7.2～7.4）；氣體環(huán)境（氧氣和二氧化碳）等。（5）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程常用胰蛋白酶處理組織，以使之分散成單個(gè)細(xì)胞。（6）胚胎干細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下一般只能增殖進(jìn)行細(xì)胞分裂，不能發(fā)生細(xì)胞分化。
答案：（1）核移植 胚胎移植 細(xì)胞培養(yǎng)（另外寫(xiě)細(xì)胞融合、胚胎分割也對(duì)，寫(xiě)了三個(gè)則給滿分）（2）ABD（3）動(dòng)物體細(xì)胞核 （4）血清 溫度和pH 桑葚胚（5）胰蛋白酶 細(xì)胞的分裂 分化 （6）不能 胚胎干細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下可以增殖而不發(fā)生分化
3．生物技術(shù)中的倫理問(wèn)題
【知識(shí)鏈接】生物技術(shù)引發(fā)的倫理問(wèn)題包括克隆技術(shù)引發(fā)的倫理問(wèn)題、試管嬰兒引發(fā)的倫理問(wèn)題、基因檢測(cè)引發(fā)的倫理問(wèn)題。中國(guó)政府對(duì)于克隆技術(shù)的態(tài)度是禁止生殖性克隆人，不反對(duì)治療性克隆人；對(duì)于試管嬰兒的態(tài)度，中國(guó)衛(wèi)生部的規(guī)定是實(shí)施體外受精、胚胎移植及衍生技術(shù)必須獲得衛(wèi)生部的批準(zhǔn)證書(shū)。
例4下圖所示為人類“治療性克隆”的大致過(guò)程。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：
（1）圖中①為 細(xì)胞，過(guò)程A是目前實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞克隆的關(guān)鍵技術(shù)，該技術(shù)稱為 。
（2）圖中③能誘導(dǎo)分化出神經(jīng)細(xì)胞、血細(xì)胞、肌肉細(xì)胞，其根本原因是 的結(jié)果。這樣培育得到的組織器官進(jìn)行自體移植的最大好處是 。
（3）若應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)治療遺傳性糖尿病，可將健康人的控制胰島素合成的基因?qū)虢Y(jié)構(gòu)④中的
，原因是這些細(xì)胞 。
（4）在用PCR技術(shù)擴(kuò)增胰島素基因時(shí)，緩沖溶液中必須加入的物質(zhì)有：、分別與兩條模板鏈結(jié)合的兩種引物、 以及四種脫氧核苷酸。DNA的合成方向總是從子鏈的延伸。
（5）我國(guó)政府禁止生殖性克隆，但不反對(duì)治療性克隆研究。為什么要反對(duì)生殖性克隆（即克隆人）呢？請(qǐng)你寫(xiě)出一條理由： 。
解析：從圖可以看才出，治療性克隆是將患者的體細(xì)胞的核與卵細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行重組， 形成重組細(xì)胞，將重組細(xì)胞經(jīng)過(guò)培養(yǎng)得到囊胚，取囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)得到不同組織器官，可用于進(jìn)行自體移植，不會(huì)產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。
答案：（1）次級(jí)卵母（卵） 核移植
（2）基因選擇性表達(dá)不會(huì)產(chǎn)生排異（免疫排斥）反應(yīng)
（3）內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分化程度極低（或具有全能性），可使外源基因在相應(yīng)組織細(xì)胞表達(dá)
【摘要】 目的 探索大鼠骨髓源性肝干細(xì)胞同種異體移植后在受體大鼠模型肝內(nèi)定居情況。方法 采用全骨髓培養(yǎng)法體外培養(yǎng)細(xì)胞，貼壁篩選純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并進(jìn)行體外培養(yǎng)、擴(kuò)增，應(yīng)用肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)誘導(dǎo)分化出肝干細(xì)胞，鑒定后，經(jīng)肝臟中葉注射入同種異體正常組和暴發(fā)性肝衰竭組大鼠體內(nèi)，于移植后的第1、2、4周取受體肝臟移植原位（注射部位)、鄰位（距注射部位0.5 cm)組織，應(yīng)用PCR技術(shù)檢測(cè)性別決定因子基因片段，研究肝干細(xì)胞在大鼠肝臟內(nèi)定居情況。結(jié)果 經(jīng)肝臟注射移植的肝干細(xì)胞在正常組和肝損傷組的肝臟內(nèi)均能定居，且定居的細(xì)胞數(shù)量上肝損傷組明顯多于正常組。結(jié)論 經(jīng)肝臟注射移植的骨髓源性肝干細(xì)胞可以定居于肝臟內(nèi)，且定于肝臟的干細(xì)胞數(shù)量與肝臟是否損傷密切相關(guān)。
【關(guān)鍵詞】 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；肝干細(xì)胞；細(xì)胞移植
骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs) 具有多向分化潛能，可以在體外誘導(dǎo)分化出肝干細(xì)胞，此種骨髓源性肝干細(xì)胞可以為肝組織移植工程提供新的細(xì)胞來(lái)源。近年來(lái)的研究主要集中于體外誘導(dǎo)MSCs為肝干細(xì)胞，此種細(xì)胞具備了肝細(xì)胞的形態(tài)，在體外能夠表現(xiàn)出一定的肝細(xì)胞功能〔1〕，但對(duì)骨髓源性肝干細(xì)胞在體內(nèi)的定居和定位能力情況尚不明確。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)大鼠MSCs進(jìn)行體外培養(yǎng)，誘導(dǎo)、分化出肝干細(xì)胞，同時(shí)建立暴發(fā)性大鼠肝衰竭模型，探討骨髓源性肝干細(xì)胞同種異體移植后在受體大鼠模型肝內(nèi)定居情況。
1 材料與方法
1.1 材料
低糖DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen)、Percoll(Pharmacia，比重1.077 g/L)(Gibco公司)、胎牛血清(杭州四季青)、胰蛋白酶2(Sigma)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF)(CYTOALAB公司)、細(xì)胞培養(yǎng)箱(Forma公司)；純系SD大鼠、3周齡、體重100～120 g(供體大鼠)和成年純系SD雌性大鼠、體重180～220 g(受體大鼠)，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
1.2 骨髓源性肝干細(xì)胞培養(yǎng)
1.2.1 MSCs分離、培養(yǎng)及定向肝干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化
從供體SD大鼠股骨提取骨髓細(xì)胞。用比重1.073的Percoll分離液行MSCs分離，加含抗生素及10%小牛血清的IMDM培養(yǎng)和擴(kuò)增，取第3代MSCs加入HGF(20 μg/L)誘導(dǎo)定向肝干細(xì)胞分化。
1.2.2 誘導(dǎo)后的骨髓源性肝干細(xì)胞鑒定
用ELASA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中的甲胎蛋白（AFP)、白蛋白（ALB)。用免疫組化法檢測(cè)細(xì)胞中細(xì)胞角化蛋白（CK)18、CK19和波形蛋白（Vimentin)的表達(dá)。
1.3 肝損傷動(dòng)物模型的制作和分組
受體雌性SD大鼠20只，隨機(jī)分為正常大鼠組和肝損傷組。肝損傷組用質(zhì)量濃度10%D氨基半乳糖溶液一次腹腔內(nèi)注射，劑量1 200 mg/kg體重。
1.4 同種異體大鼠骨髓源性肝干細(xì)胞移植
正常組大鼠和肝損傷組大鼠，分別以戊巴比妥麻醉，仰臥位固定，常規(guī)消毒、備皮、鋪無(wú)菌巾，上腹正中切口，長(zhǎng)約1 cm，于肝中葉以BD胰島素注射器注射肝干細(xì)胞懸液0.4 ml（107/ml )，觀察無(wú)出血后縫合傷口。
1.5 受體體內(nèi)移植骨髓源性肝干細(xì)胞鑒定
應(yīng)用PCR技術(shù)檢測(cè)性別決定因子基因片段(sex determining region of the Y，Sry)。干細(xì)胞移植后1，2，4 w后取受體肝臟移植原位(注射部位)、鄰位(距注射部位0.5 cm)組織，應(yīng)用PCR技術(shù)檢測(cè)〔2〕性別決定因子基因片段(Sry)。引物按文獻(xiàn)〔3〕設(shè)計(jì)，由上海Casarry生物有限公司合成序列，外引物對(duì)SRY1/ SRY2擴(kuò)增片段大小為317 bp，內(nèi)引物對(duì)SRY3/SRY4擴(kuò)增片段大小為121 bp。
2 結(jié) 果
2.1 骨髓源性肝干細(xì)胞的培養(yǎng)結(jié)果 大鼠MSCs經(jīng)原代培養(yǎng)，細(xì)胞傳代，誘導(dǎo)分化，細(xì)胞異形性較誘導(dǎo)前增加，表現(xiàn)為圓形、橢圓形細(xì)胞數(shù)量較誘導(dǎo)前明顯增加，而梭形細(xì)胞數(shù)量減少，誘導(dǎo)培養(yǎng)10 d左右，細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)為圓形、橢圓形細(xì)胞為主，梭形細(xì)胞已極少見(jiàn)。免疫組化染色，二氨基聯(lián)苯胺（DAB)顯色，在倒置顯微鏡下，可見(jiàn)細(xì)胞形狀顯圓形或卵圓形，胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。CK18、CK19、Vimentin呈陽(yáng)性表達(dá)。細(xì)胞培養(yǎng)液中AFP、ALB含量誘導(dǎo)前分別為(0.021±0.008) ng/ml和(0.72±0.14) g/L；誘導(dǎo)后分別為(0.403±0.042) ng/ml，(6.1±0.32) g/L。誘導(dǎo)后的AFP、ALB含量明顯高于誘導(dǎo)前（P＜0.05)。表明經(jīng)誘導(dǎo)的MSCs分化為肝干細(xì)胞。見(jiàn)圖1。
2.2 肝損傷模型病理結(jié)果
D氨基半乳糖注射后，大鼠肝臟肝索紊亂，肝細(xì)胞腫脹變性、灶性及大片壞死，伴出血及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖2。
2.3 性別決定因子基因片段檢測(cè)結(jié)果
肝損傷組：檢測(cè)1 w時(shí)陰性，2 w時(shí)原位肝組織Sry陽(yáng)性表達(dá)，鄰位未表達(dá)，而4 w時(shí)原位及鄰位組織檢測(cè)到Sry表達(dá)，原位表達(dá)較2 w時(shí)增強(qiáng)，鄰位較弱。正常肝臟組：1及2 w均未檢測(cè)到表達(dá)，4 w時(shí)檢測(cè)到原位微弱表達(dá)。見(jiàn)圖3。
3 討 論
MSCs具有多向分化潛能，特別是具有向肝臟干細(xì)胞、肝細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的潛能〔4〕，因而有望成為肝組織移植工程新的種子細(xì)胞來(lái)源。由于MSCs是成體干細(xì)胞，取材方便，可以來(lái)自患者自身，無(wú)排斥反應(yīng)，故具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道〔5〕，使用HGF，使MSCs分化為肝干細(xì)胞，對(duì)骨髓源性肝干細(xì)胞同種異體移植后在受體大鼠模型肝內(nèi)定居情況進(jìn)行初步研究。
目前研究表明移植肝干細(xì)胞可存活于受體許多部位包括肝、脾、腹腔、胰腺、肺、腸系膜、腎及腎脂肪囊、腹膜后等部位〔2，6～8〕。肝臟由于其獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境、生理及解剖結(jié)構(gòu)環(huán)境無(wú)疑是最理想的場(chǎng)所，可經(jīng)門靜脈輸入或肝實(shí)質(zhì)植入，該組實(shí)驗(yàn)采用肝臟植入方法，取得較好效果，說(shuō)明此方法是安全可行的。本實(shí)驗(yàn)采用同種異體移植，應(yīng)該考慮免疫排斥反應(yīng)，但文獻(xiàn)報(bào)道，純化的MSCs具有獨(dú)特的免疫原性，進(jìn)行同種異體移植不需要預(yù)先應(yīng)用免疫抑制劑，無(wú)免疫排斥反應(yīng)，是良好的基因治療靶細(xì)胞。
目前鑒定受體體內(nèi)被移植后的肝干細(xì)胞有許多方法，其中較為常用的是以雄性動(dòng)物為肝干細(xì)胞供體〔1〕，雌性動(dòng)物接受細(xì)胞移植后，分化增殖的細(xì)胞 Y 染色體陽(yáng)性，證明雌性受體內(nèi)存活的細(xì)胞來(lái)自雄性供體細(xì)胞，這就可以清楚地將植入的細(xì)胞與原有的細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)，進(jìn)一步研究移植作用，本實(shí)驗(yàn)采用雄性供體細(xì)胞為雌性受體移植，檢測(cè)移植部位細(xì)胞的Y染色體表達(dá)情況，進(jìn)而檢測(cè)移植細(xì)胞是否定植。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，移植后2 w肝衰竭大鼠移植原位檢測(cè)到表達(dá)，4 w表達(dá)明顯增強(qiáng)，而且臨近部位出現(xiàn)表達(dá)；正常大鼠在移植后4 w移植原位出現(xiàn)微弱表達(dá)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，骨髓源性肝干細(xì)胞在正常大鼠肝臟及肝損傷大鼠肝臟內(nèi)均能定居，但在肝損傷大鼠肝臟內(nèi)定居能力明顯增強(qiáng)?？紤]可能為大鼠肝損傷后，刺激機(jī)體分泌出各種促進(jìn)肝細(xì)胞再生的生長(zhǎng)因子，為移植細(xì)胞提供定居所需的微環(huán)境。文獻(xiàn)報(bào)道，在正常大鼠體內(nèi)，HGF等因子的活性是被抑制的，只有在肝損傷時(shí)，啟動(dòng)肝再生程序，這些因子才能被激活，引起肝細(xì)胞有絲分裂。
本文通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了大鼠骨髓源性肝干細(xì)胞移植后可以定居于受體肝臟內(nèi)，而且在肝損傷后有利于干細(xì)胞移植的定居，這為下一步研究定居于肝內(nèi)的骨髓源性肝干細(xì)胞的功能奠定了基礎(chǔ)。
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Improved culture method of Human epidermal stem cell and tissue engineering skin construction
ZHANG Yan-gang, HU Da-hai, ZHANG Zhan-feng,CAI Wei-xia, ZHU Hua-yu, SHE Tao
(Department of Burn and Skin Surgery, Burns Center of PLA, Xijing Hospital, the Fourth Military Medical University, Xi'an 701132,Shaanxi,China)
Abstract:ObjectiveTo improve the traditional methods of dissociation and culture of the human epidermal stem cells (hESCs) and provide more productive and more active seed cells for tissue engineering skin construction.MethodsCell morphology was observed by inverted microscope, MTT law growth curve. Immunocytochemistry was used to observe the expression of β1 integrin and keratin 19 (CK19) on epidermal stem cells. Compare the morphological features of tissue engineered skin constructed with the seed cells which were obtained by two methods.Results Trypan blue staining displays the number of hESCs dissociated by modified method is(92.25±15.61)significantly elevated compared with traditional method (68.50±26.91)(P＜0.01),and the proportion of living cells 94%±0.01% increased significantly compared with traditional method(75%±0.04%)(P＜0.05).The result of immunocytochemistry showed that the expression of β1 integrin and keratin 19(CK19) was positive, which were markers of hESCs. HE staining showed that, by using the improved method, the number of multiple epidermal layers was 5～6 on tissue engineering, and cells of epidermal in the basal partwere arranged. In contrast, the number of multiple epidermal layers was 3～4, and the cells of epidermal in basal part arranged in scattered by using the traditional method. ConclusionHuman epidermal stem cells in a larger amount and better vitality can be obtained by using a modified enzyme digestion method, which form basis of construction of skin tissue engineering.
Key words:human epidermal stem cells; enzyme digestion; tissue engineering skin; dissociating; culturing
近年來(lái)仿照皮膚的生理結(jié)構(gòu)，人們構(gòu)建各種組織工程皮膚，有望解決皮源短缺及預(yù)后瘢痕的問(wèn)題，其種子細(xì)胞主要是表皮干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等。因此，表皮干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)就成了必須面對(duì)的問(wèn)題，在以往的報(bào)道中[1-4]，有關(guān)hESCs的培養(yǎng)常采用中性蛋白酶（Dispase）消化過(guò)夜分離表皮層、再以0.25%胰蛋白酶37℃消化10～15 min分離表皮干細(xì)胞，但實(shí)際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)該方法存在細(xì)胞活力差，產(chǎn)率低等缺點(diǎn)。本研究中我們采用改良后的方法分離培養(yǎng)hESCs并和常規(guī)的培養(yǎng)方法加以比較，旨在建立一種更為高效的分離培養(yǎng)表皮干細(xì)胞的方法。
1材料和方法
1.1 實(shí)驗(yàn)材料和主要儀器：取小兒包皮組織（2～6歲），(來(lái)自西京醫(yī)院泌尿外科包皮環(huán)切術(shù)，均取得患者家屬知情同意)。DispaseⅡ酶（Gibco）；Trypsin（Gibco）；DMEM (Hyclone)；胎牛血清（FBS，杭州四季青）；角質(zhì)形成細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基(K-SFM，Gibco)；表皮生長(zhǎng)因子（epidemal growth factor, EGF）和牛垂體提取物（bovine pituitary extract, BPE）(Gibco)；人胎盤Ⅳ型膠原(Sigma)，MTT (Gibco)；DMSO (西安化學(xué)試劑廠)；多聚甲醛(西安化學(xué)試劑廠)；小鼠抗人β1整合素（鼠單抗IgG）、CK19（鼠單抗IgG） (北京中杉金橋生物技術(shù)公司）；鼠尾膠原（自制）；臺(tái)盼藍(lán)；倒置熒光顯微鏡（Olympus）；M680型酶標(biāo)儀（伯樂(lè)公司）。
1.2人表皮干細(xì)胞分離、培養(yǎng)：修剪皮下結(jié)締組織，0.9% NaCl浸泡、清洗3遍，每次5～10min，0.05%醋酸氯已定+0.9% NaCl（1:2，體積比）浸泡5～8min，再次0.9% NaCl浸泡清洗3遍，每次10min，然后將上述組織塊置于4℃ Dispase酶(0.25%)浸泡14～16h。以下為兩種方法分離人表皮干細(xì)胞。
傳統(tǒng)方法：取出皮片，0.9% NaCl反復(fù)清洗，分離表皮和真皮層，剪碎表皮為1.0mm×1.0mm，加0.25% Trypsin + 0.02% EDTA，37 ℃水浴10min加入含有10% FBS的DEME終止消化。反復(fù)吹吸至細(xì)胞懸浮，200目篩網(wǎng)過(guò)濾，1 000rpm離心5～10min，棄上清，收集細(xì)胞，用人表皮干細(xì)胞培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞（10ml），吹打成單細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)染色。并接種于預(yù)先鋪有Ⅳ型膠原的25cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置于37℃，5% CO2孵育箱中孵育10～15 min后，吸出培養(yǎng)液及未貼壁細(xì)胞，PBS洗2次，加入適量新鮮培養(yǎng)基（K-SFM，5ng/ml hEGF，30 μg/ml BPE）繼續(xù)培養(yǎng)。
改良方法：取出皮片，0.9%氯化鈉反復(fù)清洗，分離表皮和真皮層，將表皮置于小抗生素瓶后加0.125% Trypsin+ 0.01% EDTA3ml，彎頭吸管快速攪拌2min，吸出并加入離心管（已經(jīng)加有10% FBS的DMEM 1.5ml）中和，再次重復(fù)消化一次，吸出后加入另一離心管（已經(jīng)加有10% FBS的DMEM 1.5ml）中和，將前后兩次消化液體合并，離心（1 000rpm，5min），PBS10ml懸浮細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定后，再次離心（1000rpm，5min），表皮干細(xì)胞培養(yǎng)基（K-SFM）懸浮細(xì)胞，接種于預(yù)先鋪有Ⅳ型膠原的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置于37℃，5% CO2孵育箱中孵育4～5min后，吸出培養(yǎng)液及未貼壁細(xì)胞，PBS洗2次,加入適量新鮮表皮細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)（K-SFM，5ng/ml hEGF, 30μg/ml BPE）。
1.3表皮干細(xì)胞增殖：將兩種方法分離出的hESCs分別作MTT比色試驗(yàn)。兩組細(xì)胞均以1×105個(gè)/孔的密度接種預(yù)先鋪有Ⅳ型膠原的24孔板內(nèi)，每24h取3孔做MTT比色實(shí)驗(yàn)。根據(jù)每天記錄的細(xì)胞數(shù)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖。
1.4 表皮干細(xì)胞鑒定：取二代表皮干細(xì)胞培養(yǎng)36 h，PBS清洗3遍，4%多聚甲醛固定30min，PBS清洗；0.1%Triton X-100孵育10min；PBS清洗3次，每次5min；3%H2O2去離子水孵育5～10min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性；2%山羊血清封閉20 min,加入CK19（1:50稀釋）、整合素-β1（1:50稀釋）一抗4 ℃過(guò)夜；PBS洗5次，滴加生物素化二抗工作液200μl，37℃孵育10min，PBS洗5次；滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉素卵白素工作液200μl, 37℃孵育10min，PBS洗5次；顯色劑顯色。
1.5構(gòu)建組織工程皮膚：以兩種不同方法分離、培養(yǎng)的hESCs為種子細(xì)胞，鼠尾膠原復(fù)合成纖維細(xì)胞作為支架材料構(gòu)建組織工程皮膚。4ml 5×DMEM和14ml膠原于冰上混勻，用1mol/L NaOH調(diào)至中性后，加入2mlFBS（含2×106成纖維細(xì)胞）混勻，以3ml/孔加入Transwell小室內(nèi)，放入37℃，5% CO2孵箱培育，待其凝固后加入10% FBS的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)，24h后將2代hESCs以3×106/孔種植于鼠尾膠原表面，氣-液面培養(yǎng)1周。
1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，兩組間均數(shù)比較行兩樣本t的方差分析， P＜0.05為差異有顯著性意義。
2結(jié)果
2.1 改良消化法和傳統(tǒng)消化法細(xì)胞消化效率的比較：將同一塊包皮組織等份分開(kāi)，用兩種方法同時(shí)分離表皮細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色、細(xì)胞計(jì)數(shù)（總體積均為10ml），實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)5次。
2.2改良法和傳統(tǒng)法分離細(xì)胞形態(tài)學(xué)比較：采用Ⅳ型膠原粘附法分選表皮干細(xì)胞，改良法較傳統(tǒng)法粘附細(xì)胞密度大，4h后大部分細(xì)胞貼壁良好，鏡下可見(jiàn)細(xì)胞胞體小，核質(zhì)比大，呈三角形或多邊形。接種后第二天培養(yǎng)基中存在一定數(shù)量的漂浮細(xì)胞，但改良法漂浮細(xì)胞數(shù)明顯少（圖2）。3天后，有部分細(xì)胞形成較小克隆，胞體緊密相靠，胞膜互相銜接，呈典型“鋪路石樣”生長(zhǎng)。
2.3改良法和傳統(tǒng)法細(xì)胞增殖比較：兩組細(xì)胞在第2天細(xì)胞數(shù)量有所下降，均在第4天時(shí)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，改良法細(xì)胞在對(duì)數(shù)期呈明顯上升趨勢(shì)，于第7天到達(dá)平臺(tái)期，鏡下觀察細(xì)胞融合；傳統(tǒng)法細(xì)胞對(duì)數(shù)期上升緩慢，第8天時(shí)細(xì)胞仍未融合。由此表明出改良法細(xì)胞活性較好生長(zhǎng)較快（圖3）。
2.4改良法和傳統(tǒng)法分離細(xì)胞的鑒定天對(duì)采用兩種方法培養(yǎng)的hESCs行K19、β1整合素免疫染色，結(jié)果顯示，95%以上細(xì)胞K19、β1整合素均呈陽(yáng)性表達(dá)(圖4)，且兩種方獲得的表皮干細(xì)胞生物學(xué)特性無(wú)顯著差異。
2.5 改良法和傳統(tǒng)法分離的細(xì)胞構(gòu)建組織工程皮膚組織學(xué)比較：兩種方法分離培養(yǎng)的hESCs分別構(gòu)建出的組織工程皮膚均呈3層：由下到上為真皮層、表皮層、角質(zhì)層。改良法細(xì)胞構(gòu)建的組織工程皮膚表皮層厚，約5～6層，表皮和真皮交接處可見(jiàn)細(xì)胞排列整齊，形似基底細(xì)胞。傳統(tǒng)法細(xì)胞構(gòu)建的組織工程皮膚表皮層較薄，約3～4層，表皮真皮交接處未見(jiàn)類似基底細(xì)胞（圖5）。
3 討論
hESCs是皮膚組織的特異性干細(xì)胞，具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能。是皮膚發(fā)生、修復(fù)、重塑的關(guān)鍵性源泉[5]，以其作為種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程皮膚，可獲得與生理皮膚相類似的組織結(jié)構(gòu)。臨床上大面積較深度燒傷往往導(dǎo)致表皮、真皮的損傷缺失，近年來(lái)，利用含有hESCs的組織工程皮膚覆蓋創(chuàng)面取得一定的效果，而在其構(gòu)建的過(guò)程中表皮干細(xì)胞的分離培養(yǎng)是必須面對(duì)的問(wèn)題。
傳統(tǒng)的方法中表皮層與真皮層分離后，用剪刀剪碎成1.0mm×1.0mm大小后進(jìn)行胰蛋白酶消化，減碎的過(guò)程中暴露在組織邊緣的細(xì)胞增多，而剪刀的擠壓可對(duì)組織造成擠壓損傷[6]，導(dǎo)致部分細(xì)胞壁損害進(jìn)而細(xì)胞活力下降或死亡，在改良的方法中，直接進(jìn)行胰酶消化避免了這一損傷情況的發(fā)生。在胰酶消化這一步，傳統(tǒng)方法采用0.25%胰蛋白酶＋0.02% EDTA，37℃水浴，10min，而改良方法以0.125%＋0.01% EDTA胰蛋白酶也可以消化下來(lái)表皮干細(xì)胞，并且胰蛋白酶的含量低，減少了胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞的損傷。當(dāng)胰酶將細(xì)胞分泌的粘蛋白膜水解后，如還沒(méi)有終止它的活性，此時(shí)胰酶就有可能進(jìn)攻細(xì)胞內(nèi)的某些蛋白質(zhì)，造成它們的解離，進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞凋亡[7]。胰酶濃度的降低也少了中和血清的用量，從而降低了血清對(duì)hESCs分化的影響[8]。對(duì)比傳統(tǒng)方法，將37℃消化改為常溫下消化，進(jìn)一步降低胰酶的活性。為了進(jìn)一步減少胰酶對(duì)細(xì)胞的損傷，再將傳統(tǒng)方法的消化10min改良為2次消化，每次2min總計(jì)4min，每次消化后立即終止。以往的方法中，用來(lái)消化時(shí)，將剪碎的細(xì)胞置于胰酶中反復(fù)吹打，而吹打本身也會(huì)造成細(xì)胞損傷，且吹打容易產(chǎn)生泡沫加劇細(xì)胞損害，本改良方法中，只以吸管做攪動(dòng)，充分均勻胰酶的消化作用又不會(huì)產(chǎn)生吹吸的作用，減少了細(xì)胞在反復(fù)吹打過(guò)程中的損傷。
將同一塊包皮組織等份分開(kāi)，用兩種方法同時(shí)分離hESCs，臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果表明：改良法的活細(xì)胞率明顯大于傳統(tǒng)法細(xì)胞，從形態(tài)上觀察，細(xì)胞展開(kāi)生長(zhǎng)無(wú)差異。我們用兩種方法培養(yǎng)的原代細(xì)胞繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線（圖3），可以看出改良法細(xì)胞存活數(shù)量多，增殖速度快，細(xì)胞活性好，證明了改良法培養(yǎng)可以快速獲得大量hESCs。研究表明，K19表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞多分布在毛囊隆突部和基底膜，且具有干細(xì)胞的慢周期性和強(qiáng)大的增殖特性，而終末分化的表皮細(xì)胞則表達(dá)K10。所以K19也被認(rèn)為是表皮干細(xì)胞的特異性標(biāo)志[9]。β1整合素不僅介導(dǎo)表皮干細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附，也調(diào)控終末分化啟動(dòng)，β1整合素表達(dá)的降低會(huì)刺激表皮干細(xì)胞離開(kāi)干細(xì)胞池，向上遷移成為終末分化細(xì)胞，因而認(rèn)為β1整合素高表達(dá)可以是表皮干細(xì)胞的標(biāo)志物之一[10-11]。我們將應(yīng)用Ⅳ膠原快速貼壁的改良法細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞免疫化學(xué)方法研究，顯示改良法細(xì)胞K19、β1整合素呈陽(yáng)性表達(dá)，證實(shí)了采用改良方法培養(yǎng)的細(xì)胞為hESCs。進(jìn)一步分別采用兩組細(xì)胞為種子細(xì)胞，鼠尾膠原為支架構(gòu)建組織工程皮膚，組織切片HE染色顯示改良組hESCs細(xì)胞構(gòu)建的組織工程皮膚表皮層較厚，細(xì)胞復(fù)層多，表皮細(xì)胞復(fù)層層數(shù)為5～6層、基底細(xì)胞排列整齊，而傳統(tǒng)組hESCs構(gòu)建的組織工程皮膚表皮細(xì)胞復(fù)層層數(shù)為3-4層、基底細(xì)胞排列散亂，表明應(yīng)用改良組細(xì)胞更適宜構(gòu)建組織工程皮膚（圖5）。
表皮干細(xì)胞是一種在成年期還能維持較高的自我更新能力的細(xì)胞群，在正常狀態(tài)下維持表皮的自我更新，當(dāng)受到損傷刺激時(shí)，表皮干細(xì)胞可以參與皮膚損傷的修復(fù)[12]，本研究采用改良法分離培hESCs并與傳統(tǒng)方法對(duì)比，顯示出改良方法培養(yǎng)出的hESCs活力和增值能力更好，構(gòu)建的組織工程皮膚具有更好的形態(tài)結(jié)構(gòu)，為以表皮干細(xì)胞為種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程皮膚進(jìn)一步奠定了基礎(chǔ)。
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【摘要】 ［目的］探索在旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器內(nèi)，應(yīng)用微載體技術(shù)快速擴(kuò)增并向軟骨分化人脂肪干細(xì)胞。［方法］將人脂肪干細(xì)胞結(jié)合Cytodex3微載體在旋轉(zhuǎn)的生物反應(yīng)器（RCSS）內(nèi)進(jìn)行動(dòng)態(tài)培養(yǎng)，應(yīng)用倒置顯微鏡和掃描電鏡對(duì)微載體表面的脂肪干細(xì)胞進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，并對(duì)收獲的脂肪干細(xì)胞進(jìn)行SafraninO、toluidine blue染色等組織化學(xué)染色及Ⅱ型膠原的免疫化學(xué)染色分析。［結(jié)果］脂肪干細(xì)胞于24 h內(nèi)貼附于Cytodex3微載體表面，細(xì)胞形態(tài)為短梭形，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，貼附于微載體的細(xì)胞逐漸增多，到培養(yǎng)后期，細(xì)胞密度可達(dá)最初接種的19倍左右，在微載體上收獲的細(xì)胞進(jìn)行番紅花O、阿利新藍(lán)染色呈陽(yáng)性，Ⅱ型膠原染色陽(yáng)性，均強(qiáng)于對(duì)照組。［結(jié)論］利用微載體細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可簡(jiǎn)便快速地在體外擴(kuò)增脂肪干細(xì)胞，并成功實(shí)現(xiàn)向軟骨細(xì)胞分化。
【關(guān)鍵詞】 脂肪干細(xì)胞； 生物反應(yīng)器； 微載體； 軟骨細(xì)胞
自從2001年Zuk等人［1］從脂肪中提取出了具有多向分化潛能的干細(xì)胞后，脂肪干細(xì)胞(adipose derived stem cells，ADSCs)以其來(lái)源廣泛，取材方便，擴(kuò)增迅速等優(yōu)點(diǎn)迅速成為了組織工程的研究熱點(diǎn)。多項(xiàng)研究證實(shí)，ADSCs在體外可以向多種細(xì)胞系分化，包括骨、軟骨、脂肪、肌肉、神經(jīng)及內(nèi)皮［2、3］。其生物學(xué)特性與骨髓基質(zhì)干細(xì)胞非常相似，在組織工程領(lǐng)域頗具應(yīng)用前景。而軟骨是公認(rèn)的最適于應(yīng)用組織工程技術(shù)構(gòu)建的組織，因此以ADSCs作為軟骨組織工程的種子細(xì)胞，具有很高的實(shí)用價(jià)值。構(gòu)建組織工程軟骨通常要求短期內(nèi)獲得大量的種子細(xì)胞，并且在體外培養(yǎng)過(guò)程中能夠保持良好的表型。傳統(tǒng)的靜態(tài)培養(yǎng)方式很難滿足這些要求，而立體三維動(dòng)態(tài)培養(yǎng)不但可以加速細(xì)胞的增殖，而且利于軟骨方向分化及表型的維持［4］。因此，本研究利用生物反應(yīng)器技術(shù)結(jié)合微載體對(duì)ADSCs進(jìn)行快速擴(kuò)增同時(shí)向軟骨細(xì)胞方向誘導(dǎo)，旨在觀察ADSCs在微載體上增殖分化情況，探討其未來(lái)臨床應(yīng)用的可行性。
1 材料和方法
1.1 材料
Ⅰ型膠原酶，地塞米松，2磷酸1抗壞血酸，ITS，Cytodex 3(Sigma)，胰酶，高糖DMEM(Gibco)，胎牛血清(元亨圣馬)，F(xiàn)GF2、TGFβ1(Peprotech，UK)，Ⅱ型膠原鼠抗人單克隆抗體(北京中山公司)，旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器(Synthecon)，Olympus倒置顯微鏡(Olympus)。
1.2 方法
1.2.1 ADSCs的分離培養(yǎng) 取膝關(guān)節(jié)置換術(shù)中切除的髕下脂肪墊，嚴(yán)格保持無(wú)菌，取材后30 min內(nèi)進(jìn)行干細(xì)胞分離。在超凈工作臺(tái)中，用顯微剪刀仔細(xì)剔除脂肪組織表面的筋膜和小血管，DHank's沖洗3遍以洗去紅細(xì)胞的污染。剪碎，加入5倍體積的0.075%的Ⅰ型膠原酶，37℃、攪拌30 min，離心2 000 r/min，5 min，傾去上層脂肪及上清，DHank's洗滌，100目篩網(wǎng)過(guò)濾。離心1 000 r/min 5min，沉淀用DHank's洗2遍，將細(xì)胞重懸于含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基，48 h后換液。細(xì)胞長(zhǎng)滿80%后，用0.25%胰酶消化傳代培養(yǎng)。至第2代時(shí)，換培養(yǎng)液為軟骨誘導(dǎo)液(5 ng/ml FGF2，10 ng/ml TGFβ1，50 μg/ml Vc、10-7M Dexamethasone，1xITS)進(jìn)行軟骨方向誘導(dǎo)分化。
1.2.2 Cytodex 3預(yù)處理 取干重微載體珠50 mg，放入10 ml的潔凈玻璃瓶中。向瓶中加入不含鈣和鎂離子的PBS 10 ml，室溫下至少孵育3 h以膨脹微載體珠，用巴氏吸管棄去上清液，PBS清洗微載體2次，棄去PBS，再加入新鮮不含鈣和鎂離子的PBS 10 ml，高壓滅菌20 min，吸除上清液，微載體用培養(yǎng)液清洗，置于4℃冰箱中備用。
1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)方式 將Cytodex 3微載體50 mg及ADSCs(最終濃度1×105/ml)加入到10 ml體積的RCSS培養(yǎng)容器中，并補(bǔ)加軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基至充滿容器。把接種細(xì)胞的容器連接于旋轉(zhuǎn)底座。整個(gè)裝置放于5%CO2孵箱，于37℃常規(guī)條件下培養(yǎng)。開(kāi)始以5 r/min的速度旋轉(zhuǎn)5 min，以充分混合細(xì)胞，然后停止旋轉(zhuǎn)5 min。再旋轉(zhuǎn)容器5 min，再停止容器旋轉(zhuǎn)5 min。多次重復(fù)循環(huán)，最后持續(xù)旋轉(zhuǎn)容器并逐步調(diào)整轉(zhuǎn)速至10～12 r/min。視培養(yǎng)基顏色及pH值決定是否換液及換液量。ADSCs靜止培養(yǎng)是以1×105/ml接種于6孔板中，每孔2 ml，接種5孔，培養(yǎng)過(guò)程中每2～3 d更換培養(yǎng)液，保持細(xì)胞供養(yǎng)充足。
1.2.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和計(jì)數(shù) 人ADSCs分別培養(yǎng)1、3、5、7 d，取樣本于倒置顯微鏡下觀察微載體表面ADSCs生長(zhǎng)形態(tài)及增值變化情況，消化、分離微載體表面的軟骨細(xì)胞并用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，描記細(xì)胞培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線。并取第3 d細(xì)胞微載體樣本，進(jìn)行掃描電鏡觀察，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)及基質(zhì)分泌情況。對(duì)照組靜態(tài)單層培養(yǎng)的ADSCs細(xì)胞，分別于1、3、5、7 d觀察細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)及增值變化情況，并收集一孔細(xì)胞計(jì)數(shù)，描記細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
1.2.5細(xì)胞化學(xué)及免疫細(xì)胞化學(xué)分析分別將微載體上生長(zhǎng)的ADSCs和單層培養(yǎng)的ADSCs進(jìn)行消化收集，爬片，應(yīng)用SafraninO染色，toluidine blue染色觀察細(xì)胞外基質(zhì)中GAG合成和分泌情況。應(yīng)用Ⅱ型膠原單克隆抗體與細(xì)胞爬片共同孵育，以DAB為底物應(yīng)用免疫過(guò)氧化物酶法顯色，陽(yáng)性染色為棕色反應(yīng)，觀察Ⅱ型膠原分泌合成情況。
2 結(jié)果
2.1 ADSCs在Cytodex 3微載體表面貼附生長(zhǎng)情況
細(xì)胞接種3 h后，細(xì)胞開(kāi)始貼附于微載體表面，24 h后，絕大部分細(xì)胞已經(jīng)貼附在微載體表面，培養(yǎng)基中僅可見(jiàn)少量死亡細(xì)胞。細(xì)胞由球形、半球形逐漸伸展為短梭形，偶見(jiàn)偽足伸出，形態(tài)不規(guī)則(圖1a)。第3 d，微載體表面細(xì)胞明顯增多，在不同焦距平面上均可見(jiàn)細(xì)胞貼附生長(zhǎng)，細(xì)胞周圍可見(jiàn)基質(zhì)分泌沉淀，微載體間偶見(jiàn)細(xì)胞連接。細(xì)胞形態(tài)呈短梭形扁平狀。培養(yǎng)基中少見(jiàn)死亡細(xì)胞，電鏡掃描，細(xì)胞在微載體表面貼附良好(圖1b)。第5 d，微載體大部分空間已被細(xì)胞所覆蓋，細(xì)胞層疊生長(zhǎng)，大量基質(zhì)分泌，單個(gè)細(xì)胞形態(tài)不易區(qū)分，微載體之間可見(jiàn)寬大的細(xì)胞連接體，微載體呈團(tuán)狀生長(zhǎng)(圖1c)。第7 d，微載體已被完全覆蓋，表面細(xì)胞互相重疊呈團(tuán)塊狀，這使得微載體表面變得粗糙、凹凸不平。微載體間廣泛存在細(xì)胞連接，培養(yǎng)基中幾乎無(wú)脫落細(xì)胞(圖1d)。
2.2 ADSCs在靜態(tài)培養(yǎng)中生長(zhǎng)情況
細(xì)胞接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基2 h后，開(kāi)始貼壁，24 h后全部貼壁。細(xì)胞形態(tài)為短梭形或多角形，與未誘導(dǎo)ADSCs相比較細(xì)胞個(gè)體略大。完全貼壁后即開(kāi)始快速增殖，3 d達(dá)到50%融合，5 d達(dá)到80%融合。隨細(xì)胞密度增加，增值速度減慢，7 d基本完全融合。
2.3 2種不同培養(yǎng)方式下ADCSs的生長(zhǎng)曲線
在第1、3、5、7d，分別從RCCS容器及普通培養(yǎng)瓶中收集ADSCs并計(jì)數(shù)，做生長(zhǎng)曲線如圖2。臺(tái)盼藍(lán)染色排除試驗(yàn)顯示，從微載體上回收ADSCs存活率90%以上。血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，可見(jiàn)ADSCs于RCSS接種后的第3 d起生長(zhǎng)加速，至第7 d細(xì)胞密度達(dá)到最高值，約為最初接種的19倍。靜態(tài)單層培養(yǎng)第7 d收獲細(xì)胞總數(shù)約為最初的6倍余。
2.4 細(xì)胞化學(xué)及免疫細(xì)胞化學(xué)檢查分析
2組不同培養(yǎng)方式的ADSCs爬片染色顯示，微載體培養(yǎng)的細(xì)胞SafraninO染色，toluidine blue染色呈強(qiáng)陽(yáng)性，強(qiáng)于靜態(tài)培養(yǎng)組，表明細(xì)胞外基質(zhì)中含有大量GAG；Ⅱ型膠原染色亦呈強(qiáng)陽(yáng)性。結(jié)果表明微載體上培養(yǎng)的ADSCs經(jīng)過(guò)動(dòng)態(tài)誘導(dǎo)培養(yǎng)，有軟骨特征性基質(zhì)成分表達(dá)(圖3～5)。
3 討論
脂肪來(lái)源干細(xì)胞容易獲得，并且來(lái)源廣泛，與骨髓基質(zhì)干細(xì)胞一樣均屬于來(lái)自中胚層的成體干細(xì)胞。De Ugarte等［5］發(fā)現(xiàn)來(lái)源于骨髓和脂肪組織的干細(xì)胞在細(xì)胞獲得率、細(xì)胞老化、基因轉(zhuǎn)染和細(xì)胞的黏附特性等方面沒(méi)有明顯的差別。因此，ADSCs作為軟骨組織工程的種子細(xì)胞，具有不可多得的優(yōu)勢(shì)和前景。
作為臨床應(yīng)用，構(gòu)建組織工程軟骨往往需要大量的種子細(xì)胞，有研究表明當(dāng)細(xì)胞數(shù)量少于1×107/ml時(shí)就不能形成軟骨或生成很少［6］。傳統(tǒng)的培養(yǎng)方式不僅擴(kuò)增速度慢，而且不容易維持干細(xì)胞誘導(dǎo)后的表現(xiàn)；在三維培養(yǎng)條件下則有利于ADSCs向軟骨方向分化，并促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成［7］；而動(dòng)態(tài)三維立體培養(yǎng)則進(jìn)一步提高了組織工程軟骨的生物化學(xué)功能和生物力學(xué)功能。
微載體細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是一種微載體與生物反應(yīng)器結(jié)合的技術(shù)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域。在動(dòng)態(tài)培養(yǎng)過(guò)程中，外部流體力學(xué)刺激能夠明顯增加細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞DNA的合成，利用生物反應(yīng)器和微載體進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)增，細(xì)胞濃度最高可達(dá)到1×108/ml［8，9］。這在常規(guī)培養(yǎng)條件下是很難達(dá)到的。這首先是由于微載體有較大的表面積(Cytodex 3 110 g提供約4600 cm2的表面積)［2，5］，相同容積的生物反應(yīng)器和普通培養(yǎng)瓶相比，前者可比后者多培養(yǎng)數(shù)10倍甚至100倍的細(xì)胞，可以滿足較大體積組織構(gòu)建對(duì)種子細(xì)胞數(shù)量的需求；其次因?yàn)檎麄€(gè)培養(yǎng)容器由電機(jī)驅(qū)動(dòng)沿水平軸旋轉(zhuǎn)，培養(yǎng)基以及細(xì)胞顆粒隨容器一起旋轉(zhuǎn)，細(xì)胞微載體顆粒在水平軸內(nèi)建立均質(zhì)的液體懸浮軌道，使細(xì)胞所受到的重力、浮力及剪切力達(dá)到平衡，這就構(gòu)成了一種微重力培養(yǎng)環(huán)境，利于細(xì)胞聚集，并在微載體表面各個(gè)方向上均衡擴(kuò)增生長(zhǎng)；最后一點(diǎn)在這種動(dòng)態(tài)環(huán)境中，細(xì)胞與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)易于均質(zhì)分布，顯著改善微環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及代謝產(chǎn)物的交換，保持培養(yǎng)環(huán)境的均一性和穩(wěn)定性，有效促進(jìn)了細(xì)胞的增殖。
組織構(gòu)建的另一個(gè)難題是怎樣保持其誘導(dǎo)表型，不發(fā)生去分化。生物反應(yīng)器和微載體介導(dǎo)的動(dòng)態(tài)三維培養(yǎng)，不但為細(xì)胞增殖提供了良好的環(huán)境，而且周期性的力學(xué)刺激作為一種必要的物理信號(hào)在細(xì)胞的分化過(guò)程中起到了重要的作用。在動(dòng)態(tài)環(huán)境中細(xì)胞活性增強(qiáng)，加之誘導(dǎo)因子的作用，使得大量蛋白合成分泌，形成特異的細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)了細(xì)胞的分化和成熟。總之，這種動(dòng)態(tài)培養(yǎng)微環(huán)境提供了細(xì)胞聚集、快速三維生長(zhǎng)和分化的條件，為工程化組織構(gòu)建提供了更為有效的手段［10］。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)中ADSCs在微載體上能夠迅速貼附、伸展并快速增殖。第7 d細(xì)胞已將微載體表面完全覆蓋，并凸出微載體表面生長(zhǎng)，微載體間相互連接，呈團(tuán)狀生長(zhǎng)。微載體培養(yǎng)在1周的時(shí)間內(nèi)細(xì)胞數(shù)量增長(zhǎng)了近20倍，而靜態(tài)培養(yǎng)則僅為6倍，組織化學(xué)及免疫組織化學(xué)均顯示微載體培養(yǎng)的細(xì)胞有較好的表型及細(xì)胞外基質(zhì)。本研究為以ADCSs作為種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程軟骨提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為進(jìn)行更加深入的研究奠定了基礎(chǔ)。
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【關(guān)鍵詞】 人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶 端粒酶 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 基因
Abstract：［Objective］To explicate whether the telomerase activity is regulated by human telomerase reverse transcriptase (hTERT) in human bone marrow mesenchyme stem cells(hBMSC).［Method］hBMSC were cultured and transfected with eukaryotic expressing plasmid pCIneohTERT encoding hTERT. After selection with G418 to stabilize the transfection，expression of hTERT mRNA was detected with TRPCR， detecting the expression of hTERT protein was detected with Western Bolt， and the telomerase activity in untransfected and transfected cells were detected by RTPCR.［Result］The hMSCs grew well after transfecting plasmid pCIneohTERT.The cells began to suspend and die after the day of the G418 selection. At the tenth day，all the untransfected cells were dead， but the transfected cells began to clone proliferation. So the density of G418 subdued to 100 μg/ml for maintaining selecting， at the twentieth day，there were obvious antiG418 cell clones. After stable transfection， hTERT was expressed at mRNA and protein level in these anti418 cell clones， and meanwhile telomerase activity was positive and obviously raise up in these transfected cells.［Conclusion］In human' bone marrow mesenchyme cells，telomerase could be activated by exogenous hTERT. This is a foundation to establish immortalized human bone marrow mesenchyme stem cell line.
Key words：hTERT; telomerase; human bone marrow mesenchyme stem cell; gene
髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone marrow mesenchyme stem cell，hBMSC)目前作為組織工程的種子細(xì)胞，在基礎(chǔ)研究與臨床中得到廣泛應(yīng)用。但是也存在許多問(wèn)題［1～3］，在基礎(chǔ)研究中存在如何得到純化，甚至標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞系，使各實(shí)驗(yàn)室之間以及實(shí)驗(yàn)室前后研究之間具有可比性和延續(xù)性的問(wèn)題；在臨床生物工程應(yīng)用中存在細(xì)胞老化、去分化，以及生物工程化器官過(guò)程中，如何獲得足夠數(shù)量的種子細(xì)胞的問(wèn)題［3］。
細(xì)胞培養(yǎng)廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、臨床實(shí)踐和生物工程［4］。然而，正常組織來(lái)源的細(xì)胞在通常的體外培養(yǎng)條件下經(jīng)過(guò)有限次的傳代后，就會(huì)停止分裂增殖，發(fā)生衰老和死亡［5］，這就限制了細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的進(jìn)一步應(yīng)用。因此，學(xué)者們提出建立永生化細(xì)胞系，使體外培養(yǎng)的細(xì)胞具有無(wú)限增殖能力。
研究表明，端粒酶的激活可以延緩細(xì)胞的衰老，甚至使細(xì)胞永生化［6，7］。TERT作為端粒酶的逆轉(zhuǎn)錄酶，與細(xì)胞端粒酶的活性高低密切相關(guān)［8］。本實(shí)驗(yàn)將外源性人TERT(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)基因轉(zhuǎn)染至克隆培養(yǎng)的hBMSC中，以明確hTERT能否調(diào)控其端粒酶活性，為建立永生化人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞系奠定基礎(chǔ)。
1 材料和方法
1.1 主要試劑與材料
LDMEM低糖培養(yǎng)基，胰酶，限制性內(nèi)切酶EcoRI、SalI，Midi質(zhì)粒純化試劑盒，G418：均為美國(guó)Gibco BRL公司產(chǎn)品；胎牛血清為美國(guó)Hyclone公司產(chǎn)品；LipofectAMINE 2000轉(zhuǎn)染試劑盒：美國(guó)Invitrogen公司；端粒酶活性檢測(cè)試劑盒：華美生物工程公司；質(zhì)粒pCIneohTERT(hTERT基因克隆至真核表達(dá)載體pCIneo，酶切位點(diǎn)EcoRI和SalI)美國(guó)學(xué)者Weinberg RA惠贈(zèng)。
1.2 方法
1.2.1 質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增、純化和鑒定 挑取生長(zhǎng)良好的大腸桿菌DH5α單菌落制備為感受態(tài)細(xì)胞，取50 μl感受態(tài)細(xì)胞，加2 μl質(zhì)粒pCIneohTERT溶液進(jìn)行細(xì)菌轉(zhuǎn)化，過(guò)夜后挑取單菌落，接種于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液進(jìn)行質(zhì)粒的擴(kuò)增，按試劑盒說(shuō)明書(shū)提取并純化質(zhì)粒。核酸蛋白分析儀進(jìn)行濃度和純度的測(cè)定后，取10 μl質(zhì)粒以EcoRI和SalI雙酶切(各0.5 μl)，1％瓊脂糖電泳進(jìn)行鑒定，其余置-20°保存待用。
1.2.2 細(xì)菌培養(yǎng)和基因轉(zhuǎn)染 原代單克隆培養(yǎng)的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞［9］接種于24孔板，每孔約2×105個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)到90％時(shí)，按LipofectAMINE 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行pCIneohTERT的轉(zhuǎn)染。24 h后1∶10傳代，次日加G418，濃度為200 μg／ml。經(jīng)過(guò)9～10 d，未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞在G418作用下全部死亡，此時(shí)將G418濃度降為100 μg／ml，繼續(xù)培養(yǎng)，20 d左右出現(xiàn)明顯細(xì)胞抗性克隆。在顯微鏡下用含胰酶的10 μl移液槍轉(zhuǎn)移至24孔板擴(kuò)大培養(yǎng)。取轉(zhuǎn)染前及轉(zhuǎn)染后第10、25代細(xì)胞進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。
1.2.3 hTERT mRNA的表達(dá) 用Trizol裂解沉淀細(xì)胞后，提取總mRNA。根據(jù)hTERT的mRNA序列(Gene Bank)和參考文獻(xiàn)［10，11］， 設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增的兩條引物：上游5'-GACACACATTCCACAGGTCG-3’和下游5'-GACTCGACACCGTGTCACCTAC-3'，預(yù)期產(chǎn)物片段為175 bp。采用Titan TM One Tube RT-PCR Kit進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)hTERT mRNA的表達(dá)。RT-PCR參數(shù)為：50° 30 min；94° 10 s，60° 30 s，68° 45 s，10個(gè)循環(huán)；94° 10 s，60° 30 s，68° 2 min，25個(gè)循環(huán)；68°，7 min。
1.2.4 hTERT蛋白的表達(dá) 參照文獻(xiàn)［12，13］，以三去污劑裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞內(nèi)總蛋白，經(jīng)核酸蛋白分析儀定量后，每孔上樣量為50 μg，進(jìn)行hTERT的Western Blot分析。采用Western Blotting Luminol Reagent測(cè)試劑盒顯色。同時(shí)，取細(xì)胞爬片，多聚甲醛固定后，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色，免疫熒光顯色。
1.2.5 端粒酶活性的檢測(cè) 按端粒酶活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。收集2×106個(gè)細(xì)胞，洗滌離心后裂解，冰浴30 min，離心后上清即含細(xì)胞端粒酶。取2 μl進(jìn)行RTPCR擴(kuò)增端粒酶重復(fù)序列。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)雜交反應(yīng)后顯色，測(cè)定波長(zhǎng)450 nm處的吸光度A值，反映細(xì)胞端粒酶活性。其中陽(yáng)性對(duì)照：人胚腎轉(zhuǎn)化細(xì)胞系293細(xì)胞；陰性對(duì)照：65°處理293細(xì)胞30 min。陰性對(duì)照A值低于0.05時(shí)按0.05計(jì)算，高于0.05時(shí)按實(shí)際值計(jì)算，樣本大于陰性對(duì)照A值的3倍時(shí)，判為端粒酶活性陽(yáng)性。
2 結(jié) 果
2.1 質(zhì)粒擴(kuò)增和酶切鑒定
質(zhì)粒pCIneohTERT經(jīng)試劑盒提取純化后，核酸蛋白分析儀分析表明：A260／A280和A260／A230的比值分別為1.80和2.12，說(shuō)明提純質(zhì)粒好，基本無(wú)蛋白、RNA及酚的污染，可用于基因轉(zhuǎn)染；濃度為0.55 μg／ μl。采用EcoRI和SalI雙酶切后電泳如圖1所示，酶切片段與預(yù)期大小一致，表明質(zhì)粒無(wú)誤。
圖1 pCIneohTERT酶切鑒定(M:2kb Marker，D：酶切，P:質(zhì)粒)
2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和基因轉(zhuǎn)染
細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCIneohTERT后，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。加G418后第2 d，細(xì)胞開(kāi)始懸浮，逐漸死亡。第10 d，未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞在G418作用下全部死亡，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞開(kāi)始克隆增殖。G418濃度降至100 μg／ml維持篩選，20 d左右開(kāi)始出現(xiàn)明顯抗G418細(xì)胞克隆(圖2)，用移液槍轉(zhuǎn)移，擴(kuò)大培養(yǎng)。
圖2 轉(zhuǎn)染后BMSCs的G418抗性克隆形成17 d觀察
2.3 hTERT mRNA的表達(dá)
轉(zhuǎn)染后第10、25代細(xì)胞的總RNA經(jīng)RTPCR后可獲得約175 bp的特異性片段，表明細(xì)胞在mRNA水平上表達(dá)hTERT(圖3)。
2.4 hTERT蛋白的表達(dá)
Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染細(xì)胞在124 ku左右見(jiàn)特異性條帶，為hTERT蛋白，轉(zhuǎn)染前細(xì)胞未能檢測(cè)到該蛋白(圖4)。
細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色顯示hTERT蛋白定位于細(xì)胞核(圖5)。
圖3 RTPCR分析hTERT mRNA表達(dá)，獲175bp特異片段(P10，P25轉(zhuǎn)染傳代細(xì)胞；C：對(duì)照原代細(xì)胞) 圖4 Western Blot分析hTERT蛋白的表達(dá)(P10，P25轉(zhuǎn)染傳代細(xì)胞，C：對(duì)照原代細(xì)胞) 圖5 hTERT蛋白的表達(dá)，免疫細(xì)胞化學(xué)染色，免疫熒光×200
2.5 端粒酶活性
端粒酶檢測(cè)結(jié)果，圖6表明原代BMSC仍然存在一定端粒酶活性，但是活性較低。轉(zhuǎn)染后BMSCs端粒酶活性轉(zhuǎn)為陽(yáng)性，并且持續(xù)保持陽(yáng)性表達(dá)，其活性可達(dá)到人胚腎細(xì)胞系的水平。
圖6 端粒酶活性比較
3 討 論
端粒是真核細(xì)胞染色體末端富含G的DNA重復(fù)序列，由DNA及其相關(guān)蛋白組成，雖不含基因，但是在穩(wěn)定染色體方面具有重要作用［14，15］。端粒酶是一種能延長(zhǎng)端粒末端的核酸蛋白酶，由蛋白質(zhì)和RNA組成，可以以其自身的內(nèi)源性RNA為模板，發(fā)揮RNA指導(dǎo)的DNA合成作用，向端粒末端添加(TTAGGG)n序列，使端粒延長(zhǎng)，從而延長(zhǎng)細(xì)胞的壽命。正常情況下，除了一些生殖細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞表達(dá)端粒酶活性以外，其他體細(xì)胞都不表達(dá)端粒酶活性［6］。現(xiàn)在已經(jīng)明確人端粒酶由3個(gè)部分組成［17］:(1)端粒酶自身的RNA模板：端粒酶以自身RNA為模板，以端粒的3'-overhang為引物，在端粒的末端加上新的重復(fù)序列，使端粒延長(zhǎng)。在多種人體正常組織中均有人端粒酶RNA的表達(dá)；（2)人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)：是端粒酶的活性部位。Meyerson等［18］克隆出人的編碼端粒酶催化亞基的cDNA，hTERT mRNA在大多數(shù)缺乏端粒酶活性的正常體細(xì)胞中不能檢測(cè)到；（3)端粒酶的相關(guān)蛋白：TP1／TLP1基因編碼端粒酶的相關(guān)蛋白，和端粒酶的活性沒(méi)有必然的聯(lián)系，具體功能尚不清楚。上述3個(gè)組成部分中hTERT是恢復(fù)端粒酶活性的關(guān)鍵。然而，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)hTERTmRNA在組織分布上與端粒酶活性并不完全一致［19］，而且端粒酶的組成和結(jié)構(gòu)至今尚未完全明確。另外，端粒酶活性受到復(fù)雜機(jī)制的調(diào)節(jié)，在不同層次上存在各種調(diào)節(jié)因素，如端粒長(zhǎng)度變化、端粒酶RNA和蛋白組分、癌基因和抑癌基因、細(xì)胞分化和細(xì)胞周期等。所以，目前還不能斷定hTERT與端粒酶激活的必然聯(lián)系，即并不是每一種細(xì)胞轉(zhuǎn)染hTERT基因均可激活該細(xì)胞的端粒酶活性。
為了明確在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中導(dǎo)入外源性hTERT能否調(diào)控端粒酶活性，作者克隆培養(yǎng)hBMSC［9］，導(dǎo)入克隆至真核表達(dá)載體pCIneo的hTERT基因。G418篩選20d后形成抗性細(xì)胞克隆，移液槍轉(zhuǎn)移，擴(kuò)大培養(yǎng)，細(xì)胞端粒酶活性轉(zhuǎn)為陽(yáng)性。因此，作者認(rèn)為在hBMSC中，導(dǎo)入外源性hTERT可以激活端粒酶，其活性可達(dá)到人胚腎細(xì)胞系的水平。
目前，有關(guān)端粒和端粒酶的研究主要集中在腫瘤的基因治療上［20］，抑制端粒酶活性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。借用這一思路，反之，構(gòu)建hTERT真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的細(xì)胞，使細(xì)胞在體外培養(yǎng)的生命期延長(zhǎng)，用于構(gòu)建組織工程化標(biāo)準(zhǔn)種子細(xì)胞系，可能是解決體外培養(yǎng)細(xì)胞增殖困難、傳代時(shí)間短、細(xì)胞衰老的方法之一，且hTERT真核表達(dá)質(zhì)粒較病毒載體的安全性更高。以往研究結(jié)果表明［10，11］，將編碼hTERT的基因轉(zhuǎn)染到正常人成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，可以使正常人體細(xì)胞突破“Hayfliek極限”，細(xì)胞壽命得以延長(zhǎng)，細(xì)胞可在體外長(zhǎng)期傳代，無(wú)致瘤性，細(xì)胞仍保持正常的形態(tài)和功能。
實(shí)驗(yàn)表明，用脂質(zhì)體法將構(gòu)建的hTERT真核表達(dá)質(zhì)粒pCIneohTERT體外轉(zhuǎn)染人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞端粒酶活性明顯提高，為進(jìn)一步建立人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系奠定了基礎(chǔ)。
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【關(guān)鍵詞】 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；生物學(xué)特性；細(xì)胞培養(yǎng)
The Biological Characteristics and Culture in Vitro of Rabbit Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells
〔Abstract〕 ObjectiveTo further study the isolation and cultivation procedures of mesenchymal stem cells from rabbit in vitro， and explore their biological properties. To build an experimental basis on applying MSCs as seed cells to treat many diseases. Methods
MSCs were obtained from tibias by density gradient centrifugation and were tested the rate of adhesion. The configuration was observed under phase-contrast microscope consecutively and the cell growth was measured by MTT method. Cell cycle and surface antigens were detected through flow cytometer. Results The subcultured cells showed active proliferative ability. More than 95% of subceltured MSCs were adhesive in 12 h. MSCs were positive for CD29， CD44， CD105 and negative for CD34.
Conclusion
In present culture condion， MSCs showed stable and rapid
growth in vitro . The characteristics make it possible to MSCs to be the seed cells for tissue engineering.
〔Key Words〕
Mesenchymal stem cells; Biological characteristics; Cell culture
干細(xì)胞是具有自我更新能力，且在適宜微環(huán)境下具有多系分化潛能的原始細(xì)胞[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體內(nèi)除胚胎干細(xì)胞外還存在具有自我更新和分化能力的成體干細(xì)胞。其中骨髓中的干/粒細(xì)胞包括間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells， MSCs），造血干細(xì)胞及網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)。 MSCs 可在體外擴(kuò)增并有多向分化潛能[2-4]， 且取材方便，免疫耐受性、遺傳背景穩(wěn)定及易于轉(zhuǎn)染外源基因等，因而作為組織工程“種子細(xì)胞”有“廣泛的應(yīng)用前景”[5-8]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)兔 MSCs 體外培養(yǎng)法及其生物學(xué)特性進(jìn)行研究，以建立一套穩(wěn)定、成熟的兔 MSCs 培養(yǎng)方法，從而為細(xì)胞移植等組織工程提供種子細(xì)胞來(lái)源提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
1
材料及方法
1.1
主要試劑與儀器
低糖 DMEM 培養(yǎng)基（GIBICO 公司）、10% 胎牛血清（Hyclone 公司）、0.125% 胰蛋白酶（Sigma 公司）、Ficoll 淋巴細(xì)胞分離液（上海華精生物高科技有限公司，比重 1.077 g/mL）、CD29、CD34、CD44、CD105 單克隆抗體和 FITC 標(biāo)記的二抗（Lab vision）、MTT（沃宏公司）、倒置相差顯微鏡（OLYMPUS）、細(xì)胞培養(yǎng)箱（Forma）、流式細(xì)胞儀（FACSCalibur， BECTON DICKINSON 公司，美國(guó)）及超凈工作臺(tái)（ESCO）等。
1.2
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
普通級(jí)健康新西蘭大耳白兔，雌性，兔齡約 3 個(gè)月（南京市第一醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)：SCXK [蘇] 2002-2007）。
1.3
方法
1.3.1
骨髓 MSCs 的分離純化與培養(yǎng)
兔仰臥固定于兔臺(tái)上，予 2% 利多卡因局麻后，持 16 號(hào)骨穿針，沿脛骨平臺(tái)垂直刺入骨髓腔，外接肝素（3 000 U，0.2 mL）潤(rùn)洗過(guò)的 10 mL 無(wú)菌注射器，抽取骨髓 4 mL，緩慢疊于等量 Ficoll 淋巴細(xì)胞分離液（密度 1.077 g/mL）上，以 2 000 r/min 的速度離心 20 min，分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞，收集界面上的細(xì)胞，移入另一離心管，PBS 洗滌，2 000 r/min 離心 5 min，反復(fù) 2 次，棄上清，懸浮于含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基（青霉素 100 U/mL，鏈霉素 100 U/mL），輕輕吹打均勻，接種到 25 cm2 培養(yǎng)瓶，置 37℃，5% CO2 及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4~6 d 首次換液，以后每 3 d 或 4 d 換液 1 次，14~21 d 細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá) 80% 以上，以 0.125% 胰蛋白酶消化，按 1:2 比例傳代培養(yǎng)，倒置顯微鏡下逐日觀察細(xì)胞形態(tài)。
1.3.2
骨髓 MSC 貼壁率檢測(cè)
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，0.125% 胰蛋白酶消化制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為 1×105/mL，接種于 24 孔培養(yǎng)板，每次孔 1 mL，每 2 h 取出培養(yǎng)板，吸去 4 孔培養(yǎng)液，0.1 mol/L PBS 漂洗除去未貼壁細(xì)胞，0.125% 胰蛋白酶消化后離心收集細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，共觀察 12 h，按以下公式逐個(gè)計(jì)算每個(gè)時(shí)相點(diǎn)的貼壁率：貼壁率=（貼壁細(xì)胞總數(shù)/接種細(xì)胞總數(shù)）×100%。
1.3.3
骨髓 MSCs 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定
取第 3 代生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，用 0.125% 胰蛋白酶消化后用含 10% FBS 的 DMEM 制備細(xì)胞懸液，以每孔 103~104 個(gè)細(xì)胞于不同時(shí)相分別接種于 8 塊 96 孔板中的 8 孔，每孔體積 200 L，置于 37℃、5% CO2 及飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育。于第 2 天起行 MTT 比色法，每孔加入 MTT 溶液（5 mg/mL）20 L，37℃ 繼續(xù)孵育 4 h 后，每孔加入 150 L 二甲基亞砜，振蕩 10 min 后選擇 490 nm 波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值，以時(shí)間為橫軸，光吸收值 A（OD）為縱軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
1.3.4
骨髓 MSCs 表面標(biāo)記測(cè)定
取第 3 代MSCs，用 0.125% 胰蛋白酶消化，2 000 r/min 離心 5 min，PBS 洗滌 2 次，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為 1×106/mL，分為 4 份，分別滴加人抗兔 CD29、CD34、CD44、CD105 一抗（以 PBS 代替一抗作為陰性對(duì)照），室溫反應(yīng) 30 min 后，PBS 洗滌 2 次，滴加 FITC 標(biāo)記的抗兔 IgG，避光反應(yīng) 15 min 后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面 CD29、CD34、CD44、CD105 陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)。
2
結(jié)
果
2.1
MSCs 的形態(tài)學(xué)變化
原代培養(yǎng)中，可見(jiàn)細(xì)胞以分散、克隆集落方式增殖；第 1~3 天細(xì)胞大部分呈圓形、橢圓形生長(zhǎng)；第 3~7 天貼壁細(xì)胞增多，并逐漸延展生長(zhǎng)為多角形、星形或梭形； 7~21 d 貼壁細(xì)胞明顯增多，并有集落形成，相鄰集落融合成片達(dá) 80% 以上，細(xì)胞排列呈漩渦狀，細(xì)胞間界限不清，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形；14~21 d 后，細(xì)胞傳代，傳代后的細(xì)胞不以集落方式生長(zhǎng)，而是均勻分布長(zhǎng)梭形細(xì)胞。
2.2
MSCs 各時(shí)相點(diǎn)細(xì)胞帖壁率
見(jiàn)表 1。
2.3
MSCs 生長(zhǎng)曲線分析
實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞傳代培養(yǎng) 1~2 d，吸光度變化不大，甚至有輕微下降，細(xì)胞處于潛伏期，第 3 天起呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，至第 7 天到達(dá)高峰，之后進(jìn)入平臺(tái)期，見(jiàn)圖 2。
根據(jù)計(jì)算細(xì)胞的倍增時(shí)間公式可得：
DT = t ×〔lg2/（lgNt-lgNo）〕= 96 ×〔0.301/ （-0.060+1）〕= 30.8 h
2.4
MSCs 表面標(biāo)記
流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示：CD34、CD45 陽(yáng)性細(xì)胞均為 0.8%；CD29 和 Cd105 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為 99.8%。說(shuō)明分享獲得的細(xì)胞符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的特點(diǎn)（見(jiàn)圖 3）。
3
討
論
MSCs 體外培養(yǎng)的生長(zhǎng)特點(diǎn)和生物學(xué)特性已有較多相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。MSCs 在骨髓中的含量極少，約占有核細(xì)胞的 0.001%~0.01%[9]，如何獲得高純度、足量的 MSCs，成為 MSCs 應(yīng)用研究的關(guān)鍵。
目前常用于 MSCs 分離方法有密度梯度離心法[10-11]、貼壁篩選法[12]、免疫磁珠法[13]、流式細(xì)胞儀分離法[14]及 Hung 等[15]研究的特制微孔培養(yǎng)板篩選法。采用全骨髓貼壁篩選法，將抽取的骨髓直接置于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)的特性分離細(xì)胞，幾天后換液觀察細(xì)胞貼壁情況，這種保留造血干細(xì)胞和各種細(xì)胞混合培養(yǎng)的方法，由于維持了 MSCs 原始的生活環(huán)境，有利于 MSCs 分化，但所得細(xì)胞成分復(fù)雜， MSCs 純度不足。單克隆抗體磁珠分離系統(tǒng)或流式細(xì)胞儀技術(shù)對(duì)細(xì)胞活性影響較大，甚至導(dǎo)致細(xì)胞完全失去活性，而且實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜，需要骨髓量大，不易重復(fù)，造價(jià)較高，一般僅限于在大實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用[16]。特制微孔培養(yǎng)板篩選法，可以快速有效分離得到相對(duì)同質(zhì)的 MSCs，利用這種方法可以不用 Percoll 液去除紅細(xì)胞[17]，但是結(jié)果不穩(wěn)定，特定原料不易大量獲取。密度梯度離心法即根據(jù)骨髓中細(xì)胞成分比重的不同，利用Percoll 或淋巴細(xì)胞分離液提取單核細(xì)胞進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。操作上較貼壁細(xì)胞分離法煩瑣，得到的細(xì)胞數(shù)不如后者多，但細(xì)胞純度較后者高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合密度梯度離心法和貼壁篩選法，利用密度為 1.077 g/L 的 Ficoll 分離液，能有效去除絕大部分紅細(xì)胞、粒細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和血小板，獲得純度較高的單個(gè)核細(xì)胞。然后利用 MSCs 的貼壁性，逐漸棄掉未貼壁細(xì)胞，從而獲得足量的 MSCs。
在培養(yǎng)過(guò)程中，我們還注意到以下幾個(gè)環(huán)節(jié)：①與蔣雯等[18]不同，本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，兔 MSCs 原代培養(yǎng)首次換液的時(shí)間宜在 4~6 d，過(guò)早換液將丟失過(guò)多尚未貼壁細(xì)胞，因在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，第 3 天首次換液后，收集舊培養(yǎng)液離心洗滌，再接種仍有細(xì)胞大量生長(zhǎng)；且原代細(xì)胞在培養(yǎng) 14 d~21 d 左右才能達(dá)到80% 以上的融合，才能進(jìn)行傳代培養(yǎng)，這可能與我們用的培養(yǎng)基加的胎牛血清濃度不同，蔣雯等用的是 20% 的血清，而我們用的是 10% 的胎牛血清；②培養(yǎng)基中胎牛血清濃度保持在 10% 左右為宜，過(guò)低由于缺乏生長(zhǎng)因子的刺激，細(xì)胞增殖減慢，而過(guò)高又因含大量促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖分化的因子，易引起細(xì)胞過(guò)早出現(xiàn)老化；③兔 MSCs 原代接種貼壁不良時(shí)，可予膠原[19]包被培養(yǎng)瓶，增加細(xì)胞的貼壁率；④胰蛋白酶消化細(xì)胞時(shí)，可先將 PBS 潤(rùn)洗培養(yǎng)瓶 2 次，去除殘留血清，更易將貼壁細(xì)胞消化下來(lái)，且消化時(shí)間縮短，不會(huì)造成消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)對(duì)細(xì)胞的損傷；⑤細(xì)胞傳代時(shí)，應(yīng)注意接種密度，宜按 1:2 比例傳代接種，如此細(xì)胞才能保持良好的增長(zhǎng)趨勢(shì)，不會(huì)因接種密度過(guò)稀致增長(zhǎng)緩慢且易老化。
目前 MSCs 在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，然而 MSCs 表面標(biāo)志由于細(xì)胞分離、培養(yǎng)方法和培養(yǎng)時(shí)間等的不同而有差異。Pittenger 等[20]認(rèn)為人MSCs 陽(yáng)性表面標(biāo)志是 SH2（CD105）、SH3、SH4、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD124，陰性表面標(biāo)志是 CD45、CD34 和 CD14 等造血細(xì)胞標(biāo)志。Hung 等[21]采用帶 3 m 孔培養(yǎng)板的裝置培養(yǎng)分離得到人 MSC，培養(yǎng)至第 2 代末時(shí)陽(yáng)性表面標(biāo)志是 CD90、CD44、CD29、CD51，陰性表面標(biāo)志是 CD45、CD34、CD7、AC133 等。研究者們應(yīng)用不同的分離擴(kuò)增方法及不同的方式表達(dá)細(xì)胞特性，使得對(duì)一些研究結(jié)果的比較變得困難，阻礙了其在這些領(lǐng)域的應(yīng)用[22]。因此在 2005 年，ISCT（the International Society for Cellular Therapy）定義了 MSCs 的最低標(biāo)準(zhǔn)： 首先，MSCs 在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下必須具備貼壁生長(zhǎng)的特點(diǎn)；其次，MSCs 表達(dá) CD105、CD73 和 CD90，而 CD45、CD34、CD14 或 CD11b、CD79a、或 CD19 及 HLA-DR 表面分子表達(dá)陰性；第三，MSC 在體外能分化為格根包爾氏細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞[23]。本實(shí)驗(yàn)選擇第 3 代細(xì)胞行流式細(xì)胞儀檢測(cè)表面抗原顯示，陽(yáng)性表達(dá)黏附分子、整合素家族成員等如細(xì)胞表面抗原 CD29、CD44、CD105 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占 99.8%，而造血細(xì)胞表面標(biāo)志陰性或極少表達(dá)即 CD34 陽(yáng)性率只有 0.8%，上述結(jié)果表明：獲得的細(xì)胞為非造血類的、符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的特點(diǎn)，與文獻(xiàn)資料吻合[12，24]。
通過(guò)對(duì)兔MSCs 培養(yǎng)方法和表面標(biāo)識(shí)物的進(jìn)一步研究，本研究建立了一套穩(wěn)定分離、培養(yǎng)擴(kuò)增骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，獲得足量純化的 MSCs 并進(jìn)而研究其作為種子細(xì)胞治療多種疾病提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。隨著基因工程和組織工程的發(fā)展，骨髓 MSCs 也將在細(xì)胞治療、基因治療等方面得到廣泛應(yīng)用。本研究設(shè)計(jì)的缺陷在于，這只是細(xì)胞培養(yǎng)的一個(gè)初步研究，下一步若對(duì)細(xì)胞周期及細(xì)胞活力進(jìn)行檢測(cè)，將對(duì)選擇最合適代數(shù)細(xì)胞作為種子細(xì)胞的應(yīng)用提供更有價(jià)值的信息。
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[摘要]目的：探討人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF165)基因轉(zhuǎn)染大鼠脂肪干細(xì)胞(rADSCs)的穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)對(duì)皮瓣成活的影響。方法：①培養(yǎng)和鑒定大鼠ADSCs，脂質(zhì)體介導(dǎo)pcDNA3．1－VEGF165質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠(rADSCs)，經(jīng)G418篩選抗性rADSCs并繼續(xù)培養(yǎng)4周，用ELISA法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF濃度。②Brdu標(biāo)記被轉(zhuǎn)染rADSCs后，在大鼠背部制備8．0cm×2．5cm的隨意型皮模型，實(shí)驗(yàn)組(10只大鼠)為注射pcDNA3．1-VEGF165質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的rADSCs懸液到大鼠腹腔，對(duì)照組(8只大鼠)為注射2ml被空載體pcDNA3．1(一)轉(zhuǎn)染的rADSCs懸液，術(shù)后7天用透明紙描記法記錄皮瓣成活范圍，記數(shù)坐標(biāo)紙格子并換算為成活面積百分率。分別于術(shù)后3天、5天、7天在成活皮瓣的遠(yuǎn)端切取皮瓣組織標(biāo)本行免疫組化染色。結(jié)果：①ELISA檢測(cè)4株轉(zhuǎn)染和經(jīng)G418篩選抗性并繼續(xù)培養(yǎng)2周的第二代rADSCs上清中VEGF濃度多達(dá)(4．21±0．35)pmol VEGF／1×106細(xì)胞／48h(x±s，n=4)，有2株細(xì)胞培養(yǎng)液上清分泌VEGF較強(qiáng)，其余2株細(xì)胞相對(duì)較弱，均大于對(duì)照的空載體轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組rADSCs培養(yǎng)液上清中的(0．49±0．15)pmol VEGF／1×106細(xì)胞／48h(x±s，n=3)和(0．61±0．86)pmol VEGF／1×106細(xì)胞／48h(x±s，n=3)，均P
[關(guān)鍵詞]成體干細(xì)胞；基因治療；隨意型皮瓣
[中圖分類號(hào)]Q789 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008―6455(2007)01-0007-04
皮瓣是用于修復(fù)較大的組織缺損和外露臟器的帶血供的皮膚軟組織，但是在轉(zhuǎn)移手術(shù)后皮瓣經(jīng)常發(fā)生血運(yùn)障礙。研究表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)可以促進(jìn)血管的新生，從而提高缺血皮瓣的成活面積。成體干細(xì)胞載體可以治療多種疾病。研究表明，MSC等成體干細(xì)胞可以作為中樞神經(jīng)性疾病等多種疾病的基因治療載體，例如MSC可以作為VEGF、FGF等多種細(xì)胞因子基因治療的載體，并通過(guò)旁分泌作用釋放VEGF促進(jìn)側(cè)支循環(huán)的建立和血管的再生，而MSC自身則不參與缺血組織的治療。目前ADSCs作為基因治療載體的報(bào)道較少見(jiàn)，本研究旨在闡明脂肪干細(xì)胞可以作為運(yùn)送VEGF基因到達(dá)皮瓣的細(xì)胞載體并通過(guò)旁分泌VEGF提高皮瓣的成活面積。
1 材料和方法
1．1材料：3周齡SD大鼠18只(雌雄不限)、Lipo-fectamineTM2000(美國(guó)Sigma公司)、pcDNA3．1-VEGF165質(zhì)粒(本室構(gòu)建并保存)、DMEME(Dul―beccos modified eagle balancedsalt solution)培養(yǎng)基、0．1％Ⅰ型膠原酶(美國(guó)Worthington公司)、CD49天抗體(北京中山生物技術(shù)公司)、恒溫CO2培養(yǎng)箱、臺(tái)式離心機(jī)(LingLi公司)、Calibur型四色流式細(xì)胞儀(美國(guó)Becton Dickinson)、DMIRB型倒置相差顯微鏡(德國(guó)Leica公司)。
1．2方法
1．2．1 rADSCs的分離和原代培養(yǎng)：SD大鼠麻醉后，在無(wú)菌下切取腹股溝脂肪墊，剪碎后加入0．1％Ⅰ型膠原酶消化40～60min，加入2倍體積的D-Hank’s液，離心收集沉淀并用含10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基稀釋，轉(zhuǎn)種到培養(yǎng)瓶中。
1．2．2 rADSCs的鑒定：收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第2代rADSCs，95％乙醇固定和漂洗后分別加入鼠抗鼠的CD49天單克隆抗體，4℃過(guò)夜，PBS洗掉未結(jié)合的抗體，加入異硫氰酸熒光素標(biāo)記的羊抗鼠二抗，室溫下放置30min，PBS洗掉未結(jié)合的抗體。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。同時(shí)用PBS／FBS／NANO3代替一抗作為空白對(duì)照。
1．2．3脂質(zhì)體介導(dǎo)VEGF轉(zhuǎn)染rADSCs：生長(zhǎng)到70％～80％融合的細(xì)胞，用新鮮無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基洗滌2遍。按LipofectamineTM2000操作說(shuō)明，pcDNA3．1(一)、pcDNA3．1－VEGF165質(zhì)粒分別8．0μg和LipofectamineTM2000 20μl混合，室溫靜置20min后，加入1ml不含血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃、轉(zhuǎn)染rADSCs 8h后，換成含血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，換成最小致死劑量0．5g/L的G418選擇培養(yǎng)基，抗性細(xì)胞篩選，2周后細(xì)胞克隆形成，其陽(yáng)性克隆在0．5g/L的G418維持劑量壓力下繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)2周備用。
1．2．4 ELISA檢測(cè)被轉(zhuǎn)染rADSCs上清中VEGF濃度：各組rADSCs在培養(yǎng)24h后收集培養(yǎng)上清，用ELISA試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)上清中VEGF濃度，以平均pmol／1×106細(xì)胞／48h(x±s，n＝4)表示。
1．2．5被轉(zhuǎn)染rADSCs的標(biāo)記：在傳代后的細(xì)胞培養(yǎng)液中加入新鮮配制的Brdu，終濃度5μg/m1，至細(xì)胞生長(zhǎng)到95％以上融合后備用。接種在12孔板中的rADSCs在用Brdu標(biāo)記后經(jīng)抗Brdu單抗進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，隨機(jī)觀察5個(gè)視野并計(jì)數(shù)。
1．2．6動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：消化收集標(biāo)記Brdu的rADSCs并臺(tái)盼藍(lán)染色記數(shù)為1×1077／ml，用D-Hank’s液反復(fù)3次洗滌，制成2ml的rADSCs的單細(xì)胞懸液用于注射動(dòng)物模型。在大鼠背部一側(cè)制備直徑8×2．5cm的背部隨意型皮瓣模型，掀起皮后保留皮下的肉膜。實(shí)驗(yàn)組有10只大鼠，在每只大鼠腹腔內(nèi)注射2ml被轉(zhuǎn)染的rADSCs單細(xì)胞懸液，對(duì)照組有8只大鼠，在每只大鼠腹腔內(nèi)注射2ml被空載體pcDNA3．1(一)轉(zhuǎn)染的rADSCs單細(xì)胞懸液。分別于術(shù)后7天用透明紙描記法記錄皮瓣成活范圍，用數(shù)坐標(biāo)紙格子數(shù)的方法計(jì)算成活面積并換算為成活百分率。術(shù)后3天在皮遠(yuǎn)端切取全層皮膚組織標(biāo)本并用4％的多聚甲醛固定1h，然后用80％到100％的系列梯度的乙醇脫水，石蠟包埋后切片，行HE染色和抗Brdu免疫組化染色。
1．2．7統(tǒng)計(jì)分析：數(shù)據(jù)用x±s表示，t檢驗(yàn)。
2 結(jié)果
2．1 rADSCs的分離和培養(yǎng)以及鑒定：原代培養(yǎng)的rADSCs在貼壁后細(xì)胞形態(tài)均一，呈梭形的單層成纖維細(xì)胞樣。流式細(xì)胞學(xué)檢查示第3代rADSCs均一性較好，CD49天陽(yáng)性率為95．3％。
2．2細(xì)胞轉(zhuǎn)染與篩選效果：經(jīng)轉(zhuǎn)染和G418篩選后，非轉(zhuǎn)染組的和pcDNA3．1(一)空載體轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞100％死亡，而pcDNA3．1－VEGFl65重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞在篩選約2周后有數(shù)量較多的細(xì)胞集落，提示克隆化基因的細(xì)胞轉(zhuǎn)染及G418篩選效果良好。
2．3 ELISA檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞上清中VEGF濃度
2．4動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中大白鼠在手術(shù)后生命體征平穩(wěn)，精神好，進(jìn)食和飲水均好。術(shù)后7天，各組皮瓣的成活面積如下(表3、圖1)，術(shù)后3天皮瓣遠(yuǎn)端皮膚組織抗Brdu免疫組化染色(圖2)。
3 討論
脂肪組織的基質(zhì)成分中含有具有自我更新和多能分化潛能的脂肪干細(xì)胞(adipose derived stemcells，ADSCs)，我們以往的研究結(jié)果表明脂肪組織可以促進(jìn)皮膚創(chuàng)面的愈合。由于脂肪組織來(lái)源廣泛，取材方便，可以獲得的基質(zhì)細(xì)胞數(shù)量大，所以可以作為替換MSC來(lái)源的成體干細(xì)胞。ADSCs和MSC之間CD標(biāo)記的區(qū)別是ADSCs表達(dá)CD49天，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)流式細(xì)胞學(xué)對(duì)培養(yǎng)的rADSCs表面抗原CD49天陽(yáng)性的檢測(cè)確證和鑒定了培養(yǎng)的細(xì)胞是ADSCs。
pcDNA3．1－VEGFl65重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞經(jīng)G418篩選后出現(xiàn)數(shù)量較多的細(xì)胞集落，而非轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞100％死亡，提示VEGF基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的效果和G418篩選細(xì)胞的效果都良好。ELISA檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞上清中VEGFl65濃度隨時(shí)間而升高，而非轉(zhuǎn)染組和pcDNA3．1(一)空載體轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞上清中VEGFl65濃度較低，提示VEGF165在rADSCs中有效表達(dá)，并被正確修飾，rADSCs可以作為基因治療中的載體細(xì)胞。因此，理論上可以將獲得的穩(wěn)定表達(dá)VEGF165的rADSCs移植到體內(nèi)實(shí)施基因治療。
Brdu是常用的一種標(biāo)記細(xì)胞核的熒光染料。注入到腹腔的被轉(zhuǎn)染rADSCs的Brdu標(biāo)記細(xì)胞陽(yáng)性效率可達(dá)70％以上，臺(tái)酚藍(lán)染色記數(shù)注入到腹腔rADSCs為1×107，較高的Brdu標(biāo)記率和充足的細(xì)胞數(shù)量是rADSCs在本移植實(shí)驗(yàn)研究中作為皮瓣基因治療載體細(xì)胞的前提。
隨意型皮瓣是常用于研究皮瓣成活能力的模型。本實(shí)驗(yàn)選用大鼠背部的8cm×2．5cm隨意型皮瓣模型，皮瓣遠(yuǎn)端由于超出長(zhǎng)：寬＝1：1．5的比值范圍，因而是血流供應(yīng)較少的部位，在手術(shù)后局部出現(xiàn)血流緩慢，內(nèi)皮細(xì)胞缺氧脫落和血栓形成等一系列的病理生理學(xué)改變，最終導(dǎo)致遠(yuǎn)端超出血流供應(yīng)范圍皮的缺血壞死。本研究結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組皮瓣的成活面積(59．6±0．52)％，大于對(duì)照組的皮成活面積(40．5±0．27)％，P
[關(guān)鍵詞] 起搏樣細(xì)胞；CD45；HCN4；NF-160；竇房結(jié)
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Inducing directional differentiation of mouse bone marrow CD45-cells into sinoatrial node pacemaker-like cells in vitro
WEN Yu1 LI Bin2
1.Department of Histology & Embryology， Basic Medical College of China Medical University， Liaoning Province， Shenyang 110122， China； 2.Department of Sports Medicine， Affiliated Shengjing Hospital of China Medical University， Liaoning Province， Shenyang 110022， China
[Abstract] Objective To study method on inducing directional differentiation of mouse bone marrow CD45-cells into sinoatrial node pacemaker-like cells in vitro. Methods Mouse bone marrow CD45-cells were derived by using immunomagnetic beads system. After amplification in vitro， induced medium supplemented with 5-azacytidine and culture supernatant liquid of mouse sinoatrial node cells was used to cultivate. The expression on pacemaker-like cells markers of neurofilament protein （NF-160） and hyperpolarization activated cyclic nucleotide-gated potassium channel （HCN） 4 were detected by immunofluorescence staining. The expression of pacing genes （NF-160， HCN4 and HCN2） were detected by qRT-PCR. Results Differentiated cells of bone marrow CD45-cells after induced by culture in vitro expressed NF-160 and HCN4. qRT-PCR analysis showed， compared with cultured sinoatrial node cells in vitro， the expression of NF-160 and HCN4 were higher， while expression of HCN2 was lower. Conclusion The sinoatrial node pacemaker-like cells can be induced and differentiated from mouse bone marrow CD45-cells， and the cells will be one choice of ideal seeding cells for biological pacemaker building.
[Key words] Pacemaker-like cells； CD45； HCN4； NF-160； Sinoatrial node
心律失常是常見(jiàn)病，嚴(yán)重將危及患者生命。目前，對(duì)于嚴(yán)重心律失常、病態(tài)竇房結(jié)綜合征患者，安裝心臟起搏器是理想的治療方法[1-3]。隨著生物學(xué)及干細(xì)胞研究的發(fā)展，利用其相關(guān)技術(shù)逐步構(gòu)建生物起搏器，對(duì)受損心傳導(dǎo)系統(tǒng)的組織進(jìn)行修復(fù)或替代，尤其是竇房結(jié)功能重建，可以使心臟的起搏和傳導(dǎo)功能得以修復(fù)[4-5]。構(gòu)建生物起搏器的種子細(xì)胞目前以干細(xì)胞為主[6-7]。由于骨髓源干細(xì)胞具有多向分化潛能，可自體獲得，并能夠在體外擴(kuò)增，是比較理想的種子細(xì)胞，所以本研究采用5-氮胞苷聯(lián)合竇房結(jié)細(xì)胞培養(yǎng)上清液體外誘導(dǎo)培養(yǎng)骨髓CD45-細(xì)胞，探討其分化為起搏樣細(xì)胞的可能性。研究周期為2014年8月～2015年1月，旨在為臨床因竇房結(jié)起搏細(xì)胞數(shù)量減少或功能衰退造成的心傳導(dǎo)系統(tǒng)功能障礙、嚴(yán)重心律失常等疾病的替代治療以及生物起搏技術(shù)的應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、儀器和試劑
1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取昆明小鼠10只，雌雄不限，4～5周齡，體重20～30 g，常規(guī)飼養(yǎng)，健康。
1.1.2 主要儀器和試劑 低糖DMEM和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)自Hyclone；DMEM-F12購(gòu)自Gibco；5-氮胞苷（5-azacytidine）購(gòu)自Sigma；兔源HCN4一抗、小鼠來(lái)源NF-160一抗和TRITC標(biāo)記山羊抗兔IgG購(gòu)自Abcam；FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG和DAPI購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；RNA extraction kit購(gòu)自Qiagen；PCR引物購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司；SYBR Green Real Time-PCR Master Mix購(gòu)自Invitrogen。免疫磁珠分選系統(tǒng)（Miltenyi Biotec），激光共聚焦顯微鏡（Nikon EZ-C1），PCR儀（Roche Light Cycler？R480）。
1.2 小鼠骨髓CD45-細(xì)胞純化、擴(kuò)增
隨機(jī)取5只小鼠經(jīng)2.5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，70%乙醇浸泡30 min，超凈臺(tái)無(wú)菌條件下取出小鼠股骨和脛骨數(shù)根，用低糖DMEM反復(fù)沖洗髓腔，收集沖洗液，經(jīng)400目尼龍篩網(wǎng)過(guò)濾，1000 r/min離心6 min，棄上清。采用添加了10%FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基重新混懸細(xì)胞，37℃，5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)，1 d后換液，棄去未貼壁細(xì)胞，以后每2天換液1次。細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合時(shí)，PBS洗滌2次，0.25%胰蛋白酶消化，1000 r/min離心5 min，棄上清，10%FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基重新混懸，以1∶3傳代。培養(yǎng)大約1個(gè)月后，采用免疫磁珠分選系統(tǒng)，選取CD45抗體，按照說(shuō)明書(shū)操作，使細(xì)胞通過(guò)分選柱，收集CD45-細(xì)胞。采用添加了10%FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)。
1.3 小鼠竇房結(jié)組織分離、培養(yǎng)，收集培養(yǎng)基上清液
余下5只小鼠經(jīng)2.5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，70%乙醇浸泡30 min，超凈臺(tái)無(wú)菌條件下取出心臟，解剖顯微鏡下將心臟界嵴中部靜脈竇側(cè)、前腔靜脈根部0.3 cm × 0.3 cm × 0.3 cm大小組織塊，剪成1 mm左右大小的碎塊，添加0.07%胰蛋白酶消化，經(jīng)篩網(wǎng)過(guò)濾后，1000 r/min離心5 min，加入添加了20%FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基，37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)4 h，吸出未貼壁細(xì)胞重置于6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)。每天半量換液。
1.4 條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化骨髓CD45-細(xì)胞
收集竇房結(jié)細(xì)胞培養(yǎng)后的培養(yǎng)液，經(jīng)1000 r/min離心10 min，取上清與10%FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基1∶1混合，并添加10 mmol/L的5-氮胞苷，作為CD45-細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。CD45-細(xì)胞經(jīng)條件培養(yǎng)基培養(yǎng)后2～3周，選取生長(zhǎng)穩(wěn)定細(xì)胞，進(jìn)行檢測(cè)。
1.5 免疫熒光檢測(cè)分化細(xì)胞起搏標(biāo)志物表達(dá)
將生長(zhǎng)良好的分化細(xì)胞接種至8孔Chamber中，培養(yǎng)過(guò)夜，常規(guī)免疫熒光染色，一抗兔HCN4（1∶200）、小鼠NF-160（1∶300），二抗TRITC標(biāo)記山羊抗兔IgG（1∶500），F(xiàn)ITC標(biāo)記山羊抗小鼠（1∶500）。激光共聚焦顯微鏡下觀察，拍照。
1.6 qRT-PCR檢測(cè)誘導(dǎo)分化細(xì)胞起搏基因表達(dá)
選擇生長(zhǎng)良好的分化起搏樣細(xì)胞和小鼠竇房結(jié)細(xì)胞作為對(duì)照，采用RNA extraction kit提取兩種細(xì)胞的總RNA，稀釋濃度為200 ng/μL，然后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再采用SYBR Green Real Time-PCR Master Mix方法檢測(cè)小鼠NF-160、HCN4和HCN2基因表達(dá)，選取GAPDH作為內(nèi)參，引物序列見(jiàn)表1。NF-160、HCN4和HCN2基因表達(dá)結(jié)果以倍數(shù)變化表示。設(shè)立對(duì)照以確定無(wú)DNA污染。反應(yīng)體系為20 μL，其中cDNA模板1 μL，Nuclease-free water 8.2 μL，NF-160、HCN4、HCN2基因引物序列上游引物和下游引物各0.4 μL，2X SYBR Green Master Mix 10 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)（94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 30 s），然后72℃再延伸10 min，4℃保存。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
表1 SBYR Green法qRT-PCR引物
2 結(jié)果
2.1 小鼠骨髓CD45-細(xì)胞及誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化細(xì)胞
CD45-細(xì)胞貼壁后多為短梭形、三角形、多邊形，排列無(wú)規(guī)律，細(xì)胞體積較小，分散生長(zhǎng)（圖1A）。生長(zhǎng)良好的CD45-細(xì)胞更換為條件培養(yǎng)基后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，體積變大，大小比較一致，多呈長(zhǎng)梭形，向同一方向生長(zhǎng)（圖1B）。
2.2 分化細(xì)胞起搏標(biāo)志物表達(dá)
經(jīng)免疫熒光染色后，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)分化細(xì)胞NF-160和起搏離子通道HCN4表達(dá)陽(yáng)性，可見(jiàn)胞質(zhì)內(nèi)呈絲狀表達(dá)的NF-160和HCN4，胞核未著色（圖2，見(jiàn)封三）。
2.3 誘導(dǎo)分化起搏樣細(xì)胞起搏基因qRT-PCR檢測(cè)
與培養(yǎng)的竇房結(jié)細(xì)胞比較，分化起搏樣細(xì)胞NF-160、HCN4、HCN2基因表達(dá)水平不同，以倍數(shù)形式表示，其中NF-160、HCN4表達(dá)水平較培養(yǎng)的竇房結(jié)細(xì)胞高（P < 0.01），而HCN2表達(dá)水平低于培養(yǎng)的竇房結(jié)細(xì)胞（P < 0.01）。見(jiàn)表2和圖3。
表2 起搏基因NF-160、HCN4和HCN2表達(dá)水平
注：與小鼠竇房結(jié)細(xì)胞比較，*P < 0.01
與小鼠竇房結(jié)細(xì)胞比較，*P < 0.01；誤差線表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果為3次實(shí)驗(yàn)平均值
圖3 起搏基因NF-160、HCN4和HCN2表達(dá)水平
3 討論
20世紀(jì)末，Makino等[8]首次以5-氮胞苷誘導(dǎo)培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)能夠體外分化為心肌樣細(xì)胞，部分細(xì)胞的動(dòng)作電位與心臟起搏細(xì)胞相似。隨后，大量研究圍繞起搏樣細(xì)胞的誘導(dǎo)分化展開(kāi)。目前，常用方法有應(yīng)用5-氮胞苷誘導(dǎo)分化方法[8-9]、起搏離子通道基因轉(zhuǎn)移方法[10-11]和竇房結(jié)細(xì)胞裂解液誘導(dǎo)分化方法[12]。但是這些體外誘導(dǎo)分化條件仍不完善，單獨(dú)應(yīng)用成功率低，所以本實(shí)驗(yàn)聯(lián)合應(yīng)用5-氮胞苷和竇房結(jié)細(xì)胞培養(yǎng)上清液，提高誘導(dǎo)效率。
5-氮胞苷誘導(dǎo)分化機(jī)制是可引起細(xì)胞DNA中某些胞嘧啶的去甲基化，激活表達(dá)肌細(xì)胞的特異性啟動(dòng)或分化調(diào)控基因，從而使啟動(dòng)細(xì)胞向心肌分化，并表達(dá)心肌細(xì)胞特異性標(biāo)志物，并有一部分細(xì)胞具有自律性[8，13]。由于竇房結(jié)是一個(gè)多態(tài)性的結(jié)構(gòu)，心臟成纖維細(xì)胞能通過(guò)縫隙連接提高心肌細(xì)胞間的交通，因而穩(wěn)定培養(yǎng)心肌的自發(fā)性收縮節(jié)律。因此，體外培養(yǎng)時(shí)不必將竇房結(jié)細(xì)胞完全分離純化。竇房結(jié)細(xì)胞培養(yǎng)液對(duì)CD45-細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用依賴于竇房結(jié)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，可以為干細(xì)胞向起搏樣細(xì)胞分化提供一個(gè)接近于竇房結(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)的環(huán)境。
研究表明，竇房結(jié)起搏細(xì)胞的電生理特性為舒張期自動(dòng)除極化，起主要作用的是起搏電流，其分子基礎(chǔ)是HCN，包括HCN1～HCN4，小鼠心臟主要表達(dá)HCN4和HCN2，以竇房結(jié)細(xì)胞HCN表達(dá)水平最高，所以選擇HCN4和HCN2作為檢測(cè)指標(biāo)[14-17]。
本實(shí)驗(yàn)采用全骨髓細(xì)胞直接接種，然后經(jīng)免疫磁珠分選其中的CD45-細(xì)胞，換用條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化的方法，從成年小鼠骨髓源干細(xì)胞得到竇房結(jié)起搏樣細(xì)胞。該方法操作簡(jiǎn)便，得到細(xì)胞量大，細(xì)胞成活率高，傳代后，細(xì)胞形態(tài)漸趨同一，排列趨同一個(gè)方向，光鏡下可見(jiàn)胞體呈梭形，胞質(zhì)淡染，胞核明顯，位于胞體中央。筆者采用小鼠竇房結(jié)細(xì)胞培養(yǎng)基上清液，并添加5-氮胞苷作為條件培養(yǎng)基，得到的起搏樣細(xì)胞能夠表達(dá)起搏離子通道HCN4和神經(jīng)絲蛋白NF-160，由qRT-PCR結(jié)果看出，分化細(xì)胞表達(dá)起搏離子通道，符合起搏細(xì)胞特點(diǎn)，說(shuō)明得到的細(xì)胞大部分是起搏樣細(xì)胞。形態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)染色研究顯示，得到的細(xì)胞具有較好的生物學(xué)活性，證明誘導(dǎo)分化方法有效，得到起搏樣細(xì)胞在體外能夠存活較長(zhǎng)時(shí)間，并保持其生物學(xué)活性，為生物起搏器奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
目前仍有尚未解決的問(wèn)題，比如得到的細(xì)胞并非全部是起搏樣細(xì)胞，還包含有其他細(xì)胞成分，這些混雜的細(xì)胞會(huì)對(duì)進(jìn)一步研究帶來(lái)干擾，因此進(jìn)一步完善誘導(dǎo)分化條件或增加分化后的篩選指標(biāo)，利用流式細(xì)胞分離技術(shù)或免疫磁珠分選，對(duì)得到的細(xì)胞進(jìn)行分離提純，以提高細(xì)胞純度。
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【關(guān)鍵詞】 嗅鞘細(xì)胞； 神經(jīng)干細(xì)胞； 急性脊髓損傷； 神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3
【Abstract】 Objective：To observe the impact of olfactory ensheathing cells combined neural stem cells in rats with acute spinal cord injury and neurotrophin-3 Expression.Method：80 SD rats were selected， after acute spinal cord injury modeling by Allen's method， the rats were randomly divided into the control group （sham group）， the experimental 1 group （NSCs transplantation group）， the experimental 2 group （OECs transplantation group） and the experimental 3 group （NSCs+OECs transplantation group）. Cells were used local injection method to transplant. In the preoperative and postoperative 1， 3， 5， 7， 14， 21， 28 days， adopt BBB score， improved Tralov score and inclined plane experiments were used to rate the status of rat’s hindlimb motor function， tested motor evoked potential（MEP N1 wave） preclinical. Finally， one rat in each group were selected， randomly， then perfused， drawn and fixed. Immunohistochemical staining were used to observe neurotrophin-3（NT-3） in the damaged spinal cord tissue localized expression in each group. Result：（1）After modeling and cell transplanting， the rats’ BBB rating and improved Tralov score was 0 points within 24 hours， inclined plane experiments’ angle decreased very significantly， from the previous experiment（82.00±3.45） ° reduced to（12.73±1.34） °（P
【Key words】 Olfactory ensheathing cells； Neural stem cells； Acute spinal cord injury； Neurotrophic-3
First-author’s address：The First Affiliated Hospital of Baotou Medical College，Baotou 014010，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.22.008
脊髓損傷（Spinal Cord Injury，SCI）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種嚴(yán)重創(chuàng)傷，近年來(lái)其發(fā)病呈逐年增多的趨勢(shì)[1]。如何有效地治療脊髓損傷已成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)難題[2]。在治療脊髓損傷眾多方法中，細(xì)胞移植的治療方法越來(lái)越受到人們的重視。本實(shí)驗(yàn)采用局部注射法將神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）及嗅鞘細(xì)胞（OECs）分別、共同移植于大鼠脊髓受損區(qū)，通過(guò)行為學(xué)評(píng)價(jià)（BBB評(píng)分、改良Tarlov評(píng)分和斜板實(shí)驗(yàn)）、電生理檢測(cè)（運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位）及免疫組織化學(xué)的方法觀測(cè)各種指標(biāo)，從而考察兩種細(xì)胞移植后在脊髓損傷區(qū)的存活、分化、表達(dá)及功能情況，以期為脊髓損傷的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD雄性大鼠購(gòu)買自內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，共83只，其中3只（出生3 d內(nèi)）用于神經(jīng)干細(xì)胞及嗅鞘細(xì)胞的培養(yǎng)取材。余80只大鼠用于實(shí)驗(yàn)。
1.2 主要試劑與儀器 試劑：DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液、B27、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、兔抗鼠巢蛋白（Nestin）單抗、兔抗鼠P75單抗、兔抗鼠NT-3單抗、異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記羊抗兔二抗、NT-3染色SP試劑盒等；儀器：5% CO2培養(yǎng)箱、倒置熒光顯微鏡、垂直流潔凈工作臺(tái)、電熱恒溫水浴鍋、玻璃細(xì)胞培養(yǎng)瓶等。
1.3 實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定 （1）神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）的培養(yǎng)及鑒定：新生（出生3 d內(nèi)）SD大鼠消毒后，引頸法處死。無(wú)菌條件下，充分暴露出嗅球、兩側(cè)大腦半球及小腦。外科顯微鑷剪斷與海馬有聯(lián)系的大腦皮質(zhì)或神經(jīng)組織，仔細(xì)剝離海馬。垂直流潔凈工作臺(tái)內(nèi)，無(wú)菌條件下將海馬表面的軟腦膜剔除干凈，4 ℃生理鹽水內(nèi)清洗3次后，將海馬放入DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液中，顯微鏡下用顯微外科剪將其剪碎，巴氏吸管先反復(fù)輕柔機(jī)械吹打分離，不銹鋼細(xì)胞濾網(wǎng)過(guò)濾后離心沉淀，最后將沉淀加入含bFGF、EGF和B27的DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)，細(xì)胞培養(yǎng)瓶中懸浮培養(yǎng)，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3～4 d換液1次，每次換50%培養(yǎng)液。傳代一次約需5～7 d。第二代細(xì)胞用特異性Nestin抗原免疫熒光染色法鑒定NSCs。最后將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×109/L，備用。（2）嗅鞘細(xì)胞（OECs）的培養(yǎng)及鑒定：同樣方法，無(wú)菌條件下取大鼠兩側(cè)嗅球后培養(yǎng)OECs。3 d全部換液1次。傳代1次約需16 d。第二代細(xì)胞用P75受體單抗免疫熒光染色法鑒定OECs。最后將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×109個(gè)/L，備用。
1.3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 SD雄性大鼠（體重200～300 g）80只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組（假手術(shù)組）15只、實(shí)驗(yàn)1組（NSCs移植組）20只、實(shí)驗(yàn)2組（OECs移植組）20只和實(shí)驗(yàn)3組（OECs+NSCs聯(lián)合移植組）20只，剩余5只大鼠備用。分組完成后將大鼠做好標(biāo)記。
1.3.3 大鼠急性脊髓損傷Allen’s模型的制備及術(shù)后一般情況和處理 （1）模型制備：腹腔注射麻醉大鼠起效后，手術(shù)區(qū)備皮，將大鼠俯臥固定于手術(shù)臺(tái)上，消毒、鋪巾，背部正中切口，鈍性剝離椎旁肌，縫線牽拉開(kāi)，顯露T10～12棘突、橫突及椎板。切除T10棘突及椎板下部、T12棘突及椎板上部和全部T11棘突及椎板，形成方形骨窗，充分暴露相應(yīng)脊髓節(jié)段（T11）的硬脊膜及椎管，作為打擊損傷區(qū)域。自制的改良Allen’s撞擊器15 g自6 cm高度自由落下，對(duì)T11段脊髓造成損傷，制成急性脊髓損傷動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚3]。打擊完成后，4 ℃生理鹽水沖洗2次，依次逐層常規(guī)縫合切口。（2）術(shù)后一般情況和處理：術(shù)后大鼠禁食水?dāng)?shù)小時(shí)，以后逐漸增加進(jìn)食水量至正常。7 d內(nèi)先單獨(dú)飼養(yǎng)，7 d后5只合籠飼養(yǎng)。術(shù)后7 d內(nèi)青霉素2×105 U肌注2次，預(yù)防傷口、肺部感染，每日飼喂呋喃坦啶水以預(yù)防泌尿系感染。大鼠術(shù)后出現(xiàn)尿潴留，在其恢復(fù)之前，每日應(yīng)給予按摩膀胱協(xié)助排尿3次。
1.3.4 局部注射法行細(xì)胞移植 進(jìn)行細(xì)胞移植之前，先將部分NSCs與OECs混合，用于實(shí)驗(yàn)3組的聯(lián)合細(xì)胞移植。各組細(xì)胞移植均在急性脊髓損傷動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭谱魍瓿?4 h以內(nèi)進(jìn)行。操作方法：造模成功以后，4 ℃生理鹽水沖洗后，外科顯微鑷輕柔提起T11處硬脊膜，1 mL無(wú)菌注射器針頭在硬脊膜上刺一小洞，垂直進(jìn)針，緩慢向該處硬脊膜下約3 mm、脊髓損傷方向插入，緩慢注入細(xì)胞懸液0.1 mL（細(xì)胞數(shù)約為1×105個(gè)）。關(guān)閉切口前，小塊可吸收明膠海綿微加壓填塞于硬脊膜進(jìn)針點(diǎn)處，防止細(xì)胞移植液及大鼠腦脊液的滲漏。對(duì)照組生理鹽水代替細(xì)胞移植液，作陰性對(duì)照，余操作步驟與實(shí)驗(yàn)組相同。
1.4 功能檢測(cè)
1.4.1 行為學(xué)評(píng)價(jià) 術(shù)前和術(shù)后1、3、5、7、14、21 d和28 d，隨機(jī)抽取實(shí)驗(yàn)組15只大鼠及全部對(duì)照組大鼠，采用BBB評(píng)分法、改良的Tralov評(píng)分法和斜板實(shí)驗(yàn)，對(duì)大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能狀況進(jìn)行雙盲法評(píng)分，與手術(shù)之前相比較，以了解受損脊髓功能恢復(fù)情況。
1.4.2 神經(jīng)電生理檢測(cè) 運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位（MEP N1波）的檢測(cè)，觀察外周運(yùn)動(dòng)神經(jīng)（坐骨神經(jīng)）的功能狀態(tài)。檢測(cè)方法：大鼠麻醉起效后，環(huán)形切開(kāi)頭后部皮膚，剝離至骨膜，細(xì)紋螺釘鉆孔，孔的大小以剛好將刺激電極放入為宜。根據(jù)MEP的產(chǎn)生原理，刺激電極置于皮層，記錄電極置于后肢大腿后側(cè)坐骨神經(jīng)處，參考電極置于硬腭下。刺激類型是：?jiǎn)蚊}沖粗電壓，強(qiáng)度3 V，波寬1 ms、頻率10 Hz，濾波3000 Hz，增益20倍，時(shí)間常數(shù)0.01 s，次數(shù)100次。檢測(cè)完畢后縫合切口。
1.5 大鼠灌注、取材、固定與免疫組織化學(xué)染色 各組隨機(jī)抽取1只大鼠進(jìn)行灌注、取材與固定，免疫組織化學(xué)染色的方法測(cè)定NT-3標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞指數(shù)，檢測(cè)NT-3在局部受損脊髓組織中的表達(dá)情況。操作方法：腹腔麻醉起效后，開(kāi)胸后經(jīng)左心室主動(dòng)脈插管，剪開(kāi)右心耳，先快速灌注冰鹽水，清亮液體流出后，再用多聚甲醛經(jīng)心灌注、固定動(dòng)物，速度先快后慢。切取T10～T12脊髓節(jié)段上下各約1 mm脊髓節(jié)段，立即放入中爾馬林溶液內(nèi)后固定，再入蔗糖溶液內(nèi)脫水，置4 ℃下至沉底，常規(guī)石蠟包埋，切片機(jī)連續(xù)切片，厚度為10 um。免疫組織化學(xué)染色按NT-3染色SP試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行（操作步驟詳見(jiàn)說(shuō)明書(shū)）。NT-3染色陽(yáng)性的標(biāo)志是細(xì)胞漿或細(xì)胞膜呈棕黃色。選取15張最優(yōu)切片，每張切片在10倍光鏡下分別計(jì)數(shù)4個(gè)視野內(nèi)染色陽(yáng)性細(xì)胞，測(cè)定各組染色陽(yáng)性細(xì)胞在總計(jì)數(shù)細(xì)胞中所占比例（即陽(yáng)性細(xì)胞指數(shù)），重復(fù)5次，求平均值。
1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（x±s）表示，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，不同時(shí)間點(diǎn)比較采用單因素方差分析（ANOVA），以P
2 結(jié)果
2.1 SD大鼠急性脊髓損傷細(xì)胞移植后BBB評(píng)分變化 對(duì)照組及各實(shí)驗(yàn)組大鼠術(shù)后24 h內(nèi)BBB評(píng)分均為0分，隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，各組均表現(xiàn)出不同程度的恢復(fù)情況。其中實(shí)驗(yàn)組恢復(fù)速度及程度大于對(duì)照組（P
2.2 SD大鼠急性脊髓損傷細(xì)胞移植后改良的Tralov評(píng)分變化 所有大鼠模型制備完成后及術(shù)后任一檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，Tralov評(píng)分均顯著低于術(shù)前。隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，各組大鼠均表現(xiàn)出不同程度的恢復(fù)情況。與BBB評(píng)分的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果相似，實(shí)驗(yàn)組Tralov評(píng)分均顯著高于同一檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組（P
2.3 SD大鼠急性脊髓損傷細(xì)胞移植后斜板實(shí)驗(yàn)角度變化 造模及細(xì)胞移植術(shù)后，大鼠斜板實(shí)驗(yàn)角度大幅下降，術(shù)后1 d由（82.00±3.45）°降為（12.73±1.34）°，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；1周后，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P
2.4 SD大鼠急性脊髓損傷細(xì)胞移植后MEP（N1波）潛伏期變化 造模及細(xì)胞移植術(shù)后，各組MEP（N1波）潛伏期明顯延長(zhǎng)，但各實(shí)驗(yàn)組N1波潛伏期短于對(duì)照組（P
2.5 SD大鼠急性脊髓損傷細(xì)胞移植后NT-3染色表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)變化 造模及細(xì)胞移植術(shù)后，各組大鼠受損脊髓組織中NT-3均有明顯增高，其中術(shù)后第3天達(dá)到高峰，7 d內(nèi)NT-3的表達(dá)維持在較高的水平，此后逐步減少。自術(shù)后第5天（包含5 d）開(kāi)始，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較NT-3增高顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P
3 討論
治療急性脊髓損傷必須要明確其受損機(jī)制，從而針對(duì)其中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)做出行之有效干預(yù)治療措施。急性脊髓損傷的具體機(jī)制雖尚未被完全闡明，但醫(yī)學(xué)工作者的認(rèn)識(shí)逐漸趨于統(tǒng)一，認(rèn)為脊髓損傷包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷[4]。基于這一認(rèn)識(shí)，目前急性脊髓損傷動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ突A(chǔ)研究中所實(shí)驗(yàn)的新方法新技術(shù)和臨床上治療脊髓損傷的各種常用措施，就是要及早正確的干預(yù)、減輕和預(yù)防可逆性的繼發(fā)性損傷，但取得的治療效果卻不甚理想。上世紀(jì)90年代初，Reynold等[5]在鼠紋狀體中發(fā)現(xiàn)了具有多向分化潛能、不斷進(jìn)行分裂的細(xì)胞群，后來(lái)Mckay將之命名為神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）。他們的發(fā)現(xiàn)顛覆了人們以往認(rèn)為成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元不能夠再生的認(rèn)知，為治療脊髓損傷提供了新的治療思路―細(xì)胞移植。自此，各種細(xì)胞被嘗試用來(lái)治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷和脊髓損傷。在這些嘗試中，最成功的例子就是神經(jīng)干細(xì)胞移植治療帕金森病、癲癇、中風(fēng)等神經(jīng)系統(tǒng)疾病[6-9]。但急性脊髓損傷的機(jī)制更加錯(cuò)綜復(fù)雜，細(xì)胞移植雖然在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等方面取得了重大進(jìn)展與突破，但國(guó)內(nèi)外人體臨床試驗(yàn)尚未大規(guī)模開(kāi)展，這仍有待于研究者的進(jìn)一步地探索研究。
神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）是一類特定的干細(xì)胞，它可以通過(guò)非對(duì)稱分裂的方式分化成為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞等。此外，還可自分泌神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（NTF）等物質(zhì)。自其被發(fā)現(xiàn)伊始，神經(jīng)干細(xì)胞就被醫(yī)學(xué)工作者用來(lái)自體移植治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷，這樣不僅可以避免免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生，同時(shí)又解決了移植細(xì)胞的來(lái)源問(wèn)題，取得了滿意的臨床療效，可作為急性脊髓損傷治療的重要參照[10]。
嗅鞘細(xì)胞（OECs）是目前所發(fā)現(xiàn)的極少數(shù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)可以再生的細(xì)胞之一，被認(rèn)為是髓鞘化能力最強(qiáng)的膠質(zhì)細(xì)胞，其特點(diǎn)是具備終生再生分裂的能力，它不僅能存活于中樞神經(jīng)系統(tǒng)當(dāng)中，而且又可以促進(jìn)外周神經(jīng)元細(xì)胞軸突的生長(zhǎng)。Sasaki等[11]研究就發(fā)現(xiàn)，嗅鞘細(xì)胞移植后能夠突出脊髓受損區(qū)達(dá)8 mm，除了仍可保持再生分裂的能力外，還可使已經(jīng)脫髓鞘的神經(jīng)元軸突重新髓鞘化。此外，與NSCs相似，嗅鞘細(xì)胞也能分泌多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，這些可能都對(duì)神經(jīng)元軸突的生長(zhǎng)起著重要的促進(jìn)作用[12]。
本實(shí)驗(yàn)中，采用單種細(xì)胞或兩種細(xì)胞聯(lián)合移植治療大鼠急性脊髓損傷，將能夠分泌NT-3的神經(jīng)干細(xì)胞及嗅鞘細(xì)胞分別、共同移植于脊髓受損區(qū)，以期可持續(xù)分泌NT-3，這樣就可避免外源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子半衰期短和持續(xù)性作用差的弊端，等同于NT-3、神經(jīng)干細(xì)胞及嗅鞘細(xì)胞共同修復(fù)受損的脊髓，改善大鼠急性脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)[13]。實(shí)驗(yàn)中筆者觀察到，造模及細(xì)胞移植術(shù)后，24 h內(nèi)各組大鼠BBB評(píng)分及改良的Tralov評(píng)分均為0分，斜板實(shí)驗(yàn)角度下降非常明顯，由實(shí)驗(yàn)前的（82±3.45）°降為（12.73±1.34）°，各組MEP（N1波）潛伏期明顯延長(zhǎng)。隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，各組均表現(xiàn)出不同程度的恢復(fù)情況，各實(shí)驗(yàn)組BBB評(píng)分及改良的Tralov評(píng)分與對(duì)照組相比增高顯著（P
然而，并非所有的實(shí)驗(yàn)研究都獲得了一致或相仿的研究結(jié)論。有學(xué)者認(rèn)為，局部注射法進(jìn)行細(xì)胞移植時(shí)，“細(xì)胞遷徙”可能是人為進(jìn)行細(xì)胞移植時(shí)局部注射的壓力所導(dǎo)致的局部擴(kuò)散而已，而不是所謂的“主動(dòng)遷徙”[14]。在各種急性脊髓損傷模型中，如脊髓半或全橫斷模型，脊髓壓迫模型等，可見(jiàn)細(xì)胞移植無(wú)療效或療效甚微的案例，故而一部分學(xué)者對(duì)細(xì)胞移植治療急性脊髓損傷的療效抱有懷疑態(tài)度[15]。盡管如此，筆者認(rèn)為急性脊髓損傷機(jī)制的復(fù)雜性決定了其治療的全面性，不是單獨(dú)應(yīng)用一種治療方法或多種治療方法聯(lián)合應(yīng)用就可一蹴而就的。細(xì)胞移植的方法雖然不是涉及了急性脊髓損傷修復(fù)的所有方面，但取得了一定的療效。
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[關(guān)鍵詞] 胚胎干細(xì)胞；綠色熒光蛋白；分化；角膜上皮細(xì)胞；誘導(dǎo)
[中圖分類號(hào)] R329.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2013）03（b）-0013-03
角膜上皮位于眼角膜表面，是維持眼表正常生理功能的重要條件。健全的角膜上皮細(xì)胞是角膜抵御外界各種有害因素?fù)p傷的重要條件。人的角膜自我更新由位于角膜緣區(qū)域的角膜緣干細(xì)胞來(lái)維持，結(jié)構(gòu)與功能健全的角膜緣干細(xì)胞是角膜上皮再生的主要來(lái)源，當(dāng)角膜受到化學(xué)及熱燒傷，以及患有Stevens-Johnson syndrome等疾病時(shí)，角膜緣上皮細(xì)胞將會(huì)缺失，導(dǎo)致增加角膜感染、穿孔、新生血管化的危險(xiǎn)[1]。因此，重建完整的角膜上皮就顯得異常重要。
胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ES細(xì)胞）是從早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離獲得的，具有體外增殖和全能性兩大特點(diǎn)。近年來(lái)隨著ES細(xì)胞研究的不斷深入，其逐漸應(yīng)用于細(xì)胞、組織的修復(fù)和移植[2]。綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因是一種新型的報(bào)告基因，用GFP作為標(biāo)志物來(lái)標(biāo)記ES細(xì)胞，可用來(lái)追蹤ES細(xì)胞在體內(nèi)的分化[3]。本研究利用質(zhì)粒pEGFP-N1脂質(zhì)體復(fù)合體轉(zhuǎn)染鼠ES細(xì)胞，并在體外誘導(dǎo)鼠ES細(xì)胞向角膜上皮細(xì)胞分化，為治療角膜損傷及重建角膜上皮提供細(xì)胞組織來(lái)源。
1 材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)材料
鼠ES細(xì)胞由北京大學(xué)深圳研究生院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶、B-巰基乙醇、非必需氨基酸，購(gòu)自Sigma公司；絲裂霉素C，購(gòu)自Kogyo公司；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000、G418，均購(gòu)自Invitrogen公司；白血病抑制因子（1eukemia inhibitory factor，LIF）、L-谷氨酰胺，購(gòu)自Sigma公司；質(zhì)粒pEGFP-N1，購(gòu)自Clontech公司；明膠、TaqDNA 聚合酶，購(gòu)自博大泰克公司；CK14、CK12、CD44引物，委托寶生物工程公司合成；免疫組化二抗試劑盒、DAB顯色試劑盒，購(gòu)自武漢博士德公司；其余為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 ES細(xì)胞的培養(yǎng) ES細(xì)胞復(fù)蘇后，經(jīng)絲裂霉素C滅活的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）做飼養(yǎng)層培養(yǎng)，加入預(yù)先鋪有明膠（Ⅳ型膠原）的培養(yǎng)皿中，37℃，50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日更換ES細(xì)胞培養(yǎng)液為高糖DMEM（內(nèi)含0.1 mol/L β-巰基乙醇、2 mmol/L谷氨酰胺、150 mL/L胎牛血清、1 000 U/mL LIF、15 g/L非必需氨基酸）。2～3 d傳代1次。
1.2.2 轉(zhuǎn)染及誘導(dǎo)ES細(xì)胞 將真核細(xì)胞表達(dá)載體pEGFP-N1轉(zhuǎn)染ES細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ES細(xì)胞作為對(duì)照組。在轉(zhuǎn)染前2 h改為無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)液；含載體pEGFP-N1質(zhì)粒的無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)液與含脂質(zhì)體Lipofectamine 2000的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液混合，加入ES細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，換液，培養(yǎng)基為不含LIF的ES細(xì)胞培養(yǎng)基。G418篩選GFP陽(yáng)性細(xì)胞克隆，接種在絲裂霉素C處理的MEF飼養(yǎng)層上，繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。ES細(xì)胞誘導(dǎo)前去除飼養(yǎng)層細(xì)胞，接種于涂抹明膠（Ⅳ型膠原）的培養(yǎng)皿中，加入無(wú)LIF的ES細(xì)胞培養(yǎng)液，隔日換液，傳3～4代，誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化成角膜上皮細(xì)胞。
1.2.3 形態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)鑒定 顯微鏡下觀察ES細(xì)胞形態(tài)，誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d后，細(xì)胞基本融合，將培養(yǎng)分化的ES細(xì)胞用PBS洗滌3次后，冷4%多聚甲醛固定30 min，正常山羊血清封閉30 min，滴加K14、K12及CD44單抗，4℃過(guò)夜，0.02% Triton-PBS洗滌，加人生物素標(biāo)記的二抗，室溫下孵育40 min，PBS洗滌數(shù)次后，加入鏈親和素一過(guò)氧化物酶溶液，放置于室溫下10 min，0.02% Triton-PBS洗滌，最后DAB顯色，顯微鏡下觀察。
1.2.4 RT-PCR檢測(cè) Trizol R試劑盒提取ES細(xì)胞總RNA，具體過(guò)程參照Trizol Reagent說(shuō)明書(shū)。引物序列分別為：CD44 正義鏈5'-atcaacctgcctatgcaacc-3'，反義鏈5'-cttggacgggaactgacact-3'（248 bp）； K12正義鏈5'-cgagagtggtatgaaaca-3'， 反義鏈5'-tgggctctcatttcattg-3'（218 bp）； K14正義鏈5'-ggtcgatttgatggatttgg-3'，反義鏈5'-gttcagtgttggcctcttcc-3'（192 bp）；內(nèi)參照β-actin 正義鏈5'-gatgacgatatcgctgcgctg-3'， 反義鏈5'-gtccgaccagaggcatacagg-3'（512 bp）。每個(gè)周期參數(shù)如下：94℃ 30 s， 60℃ 35 s， 72℃ 60 s，共30個(gè)循環(huán)周期。采用小鼠角膜上皮細(xì)胞做陽(yáng)性對(duì)照，每組PCR反應(yīng)均設(shè)一個(gè)陰性對(duì)照。取RT-PCR產(chǎn)物20 μL行瓊脂糖凝膠電泳，紫外分析儀觀察結(jié)果，凝膠成像系統(tǒng)拍照。
2 結(jié)果
2.1 ES細(xì)胞的形態(tài)
在飼養(yǎng)層上培養(yǎng)的ES細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，邊界光滑，呈現(xiàn)巢狀生長(zhǎng)，集落大多呈多角形或橢圓形，集落內(nèi)細(xì)胞排列緊密，邊界不清；細(xì)胞邊界清，胞漿較豐富，細(xì)胞核大，核仁大。GFP陽(yáng)性ES細(xì)胞在熒光顯微鏡下可觀察到細(xì)胞內(nèi)有微弱的綠色熒光（圖1～2）。
2.2 誘導(dǎo)分化的角膜上皮細(xì)胞形態(tài)
GFP陽(yáng)性ES細(xì)胞經(jīng)Ⅳ型膠原誘導(dǎo)培養(yǎng)1周，可見(jiàn)在細(xì)胞集落中爬出上皮樣細(xì)胞， 貼壁生長(zhǎng)，增殖迅速，逐漸呈集落式生長(zhǎng)，生長(zhǎng)胞體多為扁平，呈多角型或不規(guī)則形態(tài)生長(zhǎng)，表現(xiàn)出典型的上皮細(xì)胞形態(tài)，在熒光顯微鏡下可觀察到細(xì)胞內(nèi)有很強(qiáng)的綠色熒光（圖3～4）。
2.3 K12、K14及CD44表達(dá)情況
RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：誘導(dǎo)分化的ES細(xì)胞中有K12及CD44表達(dá)，而K14則無(wú)表達(dá)，證實(shí)轉(zhuǎn)染后ES細(xì)胞向角膜上皮細(xì)胞方向分化（圖5）；免疫組化結(jié)果顯示：角膜上皮樣細(xì)胞K14的表達(dá)很少，而K12及CD44的免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽(yáng)性（圖6）。
3 討論
嚴(yán)重的角膜損傷一直是眼科治療的難題。一些嚴(yán)重的化學(xué)或熱燒傷，以及Stevens-Johnson syndrome等疾病，常導(dǎo)致角膜上皮的大量缺失。傳統(tǒng)的移植方法雖有一定療效，但由于供體缺乏、移植免疫及倫理等問(wèn)題，在臨床上的應(yīng)用發(fā)展受到很大限制[4]。重建角膜的關(guān)鍵是獲得足夠的角膜上皮材料。本研究探索采用誘導(dǎo)有多向分化潛能的ES細(xì)胞向角膜上皮細(xì)胞分化，為角膜上皮移植提供無(wú)限的供體來(lái)源。
ES細(xì)胞是一種具有全能性、可無(wú)限增殖和多向分化潛能的未分化細(xì)胞，具有兩個(gè)重要特性：①自我更新潛能。干細(xì)胞在未分化狀態(tài)下可不斷增殖，從而可自我更新。②多向分化潛能。在體內(nèi)外ES細(xì)胞均有分化成許多特定細(xì)胞類型的能力。它能遷移到不同部位分化成相應(yīng)的細(xì)胞類型，恢復(fù)受損細(xì)胞的功能，成為一種新型細(xì)胞替代治療和基因治療的途徑。經(jīng)絲裂霉素C處理的含LIF的MEF作為飼養(yǎng)層，能夠抑制ES細(xì)胞的分化和促進(jìn)其增殖，并使其保持未分化狀態(tài)以及多向分化潛能[5]。本研究將Ⅳ型膠原作為誘導(dǎo)劑，加入不含LIF的培養(yǎng)板中，誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的ES細(xì)胞向角膜上皮細(xì)胞分化。
GFP是一種由238個(gè)氨基酸組成的蛋白，作為熒光標(biāo)記分子，在研究細(xì)胞的分化、細(xì)胞移植中具有重要作用[6]。本研究用脂質(zhì)體方法將含有GFP的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至小鼠ES細(xì)胞中，選擇G418篩選并純化后的GFP陽(yáng)性ES細(xì)胞。將這些能夠持續(xù)表達(dá)GFP的ES細(xì)胞在誘導(dǎo)條件下分化成角膜上皮樣細(xì)胞，并穩(wěn)定表達(dá)GFP，證明GFP基因已完全整合到ES細(xì)胞基因組中，這對(duì)ES細(xì)胞在體內(nèi)的分化、遷移及整合具有重要意義。
本研究對(duì)誘導(dǎo)分化后的ES細(xì)胞進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)分化后的細(xì)胞符合具有典型上皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征。細(xì)胞呈集落式生長(zhǎng)，排列緊密，邊界不清；細(xì)胞邊界清，胞漿較豐富，細(xì)胞核大，核仁大。對(duì)于眼表上皮而言，區(qū)分角膜上皮細(xì)胞與結(jié)膜上皮細(xì)胞是非常重要的，因?yàn)樗鼈冊(cè)诠δ苌嫌泻艽髤^(qū)別，影響角膜上皮組織的移植。細(xì)胞角蛋白（cytokeratin）是細(xì)胞骨架成分中間絲的重要組成部分，是一類在上皮細(xì)胞中表達(dá)豐富的蛋白質(zhì)，也是某些上皮細(xì)胞重要的標(biāo)志物，其中，K14主要在結(jié)膜上皮表達(dá)而不在角膜上皮表達(dá)，K12則是在角膜上皮細(xì)胞表達(dá)的角蛋白，是特異性角膜上皮細(xì)胞標(biāo)志物。而CD44也存在于角膜上皮細(xì)胞中，功能與組織修復(fù)有關(guān)，它可以促進(jìn)角膜上皮的愈合。本實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)分化的上皮細(xì)胞CD44和K12表達(dá)陽(yáng)性，而表達(dá)K14陰性，說(shuō)明誘導(dǎo)分化的細(xì)胞是角膜上皮細(xì)胞，而非結(jié)膜上皮細(xì)胞。提示ES細(xì)胞能在體外定向誘導(dǎo)分化為角膜上皮樣細(xì)胞。本研究應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)ES細(xì)胞及分化的角膜上皮樣細(xì)胞中均有K12及CD44的表達(dá)，而結(jié)膜上皮標(biāo)志物K14則無(wú)表達(dá)，證實(shí)轉(zhuǎn)染GFP后的ES細(xì)胞向角膜上皮細(xì)胞方向分化。
總之，通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)本研究成功建立了轉(zhuǎn)染GFP基因的ES細(xì)胞系，并利用Ⅳ型膠原體外誘導(dǎo)ES細(xì)胞定向分化為角膜上皮樣細(xì)胞，為臨床治療角膜損傷提供新的材料來(lái)源。
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如何培養(yǎng)適應(yīng)社會(huì)需求的21世紀(jì)的新型人才，是現(xiàn)代高等教育所必須考慮的首要問(wèn)題。因此，細(xì)胞工程作為現(xiàn)代生物技術(shù)學(xué)科的一個(gè)重要組成部分，在高等院校生物科學(xué)及相關(guān)專業(yè)的教學(xué)中被設(shè)定為主干課程。目前，細(xì)胞工程是生物技術(shù)等相關(guān)專業(yè)本科生培養(yǎng)計(jì)劃的必修課程，在課程內(nèi)容上要求系統(tǒng)全面地介紹細(xì)胞工程的基本原理、基本技術(shù)、最新研究方法和成果、實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用以及未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)等。
細(xì)胞工程課程在生物科學(xué)專業(yè)的設(shè)置
本課程自從2007年在我校新辦生物技術(shù)專業(yè)開(kāi)設(shè)以來(lái)，根據(jù)學(xué)校對(duì)本科生物技術(shù)專業(yè)的培養(yǎng)計(jì)劃，細(xì)胞工程是生物技術(shù)專業(yè)的主干課程，并于2009－2010學(xué)年第二學(xué)期開(kāi)始開(kāi)設(shè)。通過(guò)對(duì)該課程的教學(xué)，使學(xué)生掌握細(xì)胞工程所涉及的基本概念、原理、技術(shù)方法、應(yīng)用基礎(chǔ)等內(nèi)容。通過(guò)近三年的教學(xué)實(shí)踐，不斷加強(qiáng)課程建設(shè)與發(fā)展，理論教學(xué)體系已經(jīng)基本完善，實(shí)驗(yàn)教學(xué)平臺(tái)基本建立。通過(guò)全面進(jìn)行教學(xué)改革，已逐漸形成本校建設(shè)的特色課程。21世紀(jì)，生命科學(xué)全面快速發(fā)展。根據(jù)學(xué)科發(fā)展和社會(huì)需求趨勢(shì)，在新辦生物技術(shù)專業(yè)基礎(chǔ)之上，2009年我校新辦生物科學(xué)專業(yè)。然而，新辦生物科學(xué)專業(yè)的困境是專業(yè)范圍寬泛;如何在有限的時(shí)間內(nèi)，全面、高效地培養(yǎng)適應(yīng)社會(huì)需求的合格人才，是每位任課教師和教學(xué)管理者必須認(rèn)清的首要問(wèn)題。為了充分發(fā)揮我們醫(yī)學(xué)院校的資源優(yōu)勢(shì)，在培養(yǎng)學(xué)生方向定位上，以健康教育為主要方向，兼顧生物制藥等，但又與生物技術(shù)的培養(yǎng)方式不同。由于細(xì)胞工程是由細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、基因工程、工程學(xué)等學(xué)科理論技術(shù)有機(jī)結(jié)合的一門嶄新學(xué)科，因而被設(shè)定為新辦生物科學(xué)專業(yè)本科生培養(yǎng)計(jì)劃的必修課程。
細(xì)胞工程課程在生物科學(xué)中的開(kāi)設(shè)，是以普通生物學(xué)、生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、免疫學(xué)等先修課程為基礎(chǔ)。同時(shí)，將本課程的學(xué)習(xí)與基因工程、生物技術(shù)等課程的學(xué)習(xí)互相補(bǔ)充和相互促進(jìn)，為將來(lái)從事生命科學(xué)基礎(chǔ)理論研究、生物制品的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用、疾病診斷技術(shù)的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用等領(lǐng)域的工作打下必要的基礎(chǔ)。在教材方面，以李志勇編著《細(xì)胞工程》(高等教育出版社)為基本教材，以楊吉成編著《細(xì)胞工程》(化學(xué)工業(yè)出版社)、安利國(guó)編著《細(xì)胞工程》(第二版，科學(xué)出版社)等為主要參考教材。在教師隊(duì)伍配置方面，既有細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域教學(xué)經(jīng)驗(yàn)豐富的教授，也有年富力強(qiáng)的專業(yè)知識(shí)扎實(shí)的中青年骨干教師。細(xì)胞工程的理論教學(xué)和實(shí)驗(yàn)教學(xué)全部由既具有扎實(shí)生物工程學(xué)相關(guān)知識(shí)背景，又有基礎(chǔ)細(xì)胞理論與實(shí)驗(yàn)技術(shù)背景的骨干教師承擔(dān)。
細(xì)胞工程教學(xué)內(nèi)容的設(shè)定與改革
細(xì)胞工程課程的特色，是以細(xì)胞工程技術(shù)方法的基本原理為課程教學(xué)切入點(diǎn)。在教學(xué)內(nèi)容上，基本理論的講授與技術(shù)方法過(guò)程的介紹并重;在本學(xué)科知識(shí)的系統(tǒng)性方面，既有本學(xué)科理論的系統(tǒng)性，又加強(qiáng)與其他相關(guān)學(xué)科的相互滲透交叉，尤其是以細(xì)胞生物學(xué)、生物工程的基礎(chǔ)知識(shí)背景，為本學(xué)科的理論教學(xué)奠定基礎(chǔ);通過(guò)將現(xiàn)有技術(shù)的原理、應(yīng)用歸納，與本學(xué)科相關(guān)技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)講解相結(jié)合;從內(nèi)容上，客觀系統(tǒng)地反映本學(xué)科相關(guān)領(lǐng)域應(yīng)用前景、重點(diǎn)研究方向和尚待解決的科學(xué)問(wèn)題;在理論上自成體系。根據(jù)教學(xué)計(jì)劃，細(xì)胞工程在我校總學(xué)時(shí)設(shè)定為80學(xué)時(shí)，其中理論50學(xué)時(shí)，實(shí)驗(yàn)30學(xué)時(shí)。本課程的開(kāi)設(shè)，一般在第三學(xué)年的第二學(xué)期，在普通生物學(xué)、生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、組織胚胎學(xué)等課程修完之后進(jìn)行。細(xì)胞工程在教學(xué)內(nèi)容、教學(xué)方法上又與以上學(xué)科大不相同，本課程教學(xué)是以技術(shù)方法的原理為基礎(chǔ)理論的學(xué)科，因此實(shí)驗(yàn)與理論教學(xué)并重。細(xì)胞工程課程的理論課程內(nèi)容，根據(jù)研究對(duì)象一般分為三大部分內(nèi)容，分別為:細(xì)胞工程概論與基本技術(shù)、植物細(xì)胞工程、動(dòng)物細(xì)胞工程。根據(jù)我校的教學(xué)實(shí)際情況和培養(yǎng)計(jì)劃，我們對(duì)教學(xué)內(nèi)容進(jìn)行了適當(dāng)?shù)母母锱c調(diào)整。課程的內(nèi)容重點(diǎn)在第一部分細(xì)胞工程概論與基本技術(shù)和第三部分動(dòng)物細(xì)胞工程［1－4］。
細(xì)胞工程概論和細(xì)胞工程基本技術(shù)，這部分內(nèi)容是細(xì)胞工程的理論方法基礎(chǔ)，是教學(xué)重點(diǎn)之一。課程內(nèi)容主要包括:細(xì)胞工程概論、細(xì)胞工程理論基礎(chǔ)、實(shí)驗(yàn)室設(shè)置與無(wú)菌操作技術(shù)、細(xì)胞基本培養(yǎng)基本技術(shù)。重點(diǎn)讓學(xué)生掌握細(xì)胞工程研究所涉及的基本理論、技術(shù)問(wèn)題。由于細(xì)胞工程是在細(xì)胞生物學(xué)教學(xué)之后開(kāi)設(shè)，學(xué)生已經(jīng)基本具備細(xì)胞生物學(xué)的基本理論和技術(shù)方法;因此在理論教學(xué)內(nèi)容安排上，只做概要性講解。植物細(xì)胞、組織工程技術(shù)相對(duì)成熟，應(yīng)用范圍廣泛。這部分內(nèi)容包括:植物組織、器官培養(yǎng)技術(shù);植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù);原生質(zhì)體融合與培養(yǎng)技術(shù);亞細(xì)胞水平的操作技術(shù)等。對(duì)這部分內(nèi)容的教學(xué)，只做相關(guān)技術(shù)原理的理論性講解，了解相關(guān)的技術(shù)原理和應(yīng)用。細(xì)胞工程課程的教學(xué)重點(diǎn)內(nèi)容設(shè)置在動(dòng)物細(xì)胞工程部分。這部分內(nèi)容主要有五個(gè)方面的相關(guān)主題:①動(dòng)物細(xì)胞的規(guī)?；囵B(yǎng)技術(shù)與生物反應(yīng)器;②基因操作技術(shù)與外源基因的表達(dá)，包括轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器(轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物)、細(xì)胞培養(yǎng)與生物制藥;③體外受精與核移植技術(shù)，包括體外受精技術(shù)、胚胎工程技術(shù)、核移植技術(shù)等;④細(xì)胞融合與單克隆抗體技術(shù)，包括雜交瘤技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)、抗體工程技術(shù)等;⑤胚胎干細(xì)胞與組織工程技術(shù)。在這幾個(gè)主題中，著重對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞融合技術(shù)原理和基本方法，以及利用細(xì)胞融合產(chǎn)生雜交瘤和單克隆抗體的動(dòng)物細(xì)胞工程發(fā)展的基礎(chǔ)進(jìn)行講解;重點(diǎn)講解動(dòng)物細(xì)胞基因表達(dá)系統(tǒng)和基因打靶的技術(shù)、利用染色體載體轉(zhuǎn)移基因和構(gòu)建人工染色體的技術(shù)及其應(yīng)用;并且對(duì)于干細(xì)胞生物學(xué)在醫(yī)學(xué)上應(yīng)用的重大意義，對(duì)胚胎干細(xì)胞和組織干細(xì)胞的研究方法、研究進(jìn)展進(jìn)行重點(diǎn)講解［5－8］。
實(shí)驗(yàn)教學(xué)部分，將培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞的整個(gè)實(shí)驗(yàn)體系與技術(shù)設(shè)定為細(xì)胞工程課程的實(shí)驗(yàn)教學(xué)部分。實(shí)驗(yàn)課程的教學(xué)改革，是我們對(duì)這門課程進(jìn)行教學(xué)改革的重點(diǎn)部分，相關(guān)的研究進(jìn)展將另文詳細(xì)論述。細(xì)胞工程在無(wú)論是在理論教學(xué)還是實(shí)驗(yàn)教學(xué)上，都充分展現(xiàn)出細(xì)胞工程的最新前沿技術(shù)以及這些技術(shù)在生物制品研發(fā)、保障人類健康等方面所體現(xiàn)出來(lái)的越來(lái)越多的貢獻(xiàn)和作用。通過(guò)課程改革，不斷完善教學(xué)內(nèi)容，不斷豐富教學(xué)方法與手段，使理論教學(xué)與實(shí)踐教學(xué)、甚至科研教學(xué)相互促進(jìn)。通過(guò)本課程教學(xué)，使學(xué)生充分掌握細(xì)胞工程的基礎(chǔ)知識(shí)、基本概念和實(shí)驗(yàn)技術(shù)的基本原理，完整的理論以及體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和方法，以及細(xì)胞工程發(fā)展的新技術(shù)和新理論。從教學(xué)效果以及學(xué)生反饋來(lái)的信息，都證明了細(xì)胞工程教學(xué)取得了非常好的教學(xué)效果，達(dá)到了課程設(shè)定的預(yù)期目標(biāo)。（本文作者：任立成、孫元田、蘇振宇、林蓉、李冬娜單位：海南醫(yī)學(xué)院生物學(xué)教研室）
關(guān)鍵詞： 脂肪源性干細(xì)胞；異種松質(zhì)骨；支架材料；骨代用品；生物醫(yī)學(xué)工程；成骨誘導(dǎo)；種子細(xì)胞
0引言
如何獲得充足的種子細(xì)胞是長(zhǎng)期以來(lái)限制組織工程研究的瓶頸，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞盡管已被廣泛應(yīng)用于組織工程研究，但由于其干細(xì)胞含量過(guò)低、骨髓抽取量有限以及對(duì)患者造成的創(chuàng)傷等，使其廣泛應(yīng)用到受限. 2001年Zuk等［1］從脂肪組織中成功提取了干細(xì)胞，并成功誘導(dǎo)其向骨、軟骨、脂肪、心肌等多個(gè)方向誘導(dǎo)分化. 我們將成骨誘導(dǎo)的脂肪源性干細(xì)胞（adiposederived stem cells，ADSCs）與異種松質(zhì)骨支架復(fù)合，移植至兔顱骨缺損部位，以探討成骨誘導(dǎo)脂肪源性干細(xì)胞修復(fù)骨缺損的應(yīng)用前景.
1材料和方法
1.1材料新西蘭大白兔12只，4 mo齡，體質(zhì)量2.0～2.2 kg（第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）；Dolbecco改良的Eagle培養(yǎng)基（DMEM），胎牛血清（FBS），地塞米松，抗壞血酸，β甘油磷酸鈉（美國(guó)Sigma公司）；堿性磷酸酶（ALP）活性測(cè)定試劑盒（南京建成生物技術(shù)有限公司），牛股骨，甲醇，氯仿，300 g/L H2O2等（市售）.
1.2方法
1.2.1ADSCs的分離培養(yǎng)［1］將新西蘭大白兔按0.2 mL/kg速眠新麻醉，取頸部后正中3 cm切口，無(wú)菌切取肩胛上脂肪組織約2 mL. 清除切取組織中肉眼可見(jiàn)的小血管，去除外包膜和明顯的結(jié)締組織，DHanks沖洗3遍以洗去紅細(xì)胞的污染. 切碎成糊狀，加入2 g/LⅠ型膠原酶5 mL，在37℃水浴攪拌消化40 min，過(guò)濾，加入兩倍體積DMEM培養(yǎng)液（含100 mL/L FBS, 1×105U/L青霉素, 1×105 U/L鏈霉素)，1000 r/min，離心10 min，傾去上層脂肪及上清，基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞, 接種至25 cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi), 種植密度1.5×104/cm2. 在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),3 d后換液，觀察原代細(xì)胞的生長(zhǎng). 細(xì)胞融合達(dá)90%時(shí)用2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代.
1.2.2ADSCs的成骨誘導(dǎo)在第1次換液時(shí)將部分細(xì)胞改為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液(基礎(chǔ)培養(yǎng)液加10 nmol/L地塞米松，10 mmol/L β甘油磷酸鈉，50 mg/L抗壞血酸［1］)培養(yǎng). 細(xì)胞融合達(dá)90%時(shí)用2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代.
1.2.3ALP活性測(cè)定將第2代ADSCs以5×103/孔的密度接種于96孔板中,成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)0，3，6，9，12，15 d后,PBS漂洗,加入50 μL細(xì)胞裂解液4℃過(guò)夜, ALP活性測(cè)定試劑盒檢測(cè)ALP活性.
1.2.4茜素紅染色取成骨誘導(dǎo)1 wk的細(xì)胞爬片培養(yǎng)1 wk,PBS沖洗3遍，950 mL/L乙醇固定10 min，蒸餾水沖洗3次，1 g/L茜素紅于37℃染色30 min，蒸餾水沖洗，干燥，封片.
1.2.5松質(zhì)骨支架的制備取市售牛股骨，將股骨頭松質(zhì)骨加工成直徑10 mm，厚2 mm的骨片. 將骨片置入1∶1的甲醇∶氯仿100 mL中脫脂24 h，12 h換液1次，蒸餾水沖洗. 將脫脂后的骨片置入300 mL/L H2O2 100 mL中脫蛋白48 h，每12 h換液1次. 蒸餾水沖洗. 將脫脂、脫蛋白后的骨片置入0.6 mol/L的HCL中脫鈣5 min，蒸餾水沖洗. 將脫脂、脫蛋白、脫鈣后的松質(zhì)骨片低溫晾干，密封包裝，Co60滅菌備用. 種植細(xì)胞前將成品松質(zhì)骨無(wú)菌條件下PBS液中浸泡7 d，分別在基礎(chǔ)培養(yǎng)液和誘導(dǎo)培養(yǎng)液中浸泡3 d.
1.2.6細(xì)胞的種植及檢測(cè)將ADSCs和成骨誘導(dǎo)15 d的ADSCs用2.5 g/L胰蛋白酶消化，離心，分別用基礎(chǔ)培養(yǎng)液和誘導(dǎo)培養(yǎng)液懸浮,調(diào)整細(xì)胞密度至1×1010/L. 將基礎(chǔ)培養(yǎng)液和誘導(dǎo)培養(yǎng)液中浸泡的松質(zhì)骨支架轉(zhuǎn)移至24孔培養(yǎng)板中，分別種植上述細(xì)胞懸浮液100 μL，置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)6 h使細(xì)胞貼壁，然后分別加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液及誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng). 將復(fù)合后培養(yǎng)5 d的細(xì)胞支架復(fù)合物固定，干燥，噴金，掃描電鏡觀察. 復(fù)合培養(yǎng)7 d后手術(shù)植入顱骨缺損部位.
1.2.7動(dòng)物分組及處理將12只大白兔按0.2 mL/kg速眠新麻醉，取雙側(cè)顱骨直徑10 mm鉆孔，24孔分為4組，每組6孔. ① 支架+成骨誘導(dǎo)ADSCs（A組）；② 支架+ADSCs（B組）；③ 單純支架（C組）；④ 對(duì)照組（D組）. A，B組植入上述成骨誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)的脂肪源性干細(xì)胞復(fù)合異種松質(zhì)骨支架，所用細(xì)胞均為自體細(xì)胞；C組植入單純的松質(zhì)骨支架，為前述松質(zhì)骨成品PBS液中浸泡7 d，9 g/L NaCl溶液中浸泡3 d后植入；D組不做處理. 術(shù)前術(shù)后肌注慶大霉素，2萬(wàn)U/kg. 術(shù)后14 wk用過(guò)量戊巴比妥鈉麻醉處死動(dòng)物，取材，X線攝片，計(jì)算成骨面積，HE染色行組織學(xué)分析.
統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)據(jù)以x±s表示,應(yīng)用SPSS醫(yī)用統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行OneWay ANOVA檢驗(yàn). P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.
2結(jié)果
2.1細(xì)胞培養(yǎng)原代脂肪源性干細(xì)胞呈梭形，在β甘油磷酸鈉，地塞米松，抗壞血酸的誘導(dǎo)下，能向成骨方向分化（圖 1A）. 誘導(dǎo)2 wk后茜素紅染色陽(yáng)性，提示有鈣結(jié)節(jié)形成(圖1B). ALP活性檢測(cè)結(jié)果顯示，成骨誘導(dǎo)6 d后，支架+成骨誘導(dǎo)ADSCs組與對(duì)照組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，表1），支架+成骨誘導(dǎo)ADSCs組的ALP活性明顯高于單純支架組.表1不同時(shí)期對(duì)照組和成骨誘導(dǎo)組堿性磷酸酶含量
