時(shí)間：2023-06-02 09:57:21
開(kāi)篇：寫(xiě)作不僅是一種記錄，更是一種創(chuàng)造，它讓我們能夠捕捉那些稍縱即逝的靈感，將它們永久地定格在紙上。下面是小編精心整理的12篇核酸檢測(cè)方法，希望這些內(nèi)容能成為您創(chuàng)作過(guò)程中的良師益友，陪伴您不斷探索和進(jìn)步。
關(guān)鍵詞：禽流感病毒；H5N1；多重RT-PCR；檢測(cè)
中圖分類(lèi)號(hào)：S854.43 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-273X（2013）04-0005-03
高致病性禽流感是一種嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的烈性傳染病，被OIE列為必須通報(bào)的傳染病[1]。禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）屬于正粘病毒科A型流感病毒屬，AIV除了可感染禽類(lèi)外，部分亞型還可感染人、豬、馬等。AIV基因組由包括基質(zhì)蛋白（M）基因、血凝素（HA）基因和神經(jīng)氨酸酶（NA）基因在內(nèi)的8個(gè)負(fù)鏈單股RN斷組成，其中M基因組序列高度保守，HA基因組變異性最強(qiáng)，NA基因組變異次之。HA基因和NA基因某些位點(diǎn)的變異可導(dǎo)致不同的HA亞型和NA亞型[1]，目前發(fā)現(xiàn)AIV有16個(gè)HA亞型和10個(gè)NA亞型，其中H5、H7亞型常表現(xiàn)為高致病性，除了給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失外[2]，還可感染人，甚至導(dǎo)致死亡[3]。目前，病毒分離、血清學(xué)試驗(yàn)仍是診斷AI和對(duì)AIV進(jìn)行定型普遍采用的方法，但病毒分離不僅操作繁瑣、復(fù)雜和耗時(shí)，難以對(duì)AI進(jìn)行快速診斷，還存在潛在散毒的危險(xiǎn)。PCR方法是一種基因體外擴(kuò)增技術(shù)，可以在數(shù)小時(shí)內(nèi)對(duì)某片斷基因擴(kuò)大數(shù)百萬(wàn)倍。該技術(shù)具有特異性強(qiáng)、敏感性高、檢測(cè)快速等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。多重分型PCR是一種特殊PCR形式，其最突出的特點(diǎn)是一次反應(yīng)可以達(dá)到既分型又能夠鑒定亞型的目的，在A、B、C三種流感及其他病源混合感染的鑒別診斷上具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)和很高的實(shí)用價(jià)值[4，5]。根據(jù)RT-PCR技術(shù)的原理，研究建立了鑒定H5、N1、M1的多重RT-PCR分型技術(shù)。
1 材料與方法
1.1 試驗(yàn)用材料
AIV H5N1抗原，購(gòu)自哈爾濱維科生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司；AIV H6N2、H9N2病毒以及新城疫病毒Lasota疫苗株（NDV）、雞減蛋綜合征病毒（EDSV）和傳染性支氣管炎病毒（IBV），本室留存。
1.2 生化試劑
Ex-Taq E、dNTP （25 mol/L，內(nèi)含Mg2+）、RNA酶抑制劑、反轉(zhuǎn)錄酶AMV、10×PCR buffer以及 DNA Marker DL2000 均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；RNA提取液購(gòu)自科登生物工程有限公司；0.1% DEPC水由本室自制；二甲基亞砜購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。
1.3 引物設(shè)計(jì)及合成
參考基因庫(kù)中禽流感病毒M基因、HA基因和NA基因序列，經(jīng)Clustalx序列軟件比對(duì)后，選擇在保守區(qū)域用Primer Primer5.0軟件設(shè)計(jì)了3對(duì)引物（表1）上述引物均由上海生工生物工程有限公司合成。
1.4 病毒RNA的提取
（1）1.5 mL離心管中加入120 μL RNA提取液和120 μL樣品，混勻，室溫放置5 min。
（2）加入120 μL -20℃預(yù)冷的氯仿，混勻，室溫放置3 min。
（3）12 000 r/min， 4 ℃離心5 min，取上清120 μL于另一離心管中，加120 μL -20℃預(yù)冷異丙醇，室溫放置5 min。
（4）12 000 r/min， 4 ℃離心10 min，棄上清，加入600 μL -20 ℃預(yù)冷75%乙醇，上下顛倒，12 000 r/min， 4 ℃離心5 min，棄上清。室溫放置約3 min近干燥。
（5）加20 μL 0.1% DEPC處理過(guò)的水溶解沉淀RNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.5 多重RT-PCR
采用總體積為50 μL的多重PCR反應(yīng)體系，即10×PCR buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTP混合液5 μL，40 U/μL的Rnase Inhibitor 1 μL，5 U/μL的Taq E 1 μL，反轉(zhuǎn)錄酶（AMV）1 μL，二甲基亞砜3 μL，10 pM/μL的 M1、N1、H5基因的上下游引物各0.5 μL，提取的病毒RNA模板1 μL，最后加0.1% DEPC處理過(guò)的水補(bǔ)足至50 μL。振蕩離心混勻后，在PCR儀上設(shè)定程序進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)對(duì)反轉(zhuǎn)錄條件及多重PCR變性、退火、延伸的溫度和時(shí)間以及循環(huán)次數(shù)等的優(yōu)化，最終確定其反應(yīng)參數(shù)為50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min，94 ℃預(yù)變性2 min后，進(jìn)入94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共循環(huán)35次，然后72 ℃延伸8 min，于12 ℃結(jié)束多重PCR擴(kuò)增。
1.6 PCR產(chǎn)物分析
取7 μL多重PCR產(chǎn)物與2 μL Loading Buffer上樣緩沖液混合，在1.5%瓊脂糖凝膠上以100 V電壓進(jìn)行電泳28 min，然后置數(shù)碼凝膠系統(tǒng)觀(guān)察拍照，分析記錄結(jié)果。
回收、純化229、380、878 bp的cDNA擴(kuò)增片段，送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，并用DNAStar基因分析軟件分析測(cè)序結(jié)果。
1.7 H5N1多重RT-PCR 敏感性試驗(yàn)
用建立的多重RT-PCR 反應(yīng)體系對(duì)10倍系列稀釋的禽流感H5N1抗原進(jìn)行檢測(cè)，檢驗(yàn)該體系對(duì)各稀釋度抗原模板的敏感度。
1.8 委托樣本的檢測(cè)
用建立的多重RT-PCR 反應(yīng)體系對(duì)5份已知AIV H9樣本、1份已知AIV H6樣本和360份禽咽肛拭子盲樣進(jìn)行檢測(cè)，與出口檢疫正式采用的熒光RT-PCR檢測(cè)方法比較。
2 結(jié)果
2.1 多重RT-PCR特異性試驗(yàn)
經(jīng)多重RT-PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物與DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)比較，顯示H5N1抗原擴(kuò)增出380、878、229 bp3條帶，而H6N2、H9N2病毒僅擴(kuò)增出M1cDNA1條帶，NDV、IBV、EDSV則無(wú)條帶呈陰性，與理論預(yù)期值一致（圖1）。
2.2 H5N1多重RT-PCR敏感性試驗(yàn)
對(duì)禽流感H5抗原做HA試驗(yàn)，病毒滴度為1：256。抗原分別做10倍系列稀釋?zhuān)?0-1、10-2、10-3倍抗原稀釋液多重RT-PCR檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性；抗原做10-4及以上倍數(shù)稀釋?zhuān)嘀豏T-PCR檢測(cè)結(jié)果陰性。敏感度試驗(yàn)表明，多重RT-PCR 對(duì)抗原的最低檢測(cè)稀釋度為10-3，是一種較為靈敏的檢測(cè)方法（圖2）。
2.3 委托樣本的檢測(cè)
5份已知AIV H9樣本、1份已知AIV H6樣本檢測(cè)結(jié)果顯示，僅擴(kuò)增出229 bp M1cDNA1條帶，360份禽咽肛拭子樣本則無(wú)條帶呈陰性，與熒光RT-PCR 方法檢測(cè)結(jié)果一致，符合率達(dá)100%，說(shuō)明該多重RT-PCR方法可以用于基層動(dòng)物防疫和監(jiān)督部門(mén)的檢測(cè)。
3 討論
AIV H5亞型不僅感染家禽，引起大批死亡，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，還可感染其他動(dòng)物和人，有重要的公共衛(wèi)生意義。傳統(tǒng)的病毒分離和血清學(xué)試驗(yàn)無(wú)法對(duì)流行的AIV亞型進(jìn)行快速檢測(cè)鑒別。本試驗(yàn)根據(jù)AIV 基因易變異的特性及多重分型PCR引物設(shè)計(jì)原則，參考基因庫(kù)中AIV HA基因、NA基因和M基因序列，分別針對(duì)H5、N1和M1基因設(shè)計(jì)了3對(duì)特異性引物，其中M1（S，A）是A型流感的通用引物。而H5、N1為分別針對(duì)H5、N1亞型的特異性引物，能夠分別特異性地檢測(cè)相對(duì)應(yīng)的亞型。利用這3對(duì)引物，通過(guò)對(duì)多重RT-PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化，建立了快速檢測(cè)鑒定AIV H5亞型的多重RT-PCR分型技術(shù)。
該多重RT-PCR分型方法檢測(cè)結(jié)果顯示，AIV H5N1在380、878、229 bp位置同時(shí)出現(xiàn)3條cDNA擴(kuò)增帶，而H6N2、H9N2病毒僅擴(kuò)增出M1 cDNA 1條帶，傳染性支氣管炎病毒、新城疫Lasota疫苗株（NDV）和減蛋綜合征病毒則呈陰性。多重RT-PCR 敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，H5N1抗原最低檢測(cè)稀釋度為10-3。H5亞型特異性試驗(yàn)結(jié)果表明，僅H5呈陽(yáng)性，其他H6、H9亞型和NDV、IBV、EDSV均呈陰性。對(duì)所擴(kuò)增片段進(jìn)行回收、純化并測(cè)序，其測(cè)序結(jié)果經(jīng)DNAStar基因分析軟件分析，這些片段分別與AIV HA基因、NA基因和M基因有著高度同源性，提示這些擴(kuò)增基因的序列與原參考序列的基因來(lái)源一致，即分別來(lái)源于AIV的H5亞型HA基因、NA基因和M基因，表明該多重RT-PCR分型方法具有高度特異性。
同時(shí)，該多重RT-PCR分型法不需要進(jìn)行多次PCR擴(kuò)增，在數(shù)小時(shí)內(nèi)就可完成對(duì)AIV H5亞型的快速檢測(cè)鑒別，能夠在分型同時(shí)一步鑒定到亞型，達(dá)到快速診斷和鑒別AIV的雙重目的，對(duì)及時(shí)有效控制AIV感染有重要意義，對(duì)AIV H5亞型感染制定有效的防制措施具有實(shí)用價(jià)值和指導(dǎo)意義。
參考文獻(xiàn)：
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關(guān)鍵詞：豬傳染性胃腸炎；病毒分子；生物學(xué)檢測(cè)方法
中圖分類(lèi)號(hào) S858.28 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2016）12- 0110-02
豬傳染性胃腸炎（TGE）是由豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）導(dǎo)致豬出現(xiàn)脫水、水樣腹瀉以及嘔吐等為主要臨床癥狀的高度傳染性疾病，該病在春季、初秋以及冬季具有較高的發(fā)病率[1]。豬傳染性胃腸炎最早發(fā)生于美國(guó)，隨后在世界各地均有發(fā)生，我國(guó)于20世紀(jì)50年代首次發(fā)現(xiàn)該病，目前全國(guó)大部分地區(qū)均發(fā)生過(guò)豬傳染性胃腸炎。不同日齡和品種的豬均可以感染傳染性胃腸炎，其中以15日齡左右的仔豬發(fā)病后死亡率最高，高達(dá)100%；5周齡以上的仔豬感染傳染性胃腸炎后死亡率較低，但是會(huì)影響仔豬后期的生長(zhǎng)，降低仔豬的飼料利用率。目前，該病已被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織列為B類(lèi)必檢傳染性疾病。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，該技術(shù)已經(jīng)廣泛用于各種細(xì)菌性和病毒性疾病的檢測(cè)[2]。本文綜述了分子生物學(xué)技術(shù)在傳染性胃腸炎中的應(yīng)用，以期能為從事傳染性胃腸炎診斷和防控的工作者提供幫助。
1 傳染性胃腸炎病毒基因組結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)方式
1.1 TGEV基因組結(jié)構(gòu) 傳染性胃腸炎病毒屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，該病毒的基因組不分節(jié)段、單股正股RNA，具有高度傳染性。傳染性胃腸炎基因組全序列分為7個(gè)區(qū)29kb，結(jié)構(gòu)序列為5'-la-lb-S-3a-3b-sM-M-N-7-3'，并且該基因組的3'-末端以共價(jià)鍵結(jié)合的poly結(jié)構(gòu)，5'末端有帽結(jié)構(gòu)[3]。基因組1約有20kb，主要負(fù)責(zé)病毒的編碼，其余基因均在近3'端。傳染性胃腸炎病毒全基因組編碼由4種結(jié)構(gòu)蛋白和3種非結(jié)構(gòu)蛋白組成，其中基因7、基因3和基因1為非結(jié)構(gòu)蛋白，N、M、sM、S為傳染性胃腸炎的結(jié)構(gòu)蛋白。
1.2 基因表達(dá)方式 傳染性胃腸炎病毒在胞漿脫殼以后，其正鏈RNA就呈現(xiàn)了mRNA的功能，使基因1轉(zhuǎn)錄表達(dá)RNA聚合酶，同時(shí)該基因有作為模板合成負(fù)鏈RNA，進(jìn)而親代RNA與負(fù)鏈RNA形成雙鏈復(fù)制中間體。因此，在感染傳染性胃腸炎病毒的細(xì)胞內(nèi)，可以檢測(cè)出不完全RNA、基因組RNA、mRNA以及雙鏈中間體4個(gè)特異性RNA，這可以作為豬傳染性胃腸炎病毒分子生物學(xué)檢測(cè)指標(biāo)之一[4]。
2 結(jié)構(gòu)蛋白及功能
豬傳染性胃腸炎病毒的結(jié)構(gòu)蛋白主要為S糖蛋白、M蛋白、N蛋白以及sM蛋白等。S蛋白是豬傳染性胃腸炎病毒纖突的主要成分之一，在病毒粒子的表面，該蛋白基因全長(zhǎng)4.3kb，蛋白分子量為195～220ku；S蛋白不僅是決定豬傳染性胃腸炎病毒抗原的重要結(jié)構(gòu)，也影響著病毒對(duì)細(xì)胞的致病性、親嗜性等。M蛋白是構(gòu)成病毒粒子蛋白的主要有效成分之一，研究表明[5]，M蛋白前體是由膜外區(qū)、信號(hào)肽、極性區(qū)、跨膜區(qū)突于病毒粒子內(nèi)C-端區(qū)等功能區(qū)域構(gòu)成，分子質(zhì)量為29～31ku；M蛋白不僅決定了病毒粒子的出芽位點(diǎn)和裝配位點(diǎn)，也可以影響病毒變異。N蛋白是一種酸性蛋白質(zhì)，分子量為47KDa，含有382個(gè)氨基酸殘基，該蛋白不僅是豬傳染性胃腸炎病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，同時(shí)對(duì)病毒基因組的加工、復(fù)制都具有重要作用。sM蛋白分子質(zhì)量為78ku，含有1種小膜蛋白和82個(gè)氨基酸殘基，該功能蛋白在抗豬傳染性胃腸炎病毒感染的體液和細(xì)胞免疫中具有重要作用。
3 分子生物學(xué)檢測(cè)方法
3.1 核酸探針 核酸探針檢測(cè)方法的基本原理是利用核苷酸堿基互補(bǔ)，在堿基互補(bǔ)過(guò)程中，采用標(biāo)記物標(biāo)記與被檢測(cè)靶序列互補(bǔ)的單鏈核酸分子，進(jìn)而檢測(cè)到目的核序列。該檢測(cè)方法與掃描電鏡、熒光抗體試驗(yàn)、病毒分離等相比，具有較好的特異性，并且可以實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)的目的。現(xiàn)代研究表明[6]，不同的病毒探針可以分別擴(kuò)增出與其對(duì)應(yīng)的病毒模板，對(duì)其他病毒模板影響不大，同時(shí)核酸探針擴(kuò)增的最低檢測(cè)限為3 000～6 000個(gè)拷貝的單個(gè)病毒核酸，具有較高的特異性和敏感性。
3.2 普通RT-PCR方法 該檢測(cè)方法使用的首要條件是知道被檢測(cè)病原的相關(guān)目的基因序列，根據(jù)相關(guān)目的序列后，采用相關(guān)軟件設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，然后進(jìn)行體外擴(kuò)增目的基因，進(jìn)而達(dá)到檢測(cè)的目的。王黎等[7]采用RT-PCR方法檢測(cè)豬傳染性胃腸炎病毒，并采用相同濃度做重復(fù)性檢測(cè)，結(jié)果顯示RT-PCR擴(kuò)增的特異性條帶為590bp左右；然后又以豬瘟病毒、豬細(xì)小病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬偽狂犬病病毒以及豬輪狀病毒做特異性試驗(yàn)，結(jié)果顯示僅有豬傳染性胃腸炎病毒得到了特異性目的條帶，所以RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)豬傳染性胃腸炎病毒檢測(cè)具有較好的重復(fù)性和特異性。
3.3 多重RT-PCR方法 多重RT-PCR檢測(cè)方法是以普通PCR為基礎(chǔ)發(fā)展的一種新型檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法可以在一個(gè)PCR反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物，并通過(guò)采用優(yōu)化后的PCR反應(yīng)條件，達(dá)到同時(shí)檢測(cè)多種病原的目的，具有快速、成本低等優(yōu)點(diǎn)，目前也常用于各種疾病的診斷。霍金耀等[8]建立了多重RT-PCR法檢測(cè)傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、嵴病毒和A群輪狀病毒的方法，并對(duì)該檢測(cè)方法進(jìn)行了敏感性試驗(yàn)和特異性試驗(yàn)，結(jié)果顯示，多重RT-PCR法可以檢測(cè)出50TCID50的混合病毒，且能擴(kuò)增出長(zhǎng)度為275bp、544bp、750bp的3條特異性片段，具有較高的特異性和敏感性，可以在臨床上推廣使用。
3.4 套式PCR方法 套式PCR方法需要設(shè)計(jì)內(nèi)、外2對(duì)引物，并通過(guò)2次擴(kuò)增對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，該方法相對(duì)其他PCR檢測(cè)方法，具有較高的敏感性，且節(jié)約成本。現(xiàn)代研究表明，PCR技術(shù)在檢測(cè)病毒時(shí)，可以省略不同病毒分離的過(guò)程，具有較高的敏感性和特異性，而套式PCR方法在病毒粒子較少的情況下依然能夠檢測(cè)出，表明套式PCR比常規(guī)PCR具有更好的敏感性。沈海娥等[9]采用套式PCR檢測(cè)豬呼吸道冠狀病毒和豬傳染性胃腸炎病毒的S基因序列，根據(jù)兩組病毒的基因序列分別設(shè)計(jì)了2對(duì)引物，然后分別以豬呼吸道冠狀病毒細(xì)胞和豬傳染性胃腸炎病毒細(xì)胞為模板進(jìn)行套式PCR特異性片段擴(kuò)增，結(jié)果顯示，豬呼吸道冠狀病毒擴(kuò)增的基因片段為214bp，豬傳染性胃腸炎病毒擴(kuò)增的基因片段為886bp，同時(shí)檢測(cè)出了這種病毒，具有較高的特異性和敏感性。
3.5 熒光定量RT-PCR方法 熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的原理是在PCR反應(yīng)體系中采用熒光探針標(biāo)記法或加入了SYBR GreenI熒光染料標(biāo)記PCR的反應(yīng)產(chǎn)物，然后使用反應(yīng)儀器收集反應(yīng)產(chǎn)物的熒光信號(hào)，并根據(jù)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱確定產(chǎn)物的量，進(jìn)而達(dá)到與起始模板準(zhǔn)確定量的目的。該檢測(cè)方法與常規(guī)RT-PCR相比，不需要進(jìn)行電泳試驗(yàn)檢測(cè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物，反應(yīng)結(jié)果更為直觀(guān)、方便，同時(shí)又避免了因電泳試驗(yàn)對(duì)環(huán)境造成污染。王建中等[10]根據(jù)豬傳染性胃腸炎病病毒的S基因序列設(shè)計(jì)了引物，并通過(guò)多組試驗(yàn)對(duì)熒光定量RT-PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示，優(yōu)化后的檢測(cè)方法對(duì)其他病原的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，檢測(cè)結(jié)果的敏感性高達(dá)43.07拷貝/μL，是常規(guī)PCR檢測(cè)方法的100倍，具有較高的敏感性和特異性。
3.6 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是近幾年新興的一種分子生物學(xué)檢測(cè)方法，因其具有特異性強(qiáng)、敏感性高、檢測(cè)速度以及操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于病毒病和細(xì)菌病檢測(cè)。高睿澤等[11]根據(jù)豬傳染性胃腸炎病毒的N基因建立了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)方法，并對(duì)該檢測(cè)方法的敏感性和特異性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，該方法在63℃下可以使豬傳染性胃腸炎病毒N基因獲得較高的特異性擴(kuò)增，且與豬流行性腹瀉病毒等物交叉反應(yīng)，具有加高的特異性；同時(shí)該檢測(cè)方法可以檢測(cè)到131.4fg/μL的DNA，其靈敏度比常規(guī)PCR高出3個(gè)數(shù)量級(jí)。
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關(guān)鍵詞：食品安全；現(xiàn)代檢測(cè)技術(shù)；食品檢測(cè)
1引言
近年來(lái)，食品安全問(wèn)題逐漸成為全球關(guān)注的焦點(diǎn)之一。危及人類(lèi)健康和生命安全的重大食品安全事件屢屢發(fā)生，從歐州的瘋牛病、二惡英到我國(guó)的蘇丹紅、瘦肉精和三聚氰胺等令人防不勝防。新技術(shù)的發(fā)展、農(nóng)用化學(xué)品的濫用，養(yǎng)殖業(yè)的不規(guī)范用藥以及環(huán)境的污染等都是造成食品安全問(wèn)題的原因，因此加強(qiáng)食品安全檢測(cè)是解決食品安全的重要措施。傳統(tǒng)的食品檢測(cè)方法已不能滿(mǎn)足人們對(duì)食品安全的需求，因此，新的檢測(cè)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。現(xiàn)代食品檢測(cè)技術(shù)主要通過(guò)儀器分析、分子生物學(xué)等方式對(duì)食品進(jìn)行科學(xué)檢測(cè)，能夠?qū)κ称分泻械挠泻ξ镔|(zhì)、微生物及食品轉(zhuǎn)基因等問(wèn)題進(jìn)行檢測(cè)，從而及時(shí)采取合理措施對(duì)問(wèn)題食品進(jìn)行處理，保障社會(huì)中食品使用的安全。
2現(xiàn)代檢測(cè)技術(shù)
2.1熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)
熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)是在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上運(yùn)用熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)，把核酸擴(kuò)增、雜交、檢測(cè)等技術(shù)結(jié)合在一起，在PCR指數(shù)擴(kuò)增期間通過(guò)連續(xù)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱來(lái)即時(shí)測(cè)定特異性產(chǎn)物的量，據(jù)此計(jì)算待檢樣品中目的基因的拷貝數(shù)。熒光定量PCR標(biāo)記的方法由最初單一的染料法，發(fā)展到特異性更高的探針?lè)ā?/p>
熒光定量PCR技術(shù)自產(chǎn)生以來(lái)，經(jīng)過(guò)不斷的發(fā)展完善，已廣泛應(yīng)用于食品中致病微生物的檢測(cè)。李光偉等[1]采用沙門(mén)氏菌fimY基因序列，設(shè)計(jì)特異引物和探針，建立了檢測(cè)食品中沙門(mén)氏菌的熒光定量PCR檢測(cè)方法。胡建華等[2]根據(jù)GenBank公布的志賀氏菌ipaH基因的保守序列設(shè)計(jì)特異性引物，篩選合適的DNA 模板制備方法，以熒光定量PCR檢測(cè)方法與常規(guī)PCR檢測(cè)方法結(jié)合，檢測(cè)培養(yǎng)液和牛奶陽(yáng)性樣品中的志賀菌目。
同時(shí)，熒光定量PCR技術(shù)是檢測(cè)轉(zhuǎn)基因食品最可靠、最快捷的方法，基于轉(zhuǎn)基因特異DN段的熒光定量PCR篩選方法已被一些國(guó)家作為相關(guān)食品法規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法。吳志毅等[3]采用普通PCR法和熒光定量PCR法對(duì)Bt63轉(zhuǎn)基因大米的檢測(cè)靈敏度進(jìn)行對(duì)比研究。根據(jù)大米內(nèi)源蔗糖磷酸合成酶基因SPS和結(jié)構(gòu)特異性基因Btc的基因序列，選用特異性的引物和探針進(jìn)行研究，經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)表明具有專(zhuān)一性，能用于品系鑒定。在靈敏度試驗(yàn)中，陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因大米按照不同質(zhì)量百分比進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)崛NA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明：普通PCR檢測(cè)的靈敏度在0.1%左右，而熒光定量PCR檢測(cè)的靈敏度為0.01%，是普通PCR檢測(cè)的10倍以上。
2.2核酸探針檢測(cè)技術(shù)
核酸探針檢測(cè)技術(shù)的原理是堿基配對(duì)、互補(bǔ)的兩條核酸單鏈通過(guò)退火形成雙鏈，這一過(guò)程稱(chēng)為核酸雜交。核酸探針是指帶有標(biāo)記物的已知序列的核酸片段，它能和與其互補(bǔ)的核酸序列雜交，形成雙鏈，所以可用于待測(cè)核酸樣品定基因序列的檢測(cè)。每一種病原體都有獨(dú)特的核酸片段，通過(guò)分離和標(biāo)記這些片段就可制備出探針，用于疾病的診斷及食品安全等研究，該技術(shù)具有特異性好、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。
在食品檢測(cè)中，核酸探針檢測(cè)技術(shù)主要用于致病性病原菌的檢測(cè)。核酸探針可用于檢測(cè)任何特定的病原微生物，并能鑒別密切相關(guān)的毒株，因此可廣泛應(yīng)用于進(jìn)出口動(dòng)物性食品的檢驗(yàn)，包括沙門(mén)氏菌、彎桿菌、輪狀病毒、狂犬病毒等多種病原體[4]。但核酸探針技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中仍存在一些問(wèn)題，如放射性同位素標(biāo)記的核酸探針半衰期短，對(duì)人體有危害，操作技術(shù)復(fù)雜，使用費(fèi)高等缺點(diǎn)，所以多作為實(shí)驗(yàn)室診斷手段。
2.3酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)
ELISA是一種把抗原和抗體的特異性免疫反應(yīng)和酶的高效催化作用有機(jī)結(jié)合起來(lái)的檢測(cè)技術(shù)。基本原理是，使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí)，把受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開(kāi)，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺刊物定性或定量分析。
ELISA已廣泛應(yīng)用于食品安全檢測(cè)的各個(gè)領(lǐng)域。在致病微生物檢測(cè)方面姚斐等[5]用間接ELISA可快速有效檢測(cè)出活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的大腸桿菌O157：H7。此外，采用Dot-ELISA檢測(cè)沙門(mén)氏菌，耗時(shí)短，比傳統(tǒng)方法快4～6d，這都表明了ELISA可以快速的檢測(cè)出食品中的致病微生物。
在農(nóng)藥殘留檢測(cè)方面，余向陽(yáng)等[6]以辣根過(guò)氧化物酶對(duì)兔抗擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥抗體進(jìn)行標(biāo)記，建立了檢測(cè)蔬菜中多種擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥的直接競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA方法，用該方法對(duì)南京市場(chǎng)107個(gè)樣品檢測(cè)的陽(yáng)性檢出率明顯高于氣相色譜法。賀亮[6]建立了直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)磺胺二甲嘧啶殘留方法，該方法最小檢出量為1.97ng/mL，檢測(cè)范圍5～200ng/mL。現(xiàn)已開(kāi)發(fā)的商業(yè)化酶聯(lián)免疫ELISA檢測(cè)試劑盒，可快速定性、定量檢測(cè)動(dòng)物組織、雞蛋、蜂蜜、牛奶、血清等樣品中磺胺間甲氧嘧啶（SMM）、磺胺嘧啶（SD或SDZ）、磺胺甲惡唑（SMZ）、磺胺噻唑（ST）藥物的殘留量。
ELISA已用于檢測(cè)食品中毒素。黃曲霉毒素是一種致癌性很強(qiáng)的真菌毒素，各國(guó)都嚴(yán)格限制其在食品中的含量，其中B1的毒性最強(qiáng)。蔣建云等[7]利用ELISA法的AFB1試劑盒，通過(guò)抗黃曲霉毒素B1抗體與酶標(biāo)抗原、待測(cè)抗原的競(jìng)爭(zhēng)免疫反應(yīng)以及酶的催化顯色反應(yīng)相結(jié)合來(lái)檢測(cè)黃曲霉毒素B1的含量。該方法具有分析速度快，提取和純化步驟簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確度高、成本低、污染少，一次可測(cè)定大批量標(biāo)本等優(yōu)點(diǎn)。
2.4高效液相色譜～質(zhì)譜連用技術(shù)
HPLC-MS技術(shù)是將液相色譜與質(zhì)譜串聯(lián)成為一個(gè)整機(jī)使用的檢測(cè)技術(shù)，它以液相色譜作為分離系統(tǒng)，質(zhì)譜為檢測(cè)系統(tǒng)。樣品在質(zhì)譜部分和流動(dòng)相分離，被離子化后，經(jīng)質(zhì)譜的質(zhì)量分析器將離子碎片按質(zhì)量數(shù)分開(kāi)，經(jīng)檢測(cè)器得到質(zhì)譜圖。液質(zhì)聯(lián)用體現(xiàn)了色譜和質(zhì)譜優(yōu)勢(shì)的互補(bǔ)，將色譜對(duì)復(fù)雜樣品的高分離能力，與MS具有高選擇性、高靈敏度及能夠提供相對(duì)分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來(lái)，在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。
HPLC-MS技術(shù)在食品安全方面的應(yīng)用主要集中在食品中農(nóng)藥、獸藥殘留和非法添加物的檢測(cè)。王鳳池[8]建立了通過(guò)固相萃取（SPE）-HPLC-MS/MS技術(shù)同時(shí)測(cè)定腸衣品中8種硝基咪哇類(lèi)藥物殘留量的方法。樣品經(jīng)乙酸乙醋提取，經(jīng)SCX固相萃取柱凈化后，通過(guò)HPLC-MS/MS測(cè)定，8種分析物在0.1、0.5和1μg/kg 3個(gè)水平的回收率在87.3%～117%之間，重復(fù)性在3.35%～10.1%，8種分析物的檢出限為0.049～0.083μg/kg。黃芳等[9]建立了食品中三聚氰胺的高效液相色譜-質(zhì)譜測(cè)定方法，用Kromasil C18 柱（4.6mm×250mm，5μm），流動(dòng)相為5%乙腈：95%水（含0.1%甲酸），采用正離子模式的電噴霧質(zhì)譜檢測(cè)，線(xiàn)性范圍為0.01～0.5mg/L，檢出限0.01mg/L，回收率為80%～99%。
2.5近紅外光譜技術(shù)
現(xiàn)代近紅外光譜技術(shù)是將光譜測(cè)量技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、化學(xué)計(jì)量學(xué)技術(shù)與基礎(chǔ)測(cè)試技術(shù)有機(jī)結(jié)合，以無(wú)損檢測(cè)為優(yōu)勢(shì)的分析技術(shù)。近紅外光是介于可見(jiàn)光和中紅外光之間的電磁波，近紅外光譜區(qū)與被測(cè)物質(zhì)中O-H、N-H、C-H 及S-H 等含氫基團(tuán)的分子內(nèi)部原子間振動(dòng)的倍頻和合頻的吸收區(qū)一致，通過(guò)掃描樣品的近紅外光譜，能得到其中有機(jī)分子含氫基團(tuán)的特征信息[10]。不同物質(zhì)在近紅外光譜區(qū)因成分不同而存在特定的吸收特征，這為近紅外光譜定量或定性分析物質(zhì)提供了理論依據(jù)。
近紅外光譜技術(shù)具有無(wú)損性、前處理操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)成本低、反應(yīng)迅速等特點(diǎn)使其在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用日益廣泛。Kawasaki等[11]構(gòu)建了基于近紅外光譜技術(shù)的牛奶品質(zhì)檢測(cè)模型，該模型可較好地檢測(cè)牛奶的各項(xiàng)理化指標(biāo)，評(píng)價(jià)牛奶的品質(zhì)。屠振華等[12]運(yùn)用近紅外光譜技術(shù)，結(jié)合模式識(shí)別法對(duì)蜂蜜摻假進(jìn)行了識(shí)別分析，分別采用偏最小二乘判別分析、獨(dú)立軟模式法等方法進(jìn)行蜂蜜摻假識(shí)別模型的建立和樣品檢測(cè)，結(jié)果表明該方法的正確判別率達(dá)100%。Liu等[13]采用表面增強(qiáng)拉曼光譜建立了蘋(píng)果和番茄表面西維因、亞胺硫磷、谷硫磷殘留的檢測(cè)方法，采用偏最小二乘法和主成分分析法建立這3種農(nóng)藥的定性和定量模型對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行校正處理，處理后西維因、亞胺硫磷和谷硫磷這3種農(nóng)藥在蘋(píng)果上的檢出限分別為4.51、6.51、6.66mg/mL，在番茄上的檢測(cè)限分別可達(dá)5.35、2.91、2.94mg/mL，方法回收率可達(dá)78%～124%，所建立的方法可以有效檢測(cè)水果和蔬菜中的農(nóng)藥殘留。
3結(jié)語(yǔ)
隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們生活水平的提高，食品安全越來(lái)越受到大家的關(guān)注。食品安全關(guān)乎國(guó)計(jì)民生，政府機(jī)構(gòu)應(yīng)制定切實(shí)可行的食品安全政策法規(guī)，建立健全市場(chǎng)監(jiān)管機(jī)制，加強(qiáng)消費(fèi)者的食品安全意識(shí)。同時(shí)，必須大力發(fā)展食品安全檢測(cè)技術(shù)，完善檢測(cè)體系，為食品的安全和品質(zhì)監(jiān)管作出更大的貢獻(xiàn)。
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2009年，我國(guó)各行各業(yè)人士都在為抗擊甲型H1N1流感做著力所能及的事情，中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院的科研人員則為對(duì)抗甲流研制了核酸檢測(cè)生物傳感器。據(jù)團(tuán)隊(duì)負(fù)責(zé)人曾令文教授介紹，甲型H1N1流感是一種急性呼吸道傳染病，其病原體是一種新型的H1N1流感病毒，而核酸生物傳感器對(duì)這種病原體具有特異性的快速應(yīng)答效應(yīng)，非常適合用于初篩工作。
自此之后，曾令文團(tuán)隊(duì)便開(kāi)始致力于生物傳感器研究，不久前他們又成功開(kāi)發(fā)出了基于核酸等溫鏈置換反應(yīng)技術(shù)與膠體金技術(shù)的核酸檢測(cè)生物傳感器，研究成果已在英國(guó)皇家化學(xué)雜志《化學(xué)通訊》上發(fā)表。據(jù)曾令文教授介紹，新型的核酸檢測(cè)生物傳感器靈敏度高，一次反應(yīng)最低可以檢測(cè)出6個(gè)待檢核酸，同時(shí)特異性也很高，除了可以檢測(cè)特異性病原體核酸外，也能區(qū)分單核苷酸突變，且簡(jiǎn)單、快速，不需要復(fù)雜儀器支持，僅需30分鐘，肉眼就能見(jiàn)到所出的結(jié)果。
曾令文教授表示，核酸檢測(cè)生物傳感器適用于各種各樣的基因檢測(cè)，既能用于遺傳性疾病基因缺失突變檢測(cè)（如地中海貧血），也能進(jìn)行疾病和藥物易感基因檢測(cè)（如SNP檢測(cè)和耐藥檢測(cè)），還能用于癌癥基因突變檢測(cè)（如K-ras突變檢測(cè)），以及用于個(gè)體化治療基因檢測(cè)（如腫瘤個(gè)體化用藥指導(dǎo)）等。目前，該生物傳感器已經(jīng)在醫(yī)院進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，用它檢測(cè)出的結(jié)果與醫(yī)院常規(guī)檢測(cè)方法檢測(cè)出的一致。
任何科研成果的研發(fā)過(guò)程必定與困難相伴，核酸檢測(cè)生物傳感器同樣如此。曾令文團(tuán)隊(duì)在研發(fā)該生物傳感器過(guò)程中，就曾遇到特異性、交叉反應(yīng)以及檢測(cè)線(xiàn)不出線(xiàn)等問(wèn)題。他說(shuō)：“特異性是分子檢測(cè)方法中的重點(diǎn)，所以我們?cè)谠O(shè)計(jì)反應(yīng)體系中發(fā)夾結(jié)構(gòu)時(shí)，必須準(zhǔn)確設(shè)計(jì)莖與環(huán)的堿基比。因?yàn)椋?dāng)待檢測(cè)核酸存在時(shí)，待檢測(cè)核酸與環(huán)的結(jié)合力比其與莖的結(jié)合力強(qiáng)，才能把發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開(kāi)，所以環(huán)要足夠長(zhǎng)，但太長(zhǎng)又會(huì)降低反應(yīng)的特異性。為了解決這些問(wèn)題，我們進(jìn)行了無(wú)數(shù)次比對(duì)和實(shí)驗(yàn)。”
近年來(lái)，我國(guó)分子生物學(xué)技術(shù)有了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，并帶動(dòng)了整個(gè)生物科學(xué)的全面發(fā)展，與國(guó)際先進(jìn)水平之間的差距正在逐步縮小，甚至部分研究已經(jīng)處于國(guó)際領(lǐng)先水平。但曾令文教授認(rèn)為，我們還應(yīng)該在源頭創(chuàng)新方面不斷努力。他說(shuō)：“創(chuàng)新是科學(xué)的靈魂，對(duì)于分子生物學(xué)研究而言，除了了解學(xué)術(shù)動(dòng)態(tài)之外，我們還應(yīng)該解放思想，善于總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，并將經(jīng)驗(yàn)上升到理論層面，提高理論修養(yǎng)，增強(qiáng)分辨能力和表達(dá)能力，并敢于堅(jiān)持真理。”
此外，曾令文教授還表示，分子生物學(xué)的發(fā)展離不開(kāi)優(yōu)秀的團(tuán)隊(duì)，因此如何科學(xué)管理團(tuán)隊(duì)也顯得非常重要。“科研團(tuán)隊(duì)的管理是對(duì)知識(shí)生產(chǎn)過(guò)程中的社會(huì)活動(dòng)的管理，它不同于其他管理，科研活動(dòng)具有較大的靈活性和不確定性，科研管理是對(duì)以探索性、創(chuàng)造性為主的腦力勞動(dòng)的管理，工作過(guò)程中出現(xiàn)的問(wèn)題也是難以預(yù)測(cè)的。”曾令文教授認(rèn)為，只有富含創(chuàng)新熱情，擁有良好學(xué)習(xí)氛圍，有一定產(chǎn)出，且成員之間相互交流與合作的團(tuán)隊(duì)才能被稱(chēng)為優(yōu)秀團(tuán)隊(duì)。
目前，曾令文團(tuán)隊(duì)又瞄準(zhǔn)了人類(lèi)重大疾病分子診斷技術(shù)以及獸藥殘留、生物毒素和重金屬等食品安全和環(huán)境污染檢測(cè)技術(shù)的研究。他說(shuō)：“開(kāi)發(fā)人類(lèi)重大疾病分子診斷技術(shù)，有利于疾病診斷及指導(dǎo)臨床用藥。而食品安全及環(huán)境污染檢測(cè)技術(shù)關(guān)系到國(guó)計(jì)民生和人民健康，我們希望通過(guò)努力開(kāi)發(fā)出具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型分子診斷技術(shù)，為更多人的健康保駕護(hù)航。”
關(guān)鍵詞：現(xiàn)代 生物檢測(cè)技術(shù) 食品檢驗(yàn)
1.現(xiàn)代生物技術(shù)在食品檢驗(yàn)中應(yīng)用的意義
食品檢驗(yàn)檢測(cè)對(duì)于保障食品安全、促進(jìn)食品生產(chǎn)水平都起著及其重要的作用。長(zhǎng)期以來(lái)獲得廣泛應(yīng)用的物理、化學(xué)、儀器等檢測(cè)方法，由于存在某些局限，已不能滿(mǎn)足現(xiàn)代食品檢測(cè)的需要，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，人們已逐步認(rèn)識(shí)到生物技術(shù)在食品檢驗(yàn)中的重要作用及其意義。
生物技術(shù)檢測(cè)方法以自身獨(dú)特優(yōu)勢(shì)在食品檢驗(yàn)中顯示出巨大的應(yīng)用潛力，其應(yīng)用幾乎涉及到了食品檢驗(yàn)的各個(gè)方面，包括食品的品質(zhì)評(píng)價(jià)、質(zhì)量監(jiān)督、生產(chǎn)過(guò)程的質(zhì)量監(jiān)控及食品科學(xué)研究。
生物技術(shù)檢測(cè)方法不僅具有特異的生物識(shí)別功能、極高的選擇性，而且它可與現(xiàn)代的物理化學(xué)方法相結(jié)合，產(chǎn)生一些簡(jiǎn)單、結(jié)果精確、靈敏、專(zhuān)一、微量和快速、成本低廉的檢測(cè)方法，因此其在食品檢驗(yàn)中占有越來(lái)越重要的地位。
2.在食品檢驗(yàn)中應(yīng)用的幾種生物檢測(cè)技術(shù)
2.1 免疫法
免疫法是最靈敏的生物檢測(cè)方法，具有高特異性和高靈敏性（靈敏度可達(dá)1ppb，1ppm）、操作簡(jiǎn)便、再現(xiàn)性好，應(yīng)用前景看好。用免疫法可進(jìn)行蛋白質(zhì)檢測(cè)，由于不同蛋白質(zhì)的物理、化學(xué)性質(zhì)差別極小，只能通過(guò)各種免疫方法或標(biāo)記探針?lè)右詤^(qū)別。
2.1.1 熒光抗體法
將熒光抗體溶液滴加于固定的標(biāo)本上，一定時(shí)間后用緩沖液沖洗，若有相應(yīng)抗原存在，即與熒光抗體結(jié)合，在熒光顯微鏡下即可看到發(fā)熒光的抗體復(fù)合物。熒光抗體法在微生物污染鑒定中經(jīng)常使用，最常用于沙門(mén)氏菌的檢測(cè)。
2.1.2 放射免疫法
靈敏度高，但操作相對(duì)復(fù)雜，放射免疫法同位素半衰期短，保存及操作不便。目前應(yīng)用情況受到限制。
2.1.3 酶聯(lián)免疫吸附法
是一種基本的酶免疫檢測(cè)方法，其選擇性好、靈敏度高、快速、易操作、結(jié)果判斷客觀(guān)準(zhǔn)確、實(shí)用性強(qiáng)。酶免疫法和其他免疫法一樣，都是以抗體和抗原的特異性結(jié)合為基礎(chǔ)的。以酶或輔酶為標(biāo)記物，標(biāo)記抗原或抗體，用酶促反應(yīng)的放大作用來(lái)顯示初級(jí)免疫學(xué)反應(yīng)。
酶聯(lián)免疫吸附法除可檢測(cè)食品中的毒素、殘留農(nóng)藥及微生物外還可用于營(yíng)養(yǎng)素的測(cè)定。
2.1.4 凝集反應(yīng)法
當(dāng)有電解質(zhì)存在時(shí)，顆粒狀的抗原與其特異性的抗體結(jié)合并生成可見(jiàn)凝集塊的反應(yīng)稱(chēng)為凝集反應(yīng)，有直接反應(yīng)和間接反應(yīng)法。利用凝集反應(yīng)可測(cè)定抗體的效價(jià)，也可用于細(xì)菌、病毒等的分類(lèi)。
2.1.5 沉淀反應(yīng)法
沉淀反應(yīng)法常見(jiàn)的是一種瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)。單向擴(kuò)散是利用不同抗原抗體在瓊脂中不同的擴(kuò)散速度而會(huì)在瓊脂中出現(xiàn)幾條相互分離的沉淀帶。雙向擴(kuò)散則是利用抗原抗體都向中間層―――瓊脂擴(kuò)散而形成沉淀帶，根據(jù)分離沉淀帶的數(shù)量可確定抗原抗體種類(lèi)。
2.1.6 免疫擴(kuò)散法
利用蛋白質(zhì)在半固體基質(zhì)上的擴(kuò)散作用，使抗原和抗體在濃度比例合適的部位產(chǎn)生沉淀帶或沉淀環(huán)，從而檢測(cè)蛋白質(zhì)。如血清中IgG、IgA、IgM含量的測(cè)定。
2.1.7 免疫電泳法
免疫電泳法是將電泳和瓊脂擴(kuò)散沉淀反應(yīng)相結(jié)合的一種方法，即先將血清或蛋白質(zhì)抗原在瓊脂凝膠中進(jìn)行電泳。帶電的蛋白質(zhì)抗原向負(fù)極移動(dòng)，加入抗血清后，不同區(qū)點(diǎn)的抗原再與抗體進(jìn)行沉淀，當(dāng)相應(yīng)抗原抗體接觸，在適當(dāng)比例下形成弧形沉淀帶，根據(jù)沉淀帶的位置對(duì)蛋白質(zhì)的各組分進(jìn)行檢測(cè)。如免疫球蛋白含量的測(cè)定。
2.2 酶檢測(cè)法
酶檢測(cè)法就是用酶來(lái)測(cè)定某些用一般化學(xué)方法難于檢測(cè)的食品成分的含量或測(cè)定食品中某些特殊酶的活性或含量。其最大特點(diǎn)就是特異性強(qiáng)。所以常用于分析結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)性質(zhì)比較相近的同類(lèi)物質(zhì)的分別鑒定。如測(cè)定食品中殘存有機(jī)農(nóng)藥的含量、微生物污染或了解食品的制備、保存情況。
酶檢測(cè)法的樣品一般不需要進(jìn)行很復(fù)雜的預(yù)處理，由于酶的催化效率很高，反應(yīng)條件溫和，酶檢測(cè)法的檢測(cè)速度也比較快。常用的有以下方法：
2.2.1 終點(diǎn)測(cè)定法
在以待測(cè)物質(zhì)為底物的酶反應(yīng)中，如果使底物能夠接近完全地轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，而且底物或產(chǎn)物又具有某種特征性質(zhì)，通過(guò)直接測(cè)定轉(zhuǎn)化前后底物的減少量、產(chǎn)物的增加量或輔酶的變化等就可以定量待測(cè)物質(zhì)。
2.2.2 動(dòng)力學(xué)測(cè)定法
在反應(yīng)體系中精確加入一定數(shù)量的酶，測(cè)定反應(yīng)物或產(chǎn)物變化的速度。測(cè)定的參數(shù)可以是吸光度、熒光度、pH值等。
2.2.3 多酶偶聯(lián)測(cè)定法
當(dāng)被測(cè)定的底物或反應(yīng)產(chǎn)物沒(méi)有易于檢測(cè)的物理化學(xué)手段時(shí)，可采用兩種或兩種以上的酶進(jìn)行連續(xù)式或平行式的偶聯(lián)反應(yīng)，使底物通過(guò)兩步或多步反應(yīng)，轉(zhuǎn)化為易于檢測(cè)的產(chǎn)物，從而測(cè)定待測(cè)物質(zhì)的含量。例如葡萄糖的定量測(cè)定。
2.2.4 利用輔酶作用或抑制劑作用測(cè)定法
如果待測(cè)物質(zhì)可作為某種酶專(zhuān)一的輔酶或抑制劑，則這種物質(zhì)的濃度和將其作為輔酶或抑制劑的酶的反應(yīng)速度之間有一定關(guān)聯(lián)，因此通過(guò)測(cè)定該酶的反應(yīng)速度就能進(jìn)行這種物質(zhì)的定量。嘌呤、核甙酸、維生素、輔酶及食品中農(nóng)藥、殺蟲(chóng)劑的檢驗(yàn)可用此法。
2.2.5 通過(guò)酶反應(yīng)循環(huán)系統(tǒng)的高靈敏度測(cè)定法
對(duì)于極微量的物質(zhì)進(jìn)行酶法檢測(cè)時(shí)，由于靈敏度的原因，在很多情況下不能應(yīng)用通常的終點(diǎn)測(cè)定法，可設(shè)計(jì)一個(gè)酶反應(yīng)循環(huán)系統(tǒng)來(lái)提高檢測(cè)靈敏度。
2.2.6 酶標(biāo)免疫檢測(cè)法
抗體與相應(yīng)的抗原具有選擇和結(jié)合的雙重功能。若要測(cè)定樣品中抗原的含量，就將酶與待測(cè)定抗原的對(duì)應(yīng)抗體結(jié)合在一起，制成酶標(biāo)抗體。然后將酶標(biāo)抗體與樣品液中待測(cè)抗原，通過(guò)免疫反應(yīng)結(jié)合在一起，形成酶―抗體―抗原復(fù)合物，通過(guò)測(cè)定復(fù)合物中酶的含量就可得出待測(cè)抗原的含量。此法可用于食品的污染檢測(cè)，尤其適用于毒素的快速檢測(cè)。
2.2.7 放射性同位素測(cè)定法
酶的活性可以采用同位素標(biāo)記的底物進(jìn)行測(cè)量。經(jīng)酶解后隨時(shí)間所生成的放射性產(chǎn)物含量與酶的濃度成正比。也可用放射性同位素的底物在酶的作用下得到的產(chǎn)物，分離測(cè)定產(chǎn)物的同位素含量。此法可用于需要進(jìn)行極微量的分析或因新發(fā)現(xiàn)的酶還未找到適當(dāng)?shù)姆治龇〞r(shí)的測(cè)定。
2.4 核酸探針技術(shù)
核酸探針技術(shù)又名基因探針技術(shù)或核酸分子雜交技術(shù)，具有敏感性高（可檢出10-9―10-12的核酸）和特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。兩條不同來(lái)源的核酸鏈如果具有互補(bǔ)的堿基序列，就能夠特異性的結(jié)合而成為分子雜交鏈。據(jù)此，可在已知的DNA或RN段上加上可識(shí)別的標(biāo)記（如同位素標(biāo)記、生物素標(biāo)記等），使之成為探針，用以檢測(cè)未知樣品中是否具有與其相同的序列，并進(jìn)一步判定其與已知序列的同源程度。
核酸探針技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于進(jìn)出口動(dòng)植物及其產(chǎn)品的檢驗(yàn)。用于檢驗(yàn)食品中一些常見(jiàn)的致病菌及產(chǎn)毒素菌，如大腸桿菌、沙門(mén)氏菌等多種病原體的檢驗(yàn)。近年來(lái)，放射性同位素標(biāo)記的核酸探針正越來(lái)越多地用于產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌的快速檢測(cè)。
2.5 多聚酶鏈反應(yīng)技術(shù)
多聚酶鏈反應(yīng)技術(shù)是一種極敏感的分子生物學(xué)方法，是一項(xiàng)DNA體外擴(kuò)增技術(shù)，在體外對(duì)特定的雙鏈DN段進(jìn)行高效擴(kuò)增，故又稱(chēng)基因體外擴(kuò)增法。
多聚酶鏈反應(yīng)技術(shù)快速、特異、敏感，在食品中致病菌的檢測(cè)方面具有很大的應(yīng)用潛力。如可用于單核細(xì)胞增多癥李氏桿菌、金黃色葡萄球菌、頑固性梭狀芽胞桿菌、沙門(mén)氏菌等的檢測(cè)。
2.6 基因芯片技術(shù)
基因芯片技術(shù)能同時(shí)將大量探針固定于支持物上，可以一次性對(duì)樣品大量序列進(jìn)行檢測(cè)和分析，從而解決了傳統(tǒng)核酸印跡雜交技術(shù)的操作繁雜、自動(dòng)化程度低、操作序列數(shù)量少、檢測(cè)效率低等不足，是一種在生物技術(shù)產(chǎn)品檢測(cè)中極有發(fā)展前景和應(yīng)用價(jià)值的技術(shù)，也是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，基因芯片檢測(cè)技術(shù)完全可能成為21世紀(jì)最具活力的檢測(cè)技術(shù)之一。
基因芯片檢測(cè)技術(shù)可以判斷該植物是否含有外來(lái)的基因序列，而鑒定該植物是否為生物技術(shù)作物。
2.7 免疫傳感器
免疫傳感器是根據(jù)生物體內(nèi)抗原-抗體特異性結(jié)合并導(dǎo)致化學(xué)變化而設(shè)計(jì)的生物傳感器，其主要由感受器、轉(zhuǎn)換器和放大器組成。免疫傳感器是多學(xué)科邊緣交叉的產(chǎn)物，其研究涉及到電化學(xué)、物理、生物、免疫學(xué)和計(jì)算機(jī)等領(lǐng)域的相關(guān)知識(shí)。
免疫傳感器主要有:酶免疫傳感器、電化學(xué)免疫傳感器(電位型、電流型、電導(dǎo)型、電容型)、光學(xué)免疫傳感器(標(biāo)記型、非標(biāo)記型)、壓電晶體免疫傳感器、表面等離子共振型免疫傳感器和免疫芯片等。
基于抗原-抗體特異性結(jié)合的工作原理，免役傳感器在食品檢測(cè)中的應(yīng)用主要體現(xiàn)在對(duì)生物性危害的檢測(cè)。如可用于致病菌、生物毒素、農(nóng)藥、獸藥等的檢測(cè)。
3.現(xiàn)代生物技術(shù)在食品檢驗(yàn)中的應(yīng)用進(jìn)展
當(dāng)今食品檢驗(yàn)趨向于簡(jiǎn)便、快捷、靈敏和微量化。現(xiàn)代生物技術(shù)以其自身的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)在食品檢驗(yàn)中顯示出巨大的應(yīng)用潛力，已引起分析化學(xué)家和生物學(xué)家的濃厚興趣，并已獲得廣泛的應(yīng)用，前景廣闊。國(guó)外生物技術(shù)在食品檢驗(yàn)中的應(yīng)用研究已比較系統(tǒng)、完整、成熟，國(guó)內(nèi)由于各種條件的限制，目前實(shí)際應(yīng)用并不多。生物技術(shù)要在食品檢驗(yàn)中取得更加廣泛的應(yīng)用，仍需在價(jià)格、效能、方便、實(shí)用性和可靠性方面進(jìn)行深入的研究。
參考文獻(xiàn)
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【關(guān)鍵詞】 人瘤病毒；液基細(xì)胞學(xué)；年齡因素
doi：10.3969/j.issn.1004-7484（s）.2014.03.039 文章編號(hào)：1004-7484（2014）-03-1235-02
宮頸癌的發(fā)病率在全球女性惡性腫瘤中排名第三（15%），但是在發(fā)展中國(guó)家卻居于第二位，[1]僅次于乳腺癌。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球每年大約有530000名婦女被診斷為宮頸癌，每年約有75000名婦女死于這種疾病[2]。在宮頸癌患者中，高危型人瘤病毒（HR-HPV）感染是其發(fā)生的主要病因[3]。
1 資料與方法
1.1 一般材料 收集2013年1月至2013年6月在我院婦科門(mén)診進(jìn)行就診的患者，進(jìn)行TCT檢測(cè)者2658例，其中陽(yáng)性患者257例，進(jìn)行HPV檢測(cè)者1183例，其中陽(yáng)性患者174例。所有標(biāo)本按不同年齡分為6組。
1.2 儀器與試劑 凱普醫(yī)用核酸分子快速雜交儀與HPV核酸擴(kuò)增分型檢測(cè)試劑盒均由凱普生物儀器有限公司生產(chǎn)。TIB-Autoprep 1000由泰普生物科學(xué)（中國(guó)）有限公司生產(chǎn)。
1.3 檢測(cè)方法
1.3.1 TCT檢測(cè)方法 首先用棉球擦去患者宮頸表面分泌物，然后用頸管刷插入子宮頸管內(nèi)收集宮頸脫落細(xì)胞，標(biāo)本取完后將宮頸刷放入裝有Thin prep（液基宮頸細(xì)胞學(xué)檢查）專(zhuān)用保存液的小瓶中攪拌、漂洗，蓋好瓶蓋送檢。標(biāo)本經(jīng)過(guò)TIB-Autoprep 1000處理儀處理，就可以得到一張薄而均勻的直徑為2cm大小的圓形細(xì)胞涂片，在顯微鏡下觀(guān)察宮頸細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞學(xué)分類(lèi)診斷。
1.3.2 HPV檢測(cè)方法 同樣是先用棉球擦去患者宮頸表面分泌物，然后用專(zhuān)用的HPV特制毛刷收集宮頸脫落細(xì)胞，標(biāo)本連同毛刷保存于HPV保存液中。采用雜交捕獲2代技術(shù)（HC2），即使用化學(xué)發(fā)光法的核酸雜交檢測(cè)方法，在體外進(jìn)行核酸雜交，利用化學(xué)發(fā)光法，使微孔板信號(hào)擴(kuò)增，對(duì)宮頸標(biāo)本中的13種高危型人瘤病毒（Human Papillomavirus，HPV）DNA進(jìn)行半定量檢測(cè)。可檢測(cè)的13種HPV亞型，包括16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59和68，陽(yáng)性閡值是HPV-DNA，1.0pg/ml。
2 結(jié) 果
2.1 TCT不同年齡組結(jié)果 見(jiàn)表1。共有2658例患者進(jìn)行TCT檢測(cè)，其中陽(yáng)性患者257例，占患者總數(shù)的9.7%。有表1可見(jiàn)，40-49歲年齡組陽(yáng)性率最高（12.48%），20-29歲年齡組次之（9.48%），此后排序分別為50-59歲，30-39歲年齡組。
2.2 HPV不同年齡組結(jié)果 見(jiàn)表2。共有1183例患者進(jìn)行HPV檢測(cè)，其中陽(yáng)性患者174例，占患者總數(shù)14.7%。有表2可見(jiàn)，20-29歲年齡組陽(yáng)性率最高（16.99%），40-49歲年齡組次之（15.20%），此后排序分別為50-59歲，30-39歲年齡組。
3 討 論
HPV是一組無(wú)包膜的雙鏈環(huán)狀DNA病毒，對(duì)皮膚及黏膜上皮具有特殊嗜性，目前發(fā)現(xiàn)和鑒定出200多種HPV亞型[4]，據(jù)誘發(fā)病變的良惡性不同，HPV又分為高危型和低危型。低危型HPV-6、11、42、43和44，常與生殖器尖銳濕疣和低程度鱗狀上皮病變的發(fā)生有關(guān)。高危型HPV-16、18、31、33和45常與中重度鱗狀上皮病變及惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān)。
我國(guó)是宮頸癌的高發(fā)區(qū)，我國(guó)每年侵襲性宮頸癌的新發(fā)病例為45689例，死亡例數(shù)為25561例，占全球總數(shù)10%。本文所做統(tǒng)計(jì)TCT陽(yáng)性率在40-49歲年齡組最高，為12.48%，20-29歲次之為9.48%。HPV陽(yáng)性率在20-29歲年齡組達(dá)到最高，為16.99%，40-49歲年齡組次之為15.20%，其中LSIL以20-29歲年齡組陽(yáng)性率最高為3.7%，HSIL以40-49歲年齡組陽(yáng)性率最高為3.4%。與一些文獻(xiàn)報(bào)道有所差異，可能是由于地區(qū)性和環(huán)境的差異所致，有待進(jìn)一步研究。
最主要原因，大量吸煙、避孕藥、及和生殖、社會(huì)經(jīng)濟(jì)和衛(wèi)生狀況等各種途徑均增高HPV感染概率，促使宮頸癌的產(chǎn)生。性活躍期婦女HPV感染十分常見(jiàn)，初次性活躍期的婦女中HPV感染率最高，約50-80%性活躍期婦女感染HPV，其中50%為高危型HPV感染。呼吁晚婚、少育，做好宮頸癌三級(jí)預(yù)防：一級(jí)預(yù)防（應(yīng)用疫苗），將HPV扼殺在搖籃中，對(duì)青少年女性，提前應(yīng)用疫苗；二級(jí)預(yù)防（宮頸篩查），建立健全防癌抗癌計(jì)劃，做好宮頸細(xì)胞篩查計(jì)劃；三級(jí)預(yù)防（檢查治療），發(fā)現(xiàn)有感染跡象女性，做好下一步治療，在早期，阻斷病變，做到早發(fā)現(xiàn)早治療，以預(yù)防、杜絕宮頸癌發(fā)生。
參考文獻(xiàn)
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基因擴(kuò)增是分子生物學(xué)領(lǐng)域的常用研究手段，目前應(yīng)用最廣的是常規(guī)PCR和real－timePCR技術(shù)［1］，因其靈敏度高，特異性強(qiáng)，已成為分子生物學(xué)領(lǐng)域的關(guān)鍵技術(shù)。但PCR方法的操作較復(fù)雜，對(duì)操作人員和儀器設(shè)備的要求都較高，不適合基層及現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和改進(jìn)，新技術(shù)不斷涌現(xiàn)，TsugunoriNotomi等［2］于2000年提出了LAMP，一種新穎的核酸擴(kuò)增技術(shù)，利用該技術(shù)只需在恒溫條件下(60～65℃)保溫幾十分鐘就可快速完成核酸的擴(kuò)增，無(wú)需購(gòu)置昂貴的PCR儀，操作簡(jiǎn)單，快速，可用于現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)，近年來(lái)已得到廣泛的應(yīng)用。本文綜述了LAMP技術(shù)的基本原理、相對(duì)于傳統(tǒng)核酸檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)、產(chǎn)物的檢測(cè)方法及其臨床應(yīng)用，最后指出LAMP目前存在的不足以及應(yīng)采取的相應(yīng)措施，并對(duì)其發(fā)展前景進(jìn)行了展望，從而為L(zhǎng)AMP技術(shù)在臨床研究上的應(yīng)用提供參考。
1LAMP法的原理及特點(diǎn)
1.1LAMP引物的設(shè)計(jì)LAMP技術(shù)的核心之一在于引物的設(shè)計(jì)，因此，設(shè)計(jì)出特異性強(qiáng)的引物是進(jìn)行LAMP實(shí)驗(yàn)的首要任務(wù)。LAMP引物由一對(duì)內(nèi)引物(FIP與BIP)和一對(duì)外引物(F3與B3)組成，其中FIP由F1c和F2組成，BIP由B1c和B2組成，嚴(yán)格針對(duì)靶基因3'端的F1c、F2c和F3c區(qū)以及5'端的B1、B2和B3區(qū)而設(shè)計(jì)［3］，結(jié)構(gòu)組成如圖1所示。
1.2擴(kuò)增原理DNA在65℃左右處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，此時(shí)，任何一個(gè)引物向雙鏈DNA的互補(bǔ)部位進(jìn)行堿基配對(duì)延伸時(shí)，另一條鏈就會(huì)解離，變成單鏈［4，5］。據(jù)此，LAMP反應(yīng)被劃分為2個(gè)階段，即起始物合成階段和循環(huán)擴(kuò)增階段。在第1階段，內(nèi)引物FIP首先與模板F2c區(qū)結(jié)合，啟動(dòng)互補(bǔ)鏈的合成，產(chǎn)生雙鏈DNA。接著，引物F3與F3c互補(bǔ)配對(duì)，在BstDNA聚合酶的作用下，啟動(dòng)鏈置換反應(yīng)，并釋放出由FIP引導(dǎo)合成的單鏈，此單鏈的5'末端存在互補(bǔ)序列(F1c和F1)，于是通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)形成一環(huán)狀結(jié)構(gòu)。以此鏈為模板，與FIP和F3類(lèi)似，在BIP和B3的作用下，在DN段的另外一端產(chǎn)生了新的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，于是整條鏈呈啞鈴狀結(jié)構(gòu)［6］，如圖2所示，到此，第1階段反應(yīng)完成。循環(huán)擴(kuò)增階段，以啞鈴狀結(jié)構(gòu)為模板，F(xiàn)IP與莖環(huán)區(qū)域F2c雜交，同時(shí)，F(xiàn)1c與F1結(jié)合，啟動(dòng)新一輪鏈置換反應(yīng)，解離出由F1引導(dǎo)合成的雙鏈核酸，并釋放由F2引導(dǎo)合成的單鏈，此單鏈兩端均成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，BIP與莖環(huán)區(qū)域B2c互補(bǔ)，啟動(dòng)新一輪擴(kuò)增。如此不斷循環(huán)，莖的長(zhǎng)度和環(huán)的個(gè)數(shù)都不斷增加，最后的產(chǎn)物為莖－環(huán)狀DNA與花椰菜狀DNA所組成的混合物。
1.3LAMP技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)與普通PCR相比，LAMP具有許多優(yōu)點(diǎn):①特異性強(qiáng)，引物的設(shè)計(jì)須嚴(yán)格針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域，任何一個(gè)不匹配就會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)無(wú)法進(jìn)行;②靈敏度高，可檢測(cè)出1～10拷貝的模板，比PCR高出10倍的檢測(cè)限［7］;③反應(yīng)時(shí)間短，只需在恒溫條件下保溫30～60min就可完成擴(kuò)增;④設(shè)備簡(jiǎn)單，不需要昂貴的PCR儀和特殊的試劑，只需一臺(tái)恒溫設(shè)備就可進(jìn)行;⑤產(chǎn)物易檢測(cè)，只需用肉眼觀(guān)察有無(wú)白色渾濁或有無(wú)綠色熒光，就可判斷擴(kuò)增是否發(fā)生。LAMP與普通PCR的比較結(jié)果見(jiàn)表1。
1.4LAMP產(chǎn)物的檢測(cè)反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定常用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、濁度檢測(cè)、熒光比色檢測(cè)和熒光實(shí)時(shí)定量檢測(cè)
1.4.1濁度檢測(cè)隨著核酸的大量生成，溶液中會(huì)發(fā)生如下反應(yīng):(DNA)n－1+dNTP=(DNA)n+P2O4–7P2O4–7+2Mg2+=Mg2P2O7(白色)由dNTP析出的P2O4－7與溶液中的鎂離子結(jié)合，生成肉眼可見(jiàn)的焦磷酸鎂白色沉淀，通過(guò)與陰性管比較反應(yīng)液的渾濁情況，或用濁度儀檢測(cè)其在400nm處的沉淀濁度，就可判斷擴(kuò)增的有無(wú)。
1.4.2熒光比色檢測(cè)對(duì)LAMP產(chǎn)物進(jìn)行熒光比色檢測(cè)時(shí)，常用的染料有SYBRGreenⅠ、鈣黃綠素、HNB、溴化乙淀和Picogreen等［8］。其中，SYBRGreenⅠ和HNB的檢測(cè)靈敏度最高，是鈣黃綠素的10倍［9］，然而SYBRGreenⅠ不能在反應(yīng)前加入LAMP體系中，否則會(huì)抑制反應(yīng)［10］，而反應(yīng)后加就必須開(kāi)蓋，又違反了LAMP不開(kāi)蓋原則，造成氣溶膠污染。HNB則是在反應(yīng)前加入體系中，避免了開(kāi)蓋污染的問(wèn)題，擴(kuò)增結(jié)束后，陽(yáng)性管呈紫色，陰性管呈天藍(lán)色，由此，可判斷靶基因的有無(wú)。
2LAMP技術(shù)的應(yīng)用
LAMP技術(shù)自2000年開(kāi)發(fā)以來(lái)，因其簡(jiǎn)便快速，操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)和動(dòng)物胚胎性別鑒定等檢測(cè)中。
2.1細(xì)菌的檢測(cè)YoshiteruAoi等［11］利用LAMP對(duì)環(huán)境中的氨氧化細(xì)菌進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果可檢測(cè)出10個(gè)拷貝數(shù)的DNA，具有與real－timePCR相同的靈敏度，且背景DNA對(duì)LAMP的檢測(cè)干擾很小，可忽略不計(jì)。徐芊等［12］將LAMP用于檢測(cè)副溶血弧菌，直接對(duì)食品樣品進(jìn)行檢測(cè)，只用一臺(tái)恒溫水槽，65℃反應(yīng)1h，即完成擴(kuò)增反應(yīng)，與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相比，大大縮短了檢測(cè)周期，檢測(cè)限達(dá)到89cfu/g。葉宇鑫等［13］將原位熒光LAMP技術(shù)應(yīng)用于食品中沙門(mén)氏菌的檢測(cè)，與傳統(tǒng)沙門(mén)氏菌檢測(cè)方法和PCR方法相比，原位熒光LAMP無(wú)需破碎細(xì)胞提DNA，反應(yīng)方便易行，耗時(shí)少;恒溫條件(63℃)下反應(yīng)，避免了原位PCR方法過(guò)高的循環(huán)溫度(95℃)對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞;在檢測(cè)人工污染的樣品時(shí)，結(jié)果沒(méi)有受到雜質(zhì)的影響，可以檢測(cè)到樣本中的單個(gè)細(xì)胞。張宏偉等［14］以莢膜脂多糖合成調(diào)控子resA為靶基因片段，設(shè)計(jì)了肺炎克雷伯菌特異性引物，建立了LAMP檢測(cè)方法，靈敏度可達(dá)2.2～3.4CFU/100g，檢測(cè)流程可縮短至2d，比PCR法更加快速。董培陪等［15］結(jié)合LAMP與橫向流動(dòng)試紙條技術(shù)(Lateralflowdipstick，LFD)建立起一種鰻利斯頓氏菌快速檢測(cè)方法，能在30min內(nèi)完成檢測(cè)，靈敏度為7.7cfu/ml，比常規(guī)PCR方法高一個(gè)數(shù)量級(jí)，通過(guò)與橫向流動(dòng)試紙條檢測(cè)技術(shù)結(jié)合，進(jìn)一步克服了由非特異性擴(kuò)增導(dǎo)致的假陽(yáng)性。可見(jiàn)，將LAMP技術(shù)用于細(xì)菌檢測(cè)時(shí)，其檢測(cè)限比常規(guī)PCR更高，與real－timePCR法相比則具有相同的靈敏度，無(wú)需分離培養(yǎng)細(xì)菌，可直接提取感染動(dòng)物組織基因組進(jìn)行擴(kuò)增［16］，操作更為簡(jiǎn)單、方便，且不需要昂貴的儀器，該方法有望成為細(xì)菌檢測(cè)的常規(guī)手段。
2.2病毒的檢測(cè)
2.2.1DNA病毒TingCai等［17］利用LAMP方法檢測(cè)血清樣本中的HBV，并與real－timePCR法進(jìn)行了比較，結(jié)果表明兩者的檢出率一致，且對(duì)于低濃度的樣品，LAMP的準(zhǔn)確率更高，更適用于臨床檢測(cè)。李明云等［18］根據(jù)對(duì)蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)的結(jié)構(gòu)蛋白VP26基因序列，設(shè)計(jì)一套引物，建立了針對(duì)WSSV的LAMP檢測(cè)方法，可檢測(cè)到最低模板濃度為0.563pg/μl，靈敏度比常規(guī)PCR法高1個(gè)數(shù)量級(jí)，并且當(dāng)模板濃度由10－5倍稀釋到10－6倍時(shí)，PCR產(chǎn)物濃度顯著降低，受模板濃度的影響較大，而LAMP的擴(kuò)增產(chǎn)物濃度則基本不受影響。張侃等［19］將LAMP用于偽狂犬病病毒的檢測(cè)，在45min內(nèi)完成檢測(cè)，其特異性與PCR方法一致，敏感性則是PCR的100倍，最低能夠檢測(cè)10個(gè)拷貝的目的基因。
2.2.2RNA病毒LeoL．M．Poon等［20］于2004年首先建立了針對(duì)SARS的RT－LAMP技術(shù)，通過(guò)對(duì)31例SARS患者的檢測(cè)，檢出率為64%，其靈敏度略低于實(shí)時(shí)PCR，但是比常規(guī)PCR法更高。TetsuoYoneyama等［21］用RT－LAMP法檢測(cè)了糞便中的HAV，實(shí)驗(yàn)中加入了環(huán)引物，將檢測(cè)時(shí)間縮短至50min，與RT－PCR法(需要2～3h)相比大大節(jié)省了時(shí)間;對(duì)HAV實(shí)驗(yàn)室病毒毒株的檢測(cè)，靈敏度為0.4～0.8FFU/5μl，與侵染性實(shí)驗(yàn)法相當(dāng)，且能檢測(cè)到HAVⅢ型，比real－timeRT－PCR法的檢測(cè)范圍更廣，可作為基層疫情監(jiān)控的常規(guī)檢測(cè)方法。聶凱等［22］采用一步法的RT－LAMP檢測(cè)人甲型H1N1流感病毒基因，在反應(yīng)體系中直接加入反轉(zhuǎn)錄酶，大大簡(jiǎn)化了LAMP技術(shù)用于RNA病毒檢測(cè)的操作步驟。此外，LAMP技術(shù)在檢測(cè)艾滋病病毒［23］、鵝細(xì)小病毒［24］、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒［25］、人星狀病毒［26］、單純皰疹病毒Ⅰ型［27］、豬圓環(huán)2型病毒［28］等方面均有報(bào)道，無(wú)論是DNA還是RNA病毒LAMP都能做到快速檢測(cè)，在檢測(cè)RNA病毒時(shí)更是省去了RT－PCR法中費(fèi)時(shí)的反轉(zhuǎn)錄步驟，在臨床檢測(cè)上顯示出越來(lái)越重要的地位。
2.3寄生蟲(chóng)的檢測(cè)HiromiIkadai等［29］將LAMP法用于巴貝斯蟲(chóng)的檢測(cè)，證實(shí)LAMP具有與PCR和光學(xué)顯微鏡同樣的敏感性，而且更加簡(jiǎn)便，快速。李群等［30］為提高牛巴貝斯焦蟲(chóng)病的檢出率，采用LAMP法進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明，LAMP檢測(cè)體系特異性強(qiáng)，與雙芽巴貝斯焦蟲(chóng)DNA不發(fā)生交叉反應(yīng);敏感性高，最小檢測(cè)值為0.014fg，為一般PCR法的103倍。Jun－HuChen等［31］用LAMP法對(duì)間日瘧感染患者進(jìn)行診斷，在117例鏡檢呈陽(yáng)性的血清樣本中，LAMP檢出115例，靈敏度和特異性與鏡檢法和nestedPCR法相近，但是操作更加簡(jiǎn)單，不需要昂貴的儀器，且對(duì)DNA的抽提要求不高，有望成為檢驗(yàn)科或瘧疾診所的常規(guī)診斷方法。
2.4動(dòng)物胚胎性別的鑒定LAMP在動(dòng)物胚胎性別的鑒定方面也有應(yīng)用，HirokiHirayama等［32］首次利用LAMP法檢測(cè)牛胚胎的性別，鑒定的準(zhǔn)確率為88.9%～94.4%，整個(gè)鑒定過(guò)程不超過(guò)1h。KhairyM．A．Zoheir等［33］也成功將LAMP用于牛胚胎性別的鑒定，以EB和CuSO4為指示劑，反應(yīng)45min即可通過(guò)肉眼觀(guān)察顏色的變化，從而鑒定出雌雄，準(zhǔn)確率達(dá)100%，簡(jiǎn)單快速，成本低，可用于養(yǎng)殖場(chǎng)現(xiàn)場(chǎng)操作。
3不足與對(duì)策
3.1存在的不足對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物定量檢測(cè)時(shí)，需要購(gòu)置昂貴的熒光定量PCR儀或濁度儀;LAMP法的擴(kuò)增靶序列長(zhǎng)度控制在300bp以下，對(duì)引物要求高，由在線(xiàn)軟件設(shè)計(jì)的引物有上千條，要篩選出合適的引物需要耗費(fèi)大量的工作;LAMP靈敏度高，一旦開(kāi)蓋容易形成氣溶膠污染;傳統(tǒng)PCR產(chǎn)物的電泳圖都是呈現(xiàn)單帶，而LAMP法陽(yáng)性反應(yīng)則是呈階梯狀條帶，因此，若有非特異性擴(kuò)增的產(chǎn)生，則不易辨別，造成LAMP容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。
3.2對(duì)策嚴(yán)格做好防污染工作，體系的配制一定要在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)器材要進(jìn)行消毒滅菌;BstDNA酶最后加入體系，若有必要可以在體系上覆蓋一層礦物油;LAMP體系的配制和檢測(cè)必須要嚴(yán)格分區(qū)，操作人員往返兩區(qū)域進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)要更換實(shí)驗(yàn)服，同時(shí)要盡可能地避免無(wú)關(guān)緊要的人員流動(dòng)，凡進(jìn)入檢測(cè)區(qū)的實(shí)驗(yàn)器材都不要再拿回配制區(qū)。由于開(kāi)蓋檢測(cè)容易造成氣溶膠污染，所以反應(yīng)結(jié)束后最好不要打開(kāi)PCR管，可采用反應(yīng)前加入HNB染料的方法對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定性檢測(cè)。一旦出現(xiàn)污染，應(yīng)立即停止實(shí)驗(yàn)，每天給實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)，給超凈臺(tái)紫外滅菌并通風(fēng)，一段時(shí)間后更換所有試劑再做。采用HidenoriTani等［34，35］提出的ABC－LAMP技術(shù)對(duì)LAMP產(chǎn)物進(jìn)行定量，該方法主要是在反應(yīng)體系中加入探針AB－QProbe和已知濃度的內(nèi)標(biāo)，探針的熒光值代表靶基因與內(nèi)標(biāo)的比值，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，靶基因與內(nèi)標(biāo)被同等程度擴(kuò)增，通過(guò)測(cè)定反應(yīng)終點(diǎn)兩者的熒光值之比，結(jié)合內(nèi)標(biāo)的初始濃度就能對(duì)初始模板定量，從而實(shí)現(xiàn)了以較低的成本對(duì)產(chǎn)物的定量檢測(cè)。
1引言
特定序列單鏈核酸（DNA）的特異性檢測(cè)在臨床診斷、基因治療、環(huán)境調(diào)查、食品安全及生物醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域都具有十分重要的意義＼[1～5＼]。分子信標(biāo)（Molecular beacons）是一種呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記的寡核苷酸探針，具有操作簡(jiǎn)單、選擇性好以及不必與未反應(yīng)的探針?lè)蛛x即可實(shí)時(shí)檢測(cè)等特點(diǎn)，在特定序列單鏈DNA的檢測(cè)中扮演著越來(lái)越重要的角色＼[6～13＼]。近年來(lái)，有關(guān)分子信標(biāo)對(duì)特定序列單鏈DNA檢測(cè)的報(bào)道逐漸增多＼[14～16＼]。盡管分子信標(biāo)在DNA的定性及定量分析中顯示出廣闊的應(yīng)用前景，但經(jīng)典分子信標(biāo)在實(shí)際定量分析中還存在一些不足： （1） 經(jīng)典分子信標(biāo)具有較強(qiáng)的背景信號(hào)，影響定量檢測(cè)的檢出限＼[17＼]；（2） 相對(duì)于核酸染料而言，分子信標(biāo)對(duì)核酸檢測(cè)的靈敏度較低；（3） 經(jīng)典分子信標(biāo)需要在兩端分別標(biāo)記熒光基團(tuán)及猝滅基團(tuán)，制備時(shí)間長(zhǎng)且成本高。
核酸染料Hoechst 33258是一種可以穿透細(xì)胞膜的藍(lán)色熒光染料，具有很高的靈敏度＼[18，19＼]。它在水溶液中熒光很弱，與單鏈DNA幾乎不發(fā)生作用，但與雙鏈DNA具有很強(qiáng)的親和性，能嵌入雙鏈DNA的小溝中，與雙鏈中的A/T堿基對(duì)發(fā)生特異性結(jié)合，使其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度大大增加＼[20，21＼]。根據(jù)此原理，Hoechst 33258在雙鏈 DNA 含量測(cè)定中，已得到廣泛應(yīng)用＼[22，23＼]。
Hoechst 33258 與分子信標(biāo)聯(lián)合應(yīng)用的報(bào)道較少。James等＼[24＼]利用Hoechst 33258 與分子信標(biāo)研究了發(fā)夾聚酰胺對(duì)雙鏈DNA的解鏈溫度的影響，并獲得了較好的結(jié)果。到目前為止，利用Hoechst 33258 結(jié)合分子信標(biāo)對(duì)特定序列核酸的檢測(cè)還未見(jiàn)報(bào)道。
本研究利用無(wú)標(biāo)記的分子信標(biāo)（無(wú)有機(jī)熒光基團(tuán)和熒滅基團(tuán)）及Hoechst 33258建立一種高靈敏、高選擇性的特定序列核酸檢測(cè)方法。在這種分析方法中，將無(wú)標(biāo)記分子信標(biāo)的莖完全設(shè)計(jì)成C/G堿基對(duì)，分子信標(biāo)的環(huán)設(shè)計(jì)為目標(biāo)DNA的互補(bǔ)序列。利用分子信標(biāo)與目標(biāo)DNA反應(yīng)之前，Hoechst 33258熒光信號(hào)很弱，而與目標(biāo)DNA反應(yīng)之后，其熒光信號(hào)顯著增強(qiáng)的基本原理，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定序列DNA的定量檢測(cè)。
相對(duì)于經(jīng)典分子信標(biāo)對(duì)核酸的檢測(cè)而言，本方法具有以下特點(diǎn)：（1）使用無(wú)標(biāo)記分子信標(biāo)，省去了標(biāo)記步驟， 降低了分析成本； （2）將分子信標(biāo)的莖完全設(shè)計(jì)成C/G堿基對(duì)，而Hoechst 33258不與C/G堿基對(duì)發(fā)生作用，因此背景熒光很低，可顯著降低分析方法的檢出限； （3）利用Hoechst 33258的熒光代替經(jīng)典分子信標(biāo)中的熒光基團(tuán)對(duì)目標(biāo)核酸進(jìn)行檢測(cè)，可顯著提高檢測(cè)的靈敏度。這主要是因?yàn)槔煤怂崛玖蠙z測(cè)核酸時(shí)，一個(gè)核酸分子能與多個(gè)核酸染料相結(jié)合，而每個(gè)分子信標(biāo)只有一個(gè)熒光基團(tuán)。同時(shí)無(wú)標(biāo)記的分子信標(biāo)又保留了經(jīng)典分子信標(biāo)中莖環(huán)的結(jié)構(gòu)，仍然具有很高的選擇性。
3結(jié)果與討論
3.1檢測(cè)原理
利用無(wú)標(biāo)記的分子信標(biāo)及Hoechst 33258對(duì)特定序列核酸檢測(cè)的原理如圖1所示。在沒(méi)有目標(biāo)DNA時(shí)，盡管分子信標(biāo)處于莖環(huán)結(jié)構(gòu)狀態(tài)，但分子信標(biāo)的莖全部由C/G堿基對(duì)組成，不與Hoechst 33258作用，此時(shí)Hoechst 33258的熒光信號(hào)很弱；在有目標(biāo)DNA時(shí)，其與分子信標(biāo)發(fā)生雜交反應(yīng)，形成雙鏈DNA后再與Hoechst 33258結(jié)合，Hoechst 33258的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。根據(jù)熒光增強(qiáng)的程度，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定單鏈DNA的檢測(cè)。
3.3.6核酸染料Hoechst 33258與雙鏈DNA作用的時(shí)間的影響核酸染料Hoechst 33258只有與雙鏈DNA結(jié)合之后才會(huì)發(fā)出較強(qiáng)的熒光，因此它與雙鏈DNA的結(jié)合時(shí)間是影響其熒光強(qiáng)度的重要因素。本實(shí)驗(yàn)對(duì)Hoechst 33258與雙鏈DNA的結(jié)合時(shí)間進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，在9 min內(nèi)，Hoechst 33258的熒光強(qiáng)度隨著時(shí)間的增加而增大；當(dāng)結(jié)合時(shí)間超過(guò)9 min后，Hoechst 33258的熒光強(qiáng)度不再發(fā)生變化。
3.4工作曲線(xiàn)及復(fù)雜樣品中核酸的檢測(cè)
在3.5堿基錯(cuò)配分析
對(duì)不同堿基錯(cuò)配序列DNA進(jìn)行了分析，以考察方法的特異性，結(jié)果如圖4所示。對(duì)于不同堿基錯(cuò)配序列的DNA，Hoechst 33258的熒光強(qiáng)度具有顯著區(qū)別。對(duì)于目標(biāo)DNA序列、單堿基錯(cuò)配DNA序列、雙堿基錯(cuò)配DNA序列及三堿基錯(cuò)配DNA序列，所對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度之比
4結(jié)論
利用無(wú)標(biāo)記的分子信標(biāo)與單鏈DNA特異性反應(yīng)生成雙鏈，再與Hoechst 33258結(jié)合后，其熒光顯著增強(qiáng)的基本原理，建立了檢測(cè)特定序列核酸的新方法。本方法操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快、靈敏度高、重現(xiàn)性好、檢出限低。
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AbstractA highly sensitive and selective method for specific DNA sequence detection is developed using a nonlabeled molecular beacon （MB） and a nucleic acid dye Hoechst 33258. It is demonstrated by a specific DNA sequence of wildtype HBV as a model system. In this strategy， the stem of MB is completely designed as C/G base pairs. In the absence of target DNA， the interaction between Hoechst 33258 and the MBs is very weak，and the fluorescence signals of Hoechst 33258 is very low. In the presence of target DNA， the MBs hybridize with the target DNA and form doublestranded structure. Hoechst 33258 binds to dsDNA， and the fluorescence intensity is significantly enhanced. Under the optimum conditions， the fluorescence intensity of Hoechst 33258 exhibits good linear dependence on target DNA concentration in the range of 2×10
關(guān)鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合征；抗體檢測(cè)；病原檢測(cè)
中圖分類(lèi)號(hào)：S858.28 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： 文章編號(hào)：1007-273X（2016）12-0009-02
豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome， PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus，PRRSV）引起的一種嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的傳染病。以妊娠母豬流產(chǎn)、死產(chǎn)、弱胎、木乃伊胎等繁殖障礙及各年齡階段豬的呼吸道癥狀為特征[1-3]。該病毒具有抗原變異性、嗜巨噬細(xì)胞性、持續(xù)感染性及抗體依賴(lài)增強(qiáng)性作用，臨床上常與其他病原混合感染使臨床表現(xiàn)形式復(fù)雜化[4-5]。要確診需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法很多，每種方法在檢測(cè)的特異性、敏感性、成本等方面存在差異。因此，建立有效且適合基層使用的PRRS檢測(cè)方法是防控PRRS的重要環(huán)節(jié)，本文就PRRS檢測(cè)方法進(jìn)行了綜述，供參考。
1 抗體的檢測(cè)
免疫熒光抗體（IFA）試驗(yàn)、免疫過(guò)氧化酶單層細(xì)胞試驗(yàn)（IPMA）、血清中和（SVN）試驗(yàn)及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）等都可用于檢測(cè)PRRSV的特異性抗體，通過(guò)檢測(cè)抗體水平可以對(duì)豬個(gè)體或整個(gè)豬群的PRRSV感染狀況或疫苗免疫效果給予一定的評(píng)價(jià)。
1.1 PRRSV抗體檢出時(shí)間及維持時(shí)間
當(dāng)豬感染PRRSV 7～14 d后，機(jī)體首先產(chǎn)生IgG抗體，機(jī)體產(chǎn)生的抗體隨著時(shí)間的積累呈增加的趨勢(shì)，當(dāng)抗體達(dá)到峰值后在體內(nèi)維持一段r間，然后抗體水平逐漸下降，不同檢測(cè)方法檢測(cè)出的抗體出現(xiàn)峰值時(shí)間、峰值維持時(shí)間以及抗體在體內(nèi)存留時(shí)間均不一致。在試驗(yàn)感染條件下，通過(guò)IgG-IFA、IPMA、ELISA、SVN方法可分別在感染后5～9、9～11、9～13、9～28 d內(nèi)檢測(cè)到抗體。PRRSV特異性IgM抗體在接種后5 d可以檢測(cè)到，并可持續(xù)21～28 d。不同的方法檢測(cè)出的抗體峰值時(shí)間各不相同：IFA 30～50 d、IPMA 35～50 d、ELISA 30～50 d、SVN 60～90 d，隨后抗體滴度逐漸下降。感染PRRSV后用各種方法檢測(cè)的抗體消失時(shí)間為： IFA 4～5個(gè)月、ELISA 4～10個(gè)月以上、IPMA 11～12個(gè)月、SVN12個(gè)月[6-8]。疫苗免疫后各種方法的檢測(cè)結(jié)果與上述時(shí)間段基本一致。
1.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）
ELISA適于大規(guī)模檢測(cè)，方便、易行，操作過(guò)程及結(jié)果判斷能夠標(biāo)準(zhǔn)化，且具有高度的特異性和敏感性，以間接ELISA和阻斷ELISA常見(jiàn)[6-8]。利用ELISA檢測(cè)血清中PRRSV抗體出現(xiàn)的時(shí)間與用IPMA和IFA檢測(cè)抗體出現(xiàn)時(shí)間基本相同，但是血清中PRRSV抗體持續(xù)時(shí)間明顯長(zhǎng)于IPMA和IFA所檢測(cè)出的抗體維持時(shí)間，檢出時(shí)間長(zhǎng)達(dá)1年左右。
ELISA診斷抗原有2種，一種是從細(xì)胞培養(yǎng)物中純化的全病毒抗原，另一種是重組的PRRSV核衣殼蛋白。無(wú)論是用全病毒還是用基因表達(dá)產(chǎn)物作為診斷抗原建立的ELISA，均具有較強(qiáng)的背景反應(yīng)。IDEXX公司生產(chǎn)的PRRSV抗體ELISA檢測(cè)試劑盒在全球范圍內(nèi)推廣使用，曾被認(rèn)為是PRRSV抗體檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。但不久通過(guò)對(duì)照試驗(yàn)對(duì)該試劑盒檢測(cè)效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)IDEXX試劑盒存在假陽(yáng)性結(jié)果，PRRSV全病毒抗原間接ELISA與IDEXX HerdChek ELISA試劑盒相比，前者特異性?xún)H為26.6%，敏感性也僅為48.8%。如果該方法應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中，將會(huì)對(duì)PRRS的凈化以及后備種豬的篩選帶來(lái)嚴(yán)重后果。因此，在ELISA試劑盒研制上還需要廣大從事ELISA試劑盒研制的人員做出更大的努力來(lái)彌補(bǔ)現(xiàn)有試劑盒的不足之處，進(jìn)一步完善中國(guó)ELISA診斷試劑盒標(biāo)準(zhǔn)[8-10]。
1.3 免疫過(guò)氧化酶單層細(xì)胞試驗(yàn)（IPMA）
IPMA是廣泛用于該病診斷的一種方法，其敏感性和特異性都較好，可用于PRRSV的血清抗體檢測(cè)、病毒鑒定及抗原檢測(cè)。自1991年建立至今，仍是歐洲和美洲國(guó)家廣泛使用的血清學(xué)診斷方法。利用IPMA和商品化的PRRSV ELISA試劑盒檢測(cè)抗體，并進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)利用同源性抗原檢測(cè)抗體，IPMA比ELISA試劑盒檢測(cè)出抗體的時(shí)間提前2～3 d，特別是對(duì)母源抗體的靈敏度更高，然而ELISA卻能在不損失特異性的基礎(chǔ)上提高敏感性，所以相比之下，ELISA更適合用來(lái)診斷PRRSV。由于IPMA結(jié)果判定具有一定主觀(guān)性，不能自動(dòng)顯示，同時(shí)費(fèi)時(shí)，檢測(cè)費(fèi)用高，不適合大規(guī)模檢測(cè)，因此在實(shí)際生產(chǎn)中未得到廣泛應(yīng)用[9，10]。
1.4 免疫熒光抗體（IFA）試驗(yàn)
IFA法在美國(guó)被廣泛利用，該法需進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、熒光鏡檢，結(jié)果借助肉眼來(lái)觀(guān)察，因?qū)嶒?yàn)室操作方法的不同、技術(shù)人員的不同和非特異性熒光等原因產(chǎn)生較大的主觀(guān)性。對(duì)IFA和ELISA方法進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者具有很高的符合率，不符合的原因可能是血清抗體的水平太低。ELISA可以檢測(cè)抗體滴度比較低的血清，而用IFA則檢測(cè)不到，由此造成假陰性結(jié)果。
利用間接熒光抗體試驗(yàn)對(duì)試驗(yàn)感染PRRSV的豬的抗體進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，在感染病毒后9～14 d，首先檢測(cè)出IgG抗體，高滴度的IgG抗體可以維持7周；感染病毒后35 d再次接種PRRSV，體內(nèi)IgG抗體滴度不發(fā)生變化，病毒血癥仍可檢測(cè)到。在接種5～28 d可以檢測(cè)到IgM抗體，35 d后再次接種病毒其抗體在短時(shí)間內(nèi)增加。利用熒光抗體試驗(yàn)在不同時(shí)間對(duì)IgM抗體水平進(jìn)行檢測(cè)，在短時(shí)間內(nèi)有助于鑒別是否感染PRRSV。因此，在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中要盡可能避免假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，在條件允許情況下結(jié)合其他檢測(cè)結(jié)果得出結(jié)論[9-11]。
血清中和試驗(yàn)與IFA和ELISA相比，其敏感性低，原因可能是由于PRRSV特異的中和抗體出現(xiàn)比較晚，要在感染后30～60 d才能檢測(cè)到。對(duì)于急性感染的敏感性更差，與其他檢測(cè)方法的結(jié)果符合率低，達(dá)不到早期診斷的目的。因此，該方法不適合應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中，僅限于實(shí)驗(yàn)室診斷[10-12]。
血清學(xué)呈陽(yáng)性的結(jié)果并不能確定PRRSV是否能引起臨床發(fā)病，也不能區(qū)別是感染野毒還是疫苗毒，也不能說(shuō)明動(dòng)物機(jī)體是否為病毒的攜帶者，僅能說(shuō)明曾經(jīng)感染過(guò)PRRSV。對(duì)于血清學(xué)陰性可能是未感染PRRSV或感染但還未產(chǎn)生抗體，或以前感染過(guò)但現(xiàn)在血清轉(zhuǎn)陰，或是檢測(cè)方法的敏感性不夠或操作誤差。因此，現(xiàn)有的血清學(xué)方法不適合監(jiān)測(cè)整個(gè)豬群的群體情況，其僅能對(duì)單個(gè)個(gè)體作出初步診斷，要作出更準(zhǔn)確的診斷，還應(yīng)與免疫狀況或病毒分離或抗原的檢測(cè)相結(jié)合，才能達(dá)到對(duì)PRRS診斷、疫情凈化的目的[10-12]。
2 病原的檢測(cè)
病原的檢測(cè)主要包括免疫學(xué)檢測(cè)以及生物學(xué)檢測(cè)，其中免疫學(xué)檢測(cè)包括免疫熒光染色法、免疫過(guò)氧化物酶染色法以及免疫膠體金技術(shù)等，而生物學(xué)檢測(cè)主要進(jìn)行病毒的分離；核酸的檢測(cè)主要利用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)病毒特定的基因組進(jìn)行檢測(cè)。由于免疫學(xué)檢測(cè)存在較大的弊端，下面僅對(duì)生物學(xué)檢測(cè)以及核酸檢測(cè)技術(shù)作一簡(jiǎn)單的概述。
2.1 生物學(xué)檢測(cè)―病毒的分離
用于PRRSV分離的細(xì)胞有原代豬肺巨噬細(xì)胞（PAM）、傳代細(xì)胞系CL2621和Marc145。其中PAM最常用，因?yàn)閭鞔?xì)胞系對(duì)該病毒易感性差，故不能完全代替PAM，而且由于不是每批巨噬細(xì)胞對(duì)病毒的易感性都相同，所以在用PAM進(jìn)行分離病毒前，還要進(jìn)行批次試驗(yàn)，只有當(dāng)特定滴度的標(biāo)準(zhǔn)病毒在新的巨噬細(xì)胞中生長(zhǎng)良好時(shí)，方可使用，該方法是診斷PRRSV感染的經(jīng)典方法，多用于急性病例的確診和新疫區(qū)的確定，但是也存在不足之處，如費(fèi)用較高、勞動(dòng)強(qiáng)度較大，耗時(shí)多，且有可能污染其他病毒等，因此該方法不利于大規(guī)模豬場(chǎng)疫病的檢測(cè)[10-12]。
2.2 核酸檢測(cè)（反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）
核酸檢測(cè)（反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Reverse transcription polymer-ase chain reaction， RT-PCR）V泛應(yīng)用于PRRSV的鑒定及臨床診斷，并在方法上不斷改進(jìn)和提高，擴(kuò)增的目的片段也主要是針對(duì)PRRSV的核衣殼蛋白基因，主要的原因是PRRSV基因組中ORF7編碼的核衣殼蛋白（N蛋白）中包括所有毒株都保守的共同表位和區(qū)別于歐洲型的特異性決定簇。RT-PCR比病毒分離更省時(shí)、省力，敏感性和特異性更強(qiáng)。用于RT-PCR檢測(cè)的樣品包括血清、及肺臟、脾臟等組織[13-15]。
利用RT-PCR對(duì)試驗(yàn)感染豬進(jìn)行抗原和抗體檢測(cè)，并與病毒分離和ELISA抗體檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法可以在感染24 h后檢測(cè)到病毒的核酸，但不能分離到病毒，而抗體只能在感染后第9d檢測(cè)到，由此可見(jiàn)RT-PCR的靈敏度明顯高于病毒分離和ELISA，有利于早期診斷[13-15]。
PCR方法可以區(qū)分歐洲株與美洲株，但其臨床應(yīng)用意義并不大。國(guó)外應(yīng)用PCR診斷PRRSV已取得很大進(jìn)展，許多學(xué)者根據(jù)PRRSV不同的ORF序列，設(shè)計(jì)了不同引物，建立了檢測(cè)PRRSV核酸的RT-PCR方法。隨著RT-PCR技術(shù)的發(fā)展，也陸續(xù)出現(xiàn)了熒光標(biāo)記的RT-PCR方法，如采用TaqManTMRT-PCR或分子信標(biāo)RT-PCR方法檢測(cè)臨床樣品，這些方法比常規(guī)RT-PCR方法的特異性更強(qiáng)，敏感性更高，但需要更高的成本。應(yīng)特別注意的是，因其敏感性特別高，易引起假陽(yáng)性，因此在檢測(cè)時(shí)應(yīng)盡可能避免RNA的污染。RT-PCR方法在PRRS的診斷及監(jiān)測(cè)中發(fā)揮很大作用，在ELISA檢測(cè)為陽(yáng)性的基礎(chǔ)上，再用高敏感性的RT-PCR進(jìn)行確診，這不僅可以降低費(fèi)用，而且可拓寬RT-PCR的應(yīng)用前景，如后備種豬的篩選，持續(xù)性感染豬的診斷及豬群的凈化等[13-15]。
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1診斷方法
1．1形態(tài)學(xué)診斷AP感染人和易感動(dòng)物后，主要侵染成熟或未成熟的髓系白細(xì)胞。取可疑患者末梢血作厚、薄血涂片，經(jīng)吉姆薩染色，于中性粒細(xì)胞胞漿內(nèi)發(fā)現(xiàn)多個(gè)無(wú)形體緊密堆積在一起形成桑葚樣包涵體(morulaeelementarybody)可支持診斷。形態(tài)學(xué)診斷方法對(duì)采血時(shí)間要求嚴(yán)格，且診斷者要有較豐富的看片經(jīng)驗(yàn)，否則容易發(fā)生漏診和誤診。
1．2血清學(xué)診斷通過(guò)檢測(cè)患者血清中抗AP的IgM和IgG類(lèi)抗體水平及升高程度，可特異性診斷HGA。常用方法為間接免疫熒光(immunofluorescenceassays，IFA)法。采集急性期(發(fā)熱初期，一般發(fā)病1周內(nèi))與恢復(fù)期(至少間隔2～3周)雙份血清。如恢復(fù)期血清抗體檢測(cè)陰性，應(yīng)建議醫(yī)生采集第3份血液樣本(間隔2～4周)。如果同時(shí)檢測(cè)雙份血清，IgG抗體4倍升高，則結(jié)果強(qiáng)烈支持AP感染。如果急性期抗體升高，而恢復(fù)期沒(méi)有升高或輕微升高，則應(yīng)采集第3份血液樣本(間隔2～4周)進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)。血清學(xué)診斷方法準(zhǔn)確，特異性高，但由于抗體出現(xiàn)較晚，診斷所需時(shí)間較長(zhǎng)，故血清學(xué)檢測(cè)無(wú)法在早期對(duì)HGA進(jìn)行診斷［3］。
1．3分離培養(yǎng)病原體多用人白血病細(xì)胞系HL60進(jìn)行AP的分離培養(yǎng)。最常用的分離方法是將白細(xì)胞部分接種培養(yǎng)基，然后將100～500μL抗凝血接種到2×105或1×106個(gè)懸浮細(xì)胞內(nèi)，每2～3d染色檢查包涵體，一般5～10d可查見(jiàn)包涵體。從患者血標(biāo)本中分離AP是確診該病最可靠的方法，但細(xì)胞培養(yǎng)分離AP方法復(fù)雜和耗時(shí)，而且成功率不高。最終確認(rèn)依然需要檢測(cè)AP特異性核酸。
1．4分子檢測(cè)方法AP感染可通過(guò)檢測(cè)AP的DNA進(jìn)行診斷，AP的分子生物檢測(cè)方法可用于感染急性期的診斷，或用于后期病原體培養(yǎng)物的鑒定。分子檢測(cè)診斷方法具有較高敏感性、特異性和可重復(fù)性，而且診斷快速、操作簡(jiǎn)單。
2AP分子檢測(cè)技術(shù)
AP分子檢測(cè)技術(shù)可用于對(duì)可疑患者血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，亦可對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)后血細(xì)胞標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)也用于AP傳播媒介－蜱的基因分子檢測(cè)和分類(lèi)。AP的基因組由單股環(huán)狀染色體構(gòu)成，長(zhǎng)度為1471282bp，G+C百分比為41．6%，含有1369個(gè)開(kāi)放讀碼框(ORF)。其特征性基因?yàn)橥饽さ鞍?majorsurfaceprotein，msp)以及ankA基因，100%的菌株具有msp2基因，70%的菌株具有ankA基因。目前AP分子檢測(cè)常用的目標(biāo)包括編碼16SrRNA、熱激蛋白(heat-shockprotein，groESL)、msp蛋白、AnkA蛋白等的基因。16SrRNA高度保守，是PCR檢測(cè)最常擴(kuò)增的靶基因，熱激蛋白基因groESL擴(kuò)增雖不如16SrRNA應(yīng)用廣泛，但groESL基因在不同種屬間具有較大的變異性，因此，對(duì)于診斷及菌株的鑒定有重要意義;msp編碼AP特征性外膜蛋白，這種蛋白質(zhì)主要介導(dǎo)AP與不同宿主細(xì)胞間相互作用，并保證AP能更快地進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)。由于AP的宿主范圍很廣，包括多種脊椎動(dòng)物和非脊椎動(dòng)物，所以msp在不同來(lái)源的AP之間差異性大。其中msp2作為AP主要特征性外膜蛋白，已作為診斷AP感染的指征;ankA編碼的錨定蛋白能夠介導(dǎo)蛋白與蛋白之間的作用，因此AnkA在不同宿主間表現(xiàn)出多樣性［5］。目前ank基因鑒定通常用于msp2陽(yáng)性病例基礎(chǔ)上，進(jìn)行種屬分型［6］。AP感染的分子生物學(xué)診斷方法主要包括巢式PCR(nestedPCR)、實(shí)時(shí)定量熒光PCR(realtimePCR)和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)等。PCR和PCR相關(guān)檢測(cè)技術(shù)是診斷AP感染的常規(guī)方法，目標(biāo)基因與PCR引物見(jiàn)表1。
2．1巢式PCR(nestedPCR)巢式PCR是一種變異的PCR，使用兩對(duì)(而非一對(duì))PCR引物擴(kuò)增完整的片段。第一對(duì)PCR引物擴(kuò)增片段和普通PCR相似。第二對(duì)引物稱(chēng)為巢式引物(因其在第一次PCR擴(kuò)增片段的內(nèi)部)結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次PCR擴(kuò)增片段短于第一次擴(kuò)增產(chǎn)物。巢式PCR的好處在于，如果第一次擴(kuò)增產(chǎn)生了錯(cuò)誤片段，則第二次能在錯(cuò)誤片段上進(jìn)行引物配對(duì)并擴(kuò)增的概率極低。因此，巢式PCR檢測(cè)可提高檢測(cè)靈敏度和特異性，通常采用屬特異和種特異引物同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。PCR檢測(cè)應(yīng)分區(qū)進(jìn)行，避免污染。16SrRNA高度保守，是巢式PCR檢測(cè)AP最常擴(kuò)增的靶基因。由于AP的地域分布范圍廣，且有高度的生物學(xué)和臨床學(xué)多樣性，在比較不同地域發(fā)現(xiàn)的AP時(shí)最常用的方法就是巢式PCR。例如在波羅地海與挪威發(fā)現(xiàn)的AP比較研究就是用巢式PCR對(duì)16SrRNA和msp4進(jìn)行測(cè)序分析［16］。Wuri-tu等用巢式PCR比較日本發(fā)現(xiàn)的AP與美國(guó)和歐洲AP的P44/msp2基因結(jié)構(gòu)。熱激蛋白基因groESL擴(kuò)增雖不如16SrRNA應(yīng)用廣泛，但groEL基因在不同種屬間具有較大的變異性。Adrian等［17］通過(guò)巢式PCR鑒定和比對(duì)不同國(guó)家野生動(dòng)物體內(nèi)AP的groEL不同，鑒定出新的菌株。因此，對(duì)于診斷及菌株的鑒定，groEL基因有重要意義。Massung等［18］在對(duì)ank基因鑒定并對(duì)AP進(jìn)行種屬分型時(shí)也應(yīng)用該種方法。
2．2實(shí)時(shí)定量熒光PCR(realtimePCR)實(shí)時(shí)定量熒光PCR是將熒光共振能量傳遞現(xiàn)象、光學(xué)技術(shù)與常規(guī)PCR結(jié)合的一種PCR檢測(cè)技術(shù)。即在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，在PCR指數(shù)擴(kuò)增期間通過(guò)連續(xù)檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱來(lái)實(shí)時(shí)測(cè)定特異性產(chǎn)物的量，從而實(shí)現(xiàn)核酸的精確定量，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)目的基因的初始量進(jìn)行總量分析。由于實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀自動(dòng)化程度高，因此比常規(guī)PCR特異性更強(qiáng)且有效解決了常規(guī)PCR的污染問(wèn)題。常用方法有SYBRgreen法和探針?lè)?TaqManprobe)。Klaus-Peter等［10］將熒光染料摻入法(SYBRgreen)用于AP的抗生素藥物敏感性研究中。Joshua等［14］的研究中用探針?lè)▉?lái)鑒定AP和伯氏疏螺旋體。
2．3環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是一種2000年開(kāi)始出現(xiàn)的適用于基因診斷的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)。其特點(diǎn)是針對(duì)靶基因的至少6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)至少4種特異引物，在鏈置換DNA聚合酶(BstDNApolymerase)的作用下，60～65℃恒溫?cái)U(kuò)增，15～60min即可實(shí)現(xiàn)109～1010倍的核酸擴(kuò)增，具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)時(shí)間短、特異性強(qiáng)、產(chǎn)物易檢測(cè)等特點(diǎn)。在DNA合成時(shí)，從脫氧核糖核酸三磷酸底物(dNTPs)中析出的焦磷酸離子與反應(yīng)溶液中的鎂離子反應(yīng)，產(chǎn)生大量焦磷酸鎂沉淀，呈現(xiàn)白色。因此，可以把渾濁度作為反應(yīng)的指標(biāo)，只用肉眼觀(guān)察白色渾濁沉淀，就能鑒定擴(kuò)增與否，而不需要繁瑣的電泳和紫外觀(guān)察。由于LAMP反應(yīng)不需要PCR儀和昂貴的試劑，操作簡(jiǎn)單方便。Lei等［15］用LAMP共針對(duì)目標(biāo)基因8個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)6種特異性引物，特異性達(dá)100%。相比傳統(tǒng)PCR技術(shù)，LAMP的特點(diǎn)更適合HGA在農(nóng)村用于早期診斷，有著廣泛的應(yīng)用前景。
3小結(jié)與展望
丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(HCV)感染引起的一種重要的世界性傳染病[1]，這種病毒主要經(jīng)由血液傳播，也可能存在其他傳播途徑如母嬰傳播、性傳播和家庭內(nèi)接觸傳播。約有近半數(shù)的HCV感染傳播途徑不明確。丙型肝炎的流行呈全球性，是歐美及日本等國(guó)家終末期肝病的最主要原因。根據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，全球HCV的感染率約為3％，估計(jì)約2億人感染了HCV，每年新發(fā)丙型肝炎病例約有3.5萬(wàn)例。目前尚無(wú)治療丙型肝炎的疫苗，也沒(méi)有有效的治療方法。因此防控丙型肝炎傳染源及阻斷傳播途徑最為有效的手段就是早期準(zhǔn)確診斷并及時(shí)發(fā)現(xiàn) HCV感染者。從傳染源和傳播途徑兩方面控制丙型肝炎[2]。正因?yàn)槿绱耸澜绺鲊?guó)都在不遺余力地研究診斷丙型肝炎的新技術(shù)。自1989年建立了丙肝病毒抗-HCV檢測(cè)方法以來(lái)，隨著醫(yī)學(xué)檢測(cè)技術(shù)和儀器的不斷發(fā)展，丙型肝炎的檢測(cè)技術(shù)一直處于不斷發(fā)展中。到目前為止，丙型肝炎檢測(cè)技術(shù)主要有抗-HCV檢測(cè)、HCV-RNA核酸擴(kuò)增檢測(cè)、HCV核心抗原的檢測(cè)以及同時(shí)檢測(cè)抗-HCV和HCV核心抗原4種類(lèi)型。本文將對(duì)丙型肝炎臨床檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展與展望做一綜述，現(xiàn)報(bào)道如下。
1 抗-HCV的檢測(cè)
最早出現(xiàn)的HCV檢測(cè)技術(shù)是抗-HCV的檢測(cè)。由于HCV在病人外周血液中的含量及病毒抗原的含量很低，這就使得用常規(guī)方法難以直接檢測(cè)，經(jīng)過(guò)十幾年的不斷改進(jìn)和發(fā)展，其檢測(cè)方法又演變出多種，如:雙抗原夾心 ELISA、間接酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(間接 ELISA)、重組免疫印跡法(RIBA)、蛋白芯片檢測(cè)法以及免疫層析法。在這些方法之中，重組免疫印跡法 (RIBA)是抗體檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，蛋白芯片檢測(cè)法主要用于抗-HCV的分型。而ELISA由于其操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)設(shè)備廉價(jià)，因此成為應(yīng)用最廣的抗體檢測(cè)技術(shù)。
根據(jù)出現(xiàn)時(shí)間的先后以及使用抗原的不同，抗-HCV檢測(cè)技術(shù)可分成三代。第一代抗-HCV IgG試劑盒所用的抗原來(lái)自病毒基因組非結(jié)構(gòu)區(qū) (C100)，它的使用使 HCV的輸血感染率下降了80%以上。但其缺陷是:靈敏度較低，抗體檢出時(shí)間較晚， 敏感性也較高，達(dá)到80％～90％，但假陽(yáng)性較高。第二代試劑除了包被C100抗原外又加入了HCV核心區(qū)多肽C22—3和非結(jié)構(gòu)區(qū)抗原C33C。抗-C22-3和抗-C33C感染后出現(xiàn)較早，敏感性和特異性明顯提高，感染后8～12周即可檢測(cè)。且對(duì) HCV的特異性較好，二者聯(lián)合應(yīng)用可進(jìn)一步提高檢出率。第三代HCV抗體ELISA試劑中采用了重組的NSS多肽，核心區(qū)抗原比例相對(duì)下降，而相應(yīng)地增加了非結(jié)構(gòu)區(qū)的NSS區(qū) C33C抗原的比例，添加了NSS區(qū)抗原使其敏感性和特異性得到進(jìn)一步改善。
上述三代抗-HCV檢測(cè)方法多采用間接 ELISA，雖然也有過(guò)雙抗原夾心直接檢測(cè)抗-HCV的報(bào)道[3]，但由于HCV抗原存在不穩(wěn)定性，因此至今仍無(wú)商品化的試劑盒。目前我國(guó)市售的抗- HCV試劑盒普遍是采用間接法的第三代抗-HCV ELISA試劑盒和膠體金試劑盒，其特異性可以達(dá)到92%～100%。但由于各廠(chǎng)家使用的HCV基因重組抗原的質(zhì)量和各抗原片段包被比例有所不同，從而使各廠(chǎng)家試劑的靈敏度和特異性存在一定的差異，導(dǎo)致抗一HCV檢測(cè)結(jié)果的不一致，產(chǎn)生漏檢和假陽(yáng)性等[4]，未能解決在正常ALT者和健康獻(xiàn)血者存在的假陽(yáng)性問(wèn)題。加上少部分免疫功能不正常的HCV感染者，則不能檢出抗一HCV。另外，由于“窗口期”的存在，仍有一定的漏檢率[5]。目前抗-HCV的檢測(cè)方法仍有改進(jìn)的潛力，隨著對(duì)HCV的研究不斷深入，更多的 HCV蛋白會(huì)被發(fā)現(xiàn)，其中新型核心蛋白和外膜蛋白被認(rèn)為能有效提高抗-HCV的靈敏度，但其對(duì)抗體的檢出率依賴(lài)于抗原的獲得方法，可能與抗原的構(gòu)象表位有關(guān)[6，7]。
2 HCV-RNA核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)(Nucleic-acid Amplification Technology NAT)
從外周血中檢出HCV RNA是HCV復(fù)制活躍的可靠指標(biāo)，在感染2個(gè)星期內(nèi)的血清中可檢測(cè)到HCVRNA，在感染自然恢復(fù)前血清中 HCVRNA將達(dá)到一個(gè)高峰[8]， 目前NAT檢測(cè)被國(guó)內(nèi)外部分機(jī)構(gòu)作為 HCV感染的確認(rèn)方法。但HCV RNA在達(dá)到峰值或重新出現(xiàn)前數(shù)天或數(shù)周內(nèi)偶爾也可能檢測(cè)不到[9]。同時(shí)HCV RNA還受進(jìn)食的影響，易與血中脂質(zhì)及脂蛋白結(jié)合，降低檢出率[10]。因此在一定程度上影響了NAT檢測(cè)方法的完美。另外由于NAT檢測(cè)技術(shù)本身在技術(shù)和設(shè)備上要求較高，且耗時(shí)、實(shí)驗(yàn)步驟較多(其中任何步驟出現(xiàn)問(wèn)題均影響其檢出)，因此該方法也容易因污染而出現(xiàn)假陽(yáng)性，難以在常規(guī)工作或基層實(shí)驗(yàn)室推廣，限制了其應(yīng)用的普遍性。
NAT檢測(cè)技術(shù)同為檢測(cè)HCV RNA，但不同的廠(chǎng)商發(fā)展出不同的方法和技術(shù)，其中PCR技術(shù)發(fā)展得最為迅速，也得到了最廣泛的應(yīng)用，最早的是 RT-PCR，然后是套式PCR，現(xiàn)在是實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測(cè)靈敏度特異性不斷提高，且實(shí)現(xiàn)了全自動(dòng)定量檢測(cè)。最新的NAT研究有環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)以及基因芯片技術(shù)[11，12]，由于LAMP技術(shù)操作簡(jiǎn)單，且無(wú)需特殊儀器，具有廣闊的應(yīng)用前景。
3 HCV抗原的檢測(cè)
目前報(bào)道有兩類(lèi)HCV抗原包括非結(jié)構(gòu)抗原和核心抗原的檢測(cè)可作為HCV感染的指標(biāo)。血清中HCV抗原的檢測(cè)有利于 HCV感染患者的早期發(fā)現(xiàn)，特別是某些免疫功能紊亂、免疫功能低下的患者和某些不產(chǎn)生抗體的攜帶者。HCV核心抗原與 HCV RNA的動(dòng)力學(xué)變化密切相關(guān)，可以作為HCV復(fù)制的標(biāo)志[13]。
近年來(lái)對(duì)HCV抗原的檢測(cè)方法的研究不斷取得進(jìn)展，關(guān)鍵點(diǎn)在于單克隆抗體的研制以及抗原抗體復(fù)合物解離劑的研究。近期美國(guó)Ortho公司已推出了用雙抗體夾心法定性或定量檢測(cè)血清樣品中總的或游離的HCV核心抗原ELISA試劑盒，與 RT-PCR方法相比，具有操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求較低以及假陽(yáng)性率低等特點(diǎn)，在臨床上可用于HCV血清學(xué)轉(zhuǎn)換前的早期急性丙型肝炎診斷、抗-HCV陽(yáng)性感染者的病毒血癥分析以及HCV感染者治療前后病毒血癥追蹤分析等[14]。HCV核心抗原存在的時(shí)間較短(約27～70d)，所以HCV核心抗原的檢測(cè)還要結(jié)合抗-HCV的結(jié)果。同時(shí)HCV核心區(qū)基因的變異也可能影響了HCV核心抗原的檢測(cè)，比如HCV核心區(qū)49位氨基酸的突變就降低了抗原測(cè)定的敏感性[15]。改進(jìn)現(xiàn)行試劑盒的主要途徑是提高單克隆抗體對(duì)于天然抗原的構(gòu)象表位的親和力。
對(duì)于非結(jié)構(gòu)蛋白的檢測(cè)主要為NS3、NS4和NS5位點(diǎn)的蛋白[16]，由于這部分蛋白出現(xiàn)變異的概率較大，目前僅見(jiàn)報(bào)道。
4 同時(shí)檢測(cè)抗-HCV和HCV核心抗原
聯(lián)合檢測(cè)抗原抗體的思路是HCV篩查試劑盒和血清學(xué)檢測(cè)的發(fā)展方向。目前主要把HCV核心抗原和外周蛋白抗體及部分核心抗體相結(jié)合的檢測(cè)試劑盒[17]。HCV核心抗原是HCV感染者體內(nèi)出現(xiàn)的早期感染指標(biāo)，幾乎與HCV RNA同時(shí)出現(xiàn)，核心抗原和HCV RNA的動(dòng)力學(xué)變化密切相關(guān)。
HCV核心抗原檢測(cè)用雙抗體夾心法定性或定量檢測(cè)血清樣品中的HCV核心抗原。該方法不受被檢測(cè)樣品中抗-HCV的干擾，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。可用于HCV早期急性丙型肝炎診斷，抗-HCV陽(yáng)性感染者的病毒血癥分析以及HCV感染者治療前后病毒血癥追蹤分析[18]。目前已有兩家商品化的試劑盒面世，但是這兩種試劑盒都使用兩步檢測(cè)，而且檢測(cè)時(shí)間都較長(zhǎng)（超過(guò)2h），不利于快速的篩查和POCT工作。另外這兩種試劑盒都不能區(qū)分陽(yáng)性樣本中抗原和抗體的存在情況，不利于進(jìn)一步分析病情。
綜上所述，無(wú)論HCV檢測(cè)技術(shù)的怎么發(fā)展，都必須秉著快速、準(zhǔn)確和有效這些原則。由此可以預(yù)測(cè)未來(lái)HCV檢測(cè)技術(shù)會(huì)朝著兩個(gè)方向發(fā)展，一方面是要求技術(shù)上的快速、精確反應(yīng) HCV感染狀況的檢測(cè)，降低假陽(yáng)性的概率，使人們盡早發(fā)現(xiàn)病情。另一方面是有助于治療HCV和療效觀(guān)察的檢測(cè)，不斷優(yōu)化治療HCV的方法，爭(zhēng)取早日研究出治療HCV的疫苗。對(duì)于第一種方向，人們較為容易理解，因?yàn)殡S著實(shí)驗(yàn)技術(shù)的不斷進(jìn)步，HCV檢測(cè)的靈敏度逐步提高，HCV感染的“窗口期”將不斷縮短。第二種方向也是當(dāng)前分子診斷領(lǐng)域的方向，人們可以通過(guò)新的檢測(cè)方法或是幾種 HCV檢測(cè)方法的綜合應(yīng)用來(lái)判斷病人的病情，從而給予臨床治療提供及時(shí)幫助和指導(dǎo)。
參 考 文 獻(xiàn)
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關(guān)鍵詞：羊奶；牛奶；豆?jié){；多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR
中圖分類(lèi)號(hào)：S879.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2016）06-0118-06
由于羊奶中含有的維生素和微量元素均高于牛奶，并且含有大量的乳清蛋白，其所含有的蛋白結(jié)構(gòu)成分與母乳基本相同，被營(yíng)養(yǎng)學(xué)界稱(chēng)之為“奶中之王”[1]。羊奶中不含引起人體過(guò)敏的異性蛋白，尤其適合胃腸較弱、體質(zhì)較差的嬰幼兒飲用，但市場(chǎng)上的羊奶品質(zhì)參差不齊。隨著消費(fèi)者認(rèn)可度的不斷提高，在利益的驅(qū)動(dòng)下，在羊奶中摻入牛奶或者豆?jié){的現(xiàn)象非常普遍，摻假手段多種多樣，不斷變換，僅靠感官鑒評(píng)和傳統(tǒng)的試驗(yàn)方法已不能滿(mǎn)足市場(chǎng)需要[2]，嚴(yán)重影響我國(guó)奶業(yè)的健康發(fā)展。
目前，用于檢測(cè)羊奶摻假的方法主要有氣象色譜、液相色譜、電泳、PCR、ELISA和近紅外光譜法等[3～6]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法是以DNA為基礎(chǔ)的一種檢測(cè)技術(shù)，不受摻假形式的影響，可以進(jìn)行快速、批量、自動(dòng)、實(shí)時(shí)檢測(cè)分析，具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)在動(dòng)物源性成分檢測(cè)項(xiàng)目上逐步取代一般PCR方法成為最常用的分子生物學(xué)檢測(cè)手段[7]。為了保障羊乳及其產(chǎn)品品質(zhì)，確保消費(fèi)者的利益，建立準(zhǔn)確檢測(cè)牛羊乳及豆?jié){混摻的技術(shù)越來(lái)越重要。本試驗(yàn)旨在利用TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，建立一種快速、準(zhǔn)確檢測(cè)羊奶中是否摻有牛奶和豆?jié){的方法。
1材料與方法
1.1材料與試劑
1.1.1試驗(yàn)材料試驗(yàn)所用標(biāo)準(zhǔn)液態(tài)牛奶、液態(tài)羊奶取自山東省畜牧研究所奶牛及山羊養(yǎng)殖基地，液態(tài)豆?jié){是本實(shí)驗(yàn)室用大豆加工而成。市售樣品為購(gòu)自濟(jì)南市大、中、小型超市的不同品牌奶制品。
1.1.2主要試劑與儀器試劑：Chelex-100（天根生化科技有限公司，北京）、蛋白酶K（TaKaRa，日本）、核算定量檢測(cè)試劑盒（TaKaRa，日本）。
儀器：ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI，美國(guó)）、高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf，德國(guó)）、Nanodrop 核酸蛋白含量測(cè)定儀（Eppendorf，德國(guó)）。
1.2試驗(yàn)方法
1.2.1樣品基因組DNA的提取分別取牛奶、羊奶、豆?jié){液體樣品2 mL加入2 mL無(wú)菌離心管中，2 500 r/min、4℃恒溫離心30 min，棄上清液保留沉淀；向離心管中加入1 mL無(wú)菌磷酸鉀緩沖液（pH 7.4），輕輕混勻后轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，3 500 r/min室溫離心10 min，棄上清；向沉淀中分別加入280 μL 5%Chelex-100和20 μL 20 mg/mL蛋白酶K，56℃孵育30 min，漩渦震蕩10 s混合均勻，100℃煮沸8 min，13 000 r/min離心3 min；將上清加入吸附柱中13 000 r/min離心1 min收集液體；向收集液中加入20 μL GlassMilk 和600 μL gDNA Binding Buffer充分混勻，65℃水浴15 min（其間不斷輕柔地上下翻轉(zhuǎn)離心管），室溫放置5 min（其間不斷輕柔上下翻轉(zhuǎn)離心管）；4 000 r/min離心1 min，棄上清；向離心管中加入500 μL 70%乙醇，8 000 r/min離心1 min，棄上清，重復(fù)2次；加入500 μL無(wú)水乙醇輕輕混勻，8 000 r/min離心1 min，棄上清；8 000 r/min離心30 s，用10 μL槍頭吸走殘余液體，室溫放置至徹底干燥；加入100 μL TE（pH 7.0）70℃水浴5 min，瞬間離心，轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管中-20℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂肗anodrop 核酸蛋白含量測(cè)定儀測(cè)定核酸濃度。
1.2.2引物及探針設(shè)計(jì)分別參照牛、山羊和綿羊線(xiàn)粒體基因組中高度保守的16S rRNA基因序列和大豆的KTi-S基因（GI：510514）序列，用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)牛奶、羊奶通用引物序列（UF、UR），大豆引物序列（Lectin-F、Lectin-R），內(nèi)參引物序列（IACF、 IACR）。使用Beacon Designer 2.0 設(shè)計(jì)特異分子信標(biāo)（MB）探針，其中牛奶探針（NP）用CY3標(biāo)記，羊奶探針（YP）用JOE標(biāo)記，豆?jié){探針（LectinP）用FAM標(biāo)記，內(nèi)標(biāo)探針（IACP）用ROX標(biāo)記，3′端的淬滅基團(tuán)用Dabcyl修飾。引物及探針序列見(jiàn)表1。
1.2.3多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系建立通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)體系中的引物濃度、探針濃度和退火溫度等條件，建立分別檢測(cè)羊、牛和大豆源性成分的單重?zé)晒舛縋CR體系。將4種引物及探針組合在一起，分別或同時(shí)以羊、牛和大豆基因組DNA為模板，優(yōu)化引物、探針濃度和退火溫度等反應(yīng)體系和條件，建立能同時(shí)檢測(cè)羊、牛和大豆源性成分的多重?zé)晒舛縋CR體系。
1.2.4結(jié)果判定實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增結(jié)束后獲取Ct值，當(dāng)Ct值
1.2.5基因組DNA檢測(cè)靈敏度試驗(yàn)分別提取羊奶、牛奶及豆?jié){的基因組DNA，用Nanodrop定量到50 ng/μL，做10倍梯度稀釋?zhuān)?0-1、10-2、10-3、10-4），對(duì)每個(gè)梯度按照優(yōu)化后的擴(kuò)增體系和條件分別進(jìn)行檢測(cè)。
1.2.6羊奶中摻雜牛奶或豆?jié){靈敏度試驗(yàn)將豆?jié){和羊奶以一定體積比例混合，制成豆?jié){含量分別為0、0.1%、0.5%、1%、5%、10%和20%的混合奶樣品；將牛奶和羊奶以一定比例混合，制成牛奶含量分別為0、0.1%、0.5%、1%、5%、10%和20%的混合奶樣品。按照優(yōu)化后的反應(yīng)體系和條件分別進(jìn)行檢測(cè)。
1.2.7市售樣本檢測(cè)使用優(yōu)化后的熒光定量PCR方法對(duì)35份奶制品樣本進(jìn)行源性鑒定，驗(yàn)證檢測(cè)方法的實(shí)用價(jià)值。
2結(jié)果與分析
2.1多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系的建立
參照優(yōu)化的單重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系及條件，將羊、牛、大豆和內(nèi)標(biāo)質(zhì)控的引物及探針組合在一起，先分別以羊、牛和大豆基因組DNA為模板優(yōu)化反應(yīng)體系，然后同時(shí)加入3種基因組DNA模板，通過(guò)調(diào)整反應(yīng)體系中主要成分濃度和體積以及反應(yīng)條件，優(yōu)化反應(yīng)體系，最終篩選出最適宜的多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系。20 μL反應(yīng)體系包括5× Premix 4 μL，HS-Taq酶（5 U/μL）0.2 μL，引物 Mix（2 μmol/L）2 μL， 探針 Mix（2 μmol/L）2 μL，內(nèi)標(biāo)質(zhì)控IAC DNA模板（1 ng/μL）2 μL，檢測(cè)樣品DNA 模板2 μL，雙蒸水7.8 μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃、30 s；95℃、5 s，60℃、34 s，40個(gè)循環(huán)，60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。圖1為多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線(xiàn)圖，其中A圖同時(shí)檢測(cè)出羊和牛源性成分，大豆源性為陰性；B圖樣本中同時(shí)檢測(cè)出大豆和牛源性成分，羊源性成分為陰性。
2.2基因組DNA靈敏度試驗(yàn)
結(jié)果（圖2）顯示，當(dāng)模板DNA濃度稀釋至10-4倍，即DNA質(zhì)量為0.01 ng時(shí)，所建立的熒光定量PCR檢測(cè)體系仍然能夠產(chǎn)生良好的特異擴(kuò)增曲線(xiàn)。此時(shí)純羊奶、牛奶及豆?jié){模板檢測(cè)到的Ct值分別為33.64±0.02、34.80±0.018和34.87±0.03，均
2.3羊奶中摻雜牛奶或豆?jié){靈敏度試驗(yàn)
將牛奶或豆?jié){以0.1%、0.5%、1%、5%、10%和20%的體積比摻入至純羊奶中，結(jié)果顯示當(dāng)牛奶或豆?jié){含量為0.1%時(shí)，多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系仍有特異性擴(kuò)增曲線(xiàn)，并且其Ct值均
2.4市售樣本的實(shí)際檢測(cè)
利用本研究建立的羊奶中牛奶和大豆源性多重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)體系對(duì)35份市售羊奶、羊奶粉、牛奶、牛奶粉進(jìn)行源性鑒定。結(jié)果如表2所示，15份羊奶及相關(guān)制品中都含有羊源性成分，其中10份含有牛源性成分，4份含有大豆成分，分別占樣本總數(shù)的66%和26%；20份牛奶及相關(guān)制品中全部檢出牛源性成分，9份樣品中檢測(cè)出大豆成分，占樣本總數(shù)的45%。
3討論與結(jié)論
目前現(xiàn)有的牛羊乳檢測(cè)方法多是依據(jù)羊乳和牛乳化學(xué)組成上的差異，以牛羊乳中蛋白質(zhì)、脂肪、DNA、維生素等為特征指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)[8]。色譜-質(zhì)譜結(jié)合技術(shù)是分離蛋白質(zhì)、定量檢測(cè)牛羊乳混摻的重要方法，有研究表明該方法可以實(shí)現(xiàn)牛羊乳混摻的快速檢測(cè)，能檢測(cè)牛羊混合乳中牛乳含量的最低水平為5%[9]。毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用（CE-MS）技術(shù)也在牛羊乳檢測(cè)中得到了應(yīng)用[10]，但存在檢測(cè)靈敏度偏低的缺點(diǎn)[11]。利用近紅外光譜法檢測(cè)摻假羊奶需要足夠的專(zhuān)業(yè)知識(shí)，建立模型才能對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，對(duì)檢測(cè)人員的要求較高，不易普及推廣[12]。熒光定量PCR方法是基于DNA水平的檢測(cè)，克服了以上技術(shù)的不足，被越來(lái)越多地應(yīng)用到奶制品的檢測(cè)中。由于核酸比蛋白質(zhì)更穩(wěn)定，抗熱能力更強(qiáng)，并且含有更多遺傳信息，所以基于DNA的動(dòng)物源性檢測(cè)方法比蛋白免疫法更有優(yōu)勢(shì)[13]。
曾少靈等用多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)牛、山羊和綿羊源性成分[14]；孟芳等應(yīng)用熒光定量PCR方法僅能鑒別牛、羊奶[15]；劉小艷等用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)模擬奶制品中常見(jiàn)谷物成分的檢出限為0.5%[16]。本研究參照牛、山羊和綿羊線(xiàn)粒體基因組中高保守的16S rRNA基因和大豆的KTi-S基因?yàn)榘谢蛟O(shè)計(jì)探針建立多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，該方法不僅能夠針對(duì)羊奶、牛奶和豆?jié){進(jìn)行快速準(zhǔn)確的鑒別，而且能對(duì)奶制品進(jìn)行摻假檢測(cè)；在擴(kuò)增循環(huán)內(nèi)只出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線(xiàn)無(wú)交叉擴(kuò)增曲線(xiàn)；對(duì)純DNA含量的最低檢出濃度為0.01 ng；對(duì)模擬摻假的奶制品中目標(biāo)成分的最低檢出限為0.1%（V/V），說(shuō)明本研究建立的多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法具有特異性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。經(jīng)實(shí)際市售奶制品檢測(cè)驗(yàn)證了其可行性和適用性，適用于奶類(lèi)樣品摻假的快速檢測(cè)。
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