時間：2023-05-31 09:11:35
開篇：寫作不僅是一種記錄，更是一種創造，它讓我們能夠捕捉那些稍縱即逝的靈感，將它們永久地定格在紙上。下面是小編精心整理的12篇細胞凋亡，希望這些內容能成為您創作過程中的良師益友，陪伴您不斷探索和進步。
胰腺炎的病理生理過程，但要從本質上闡明細胞凋亡與胰腺炎之間的關系應從細胞凋亡的分子機制來進行研究。現在認為細胞調亡參與胰腺炎發病主要有兩種機制：一類是受基因調控；另一類則是非基因調控。
1基因調控
受基因調控的細胞調亡又稱為程序性細胞死亡。一般分為兩類：一類是直接調控，如癌基因；另一類則是間接調控。如生物活性分子，通過誘導癌基因的表達發揮調控作用。
癌基因中bc1-2基因家族是最受關注的與細胞凋亡相關的基因之一。Wada等[1]對胰管結扎（PDL）鼠應用抗bc1-2單克隆抗體和抗增殖細胞核抗原（PCNA）單克隆抗體以免疫印跡和免疫組化方法對bc1-2和PCNA進行檢測。結果顯示，PDL鼠胰腺導管上皮細胞的bc1-2表達在第四、五天高于對照組2~5倍。bc1-2和PCNA免疫染色在對照組的胰腺導管上皮為微弱的染色，而在PDL鼠胰腺導管皮bcl-2和PCNA免疫染色陽性細胞數量增加，分別在第二天和第三天達最高值。該結果表明，bc1-2具有抑制胰腺導管上皮細胞凋亡的功能。為進一步研究bc1-2基因家族中各基因的作用，Miyamoto等[2]研究PDL和雨蛙肽誘導急性胰腺炎兩種鼠實驗模型和人慢性阻塞性胰腺炎（COP）胰腺外分泌細胞bc1-2家族相關基因的表達。結果顯示，在正常胰腺未見bc1-2基因家族表達；在PDL組胰管結扎后1天在胰腺細胞即觀察到bax和bc1-x表達，且在第二、三天尤為顯著，而其時胰腺腺細胞也發生凋亡。同時導管細胞增加形成導管管狀復合體，導管細胞內bc1-2、bc1-x染色增加并在第五天達最大值。鼠急性胰腺炎模型首次注射雨蛙肽后8小時和48小時發現胰腺細胞凋亡，同時應用免疫組化方法觀察到胰腺細胞中存在 bax和bc1-x表達。COP時導管管狀復合體導管細胞bc1-2、bc1-x、mc1-1染色陽性，但bax染色陰性。上述結果表明，在兩種鼠胰腺炎模型中胰腺細胞內bax誘導細胞調亡；而bc1-2、mc1-1可能在防止導管細胞凋亡和形成導管管狀復合體中起作用；bc1-x有既可誘導又可抑制細胞凋亡的雙重作用。雖然許多實驗證明bc1-2基因家族在胰腺細胞凋亡中發揮重要作用，但其作用機制尚未完全闡明。
癌基因中另一個與細胞凋亡相關的基因是被稱為“基因組衛士”的野生型p53。Maacke等[3]在行ERCP時收集了27例慢性胰腺炎病人胰液細胞學標本，并應用一系列p53特異性單抗PAb1620、PAb1801、PAb240及CM-1（人重組p53多克降抗血清）以免疫過氧化酶染色觀察p53表達情況，同時以TUNEL法檢測調亡細胞。結果示，27例慢性胰腺炎病人中有16例（59%）p53蛋白表達陽性，11例PAb1620表達陽性，同時發現有凋亡細胞。可能的機制是慢性胰腺炎時氧自由基和一氧化氮基團損傷DNA。p53表達增加可能是DNA損傷的結果，并在DNA損傷的基礎上誘導細胞調亡。有人認為野生型p53提高細胞內bax蛋白表達使得bc1-2/bax比例失衡而促進細胞凋亡[4]。
在基因調控與細胞凋亡關系的研究中，另一熱點課題是一些間接調控細胞凋亡的生物活性分子，如轉化生長因子（TGF）β、腫瘤壞死因子（TNF）等。最近，Subramanian等[5]從源于人中胚層的成骨細胞中識別一種TGF-β調控的鋅指編碼基因的TIEG（TGF-β誘導的早期基因）與胰腺炎細胞凋亡有關。為進一步研究TGF-β在胰腺外分泌細胞群中的表達、功能及其調控機制，Tachibana等[6]對培養的鼠胰腺AR42J細胞和人五種胰腺外分泌細胞PANC1、MIAPaCa2、BxPC3、HST66T和Capan1進行免疫印跡分析，結果發現，在這六種外分泌細胞中均有豐富的TIEG mRNA表達。應用純化的TIEG親和抗體進行定位檢查發現TIEG存在于正常人胰腺外分泌部導管和腺細胞群。研究還發現，經TGF-β處理上述細胞2小時后可見TIEG表達上調。為進一步觀察TIEG的表達增加是否誘導胰腺外分泌細胞凋亡，用5ng/ml tGF-β1處理PANC1細胞24小時、48小時和72小時，結果顯示，在任一時間點TGF-β1都增加凋亡率，尤以72小時后為最甚。為進一步證實TIEG表達具有增加誘導凋亡功能，還進行了轉染實驗。用10μg表達TIEG載體（pMEX-neo-TIEG）轉染PANC1細胞和僅轉染對照載體（pMEX-neo）的PANC1細胞及未轉染細胞進行研究。MTS增殖分析結果示，未轉染細胞和pMEX-neo細胞生長正常；pMEX-neo-TIEG細胞增殖停止，而且72小時后pMEX-neo-TIEG細胞量較實驗初低。DNA梯形圖譜分析表明，pMEX-neo-TIEG細胞凋亡數在任一時刻均超過30%，而且還發現pMEX-neo-TIEG細胞凋亡率比TGF-β1處理的PANC1細胞凋亡率高，這可能是觀察到的TGF-β1處理的PANC1細胞TIEG上調是瞬時的，而pMEX-neo-TIEG細胞內的TIEG上調則是穩定的。因此，TGF-β誘導的TIEG表達增加可誘導細胞凋亡。
還有一些資料表明，TNF是介導細胞凋亡的介質[7]，可能的機制是TNF激活T細胞表達Fas配體，Fas配體再與靶細胞結合促使靶細胞凋亡。
不僅TGF-β、TNF這些因子通過誘導癌基因表達發揮調控作用，而且一些生物活性物質也有類似的機制。有學者報道，用維生素K3和超過生理濃度的雨蛙肽（＞10-10M）[8]和用低濃度peroxynitrite（2~5μM）[9]分別培養鼠胰腺AR42J細胞，結果均可觀察到細胞凋亡現象，且發現野生型p53表達增加。上述結果表明，一些生物活性物質可能通過野生型p53表達增加誘導細胞凋亡。
2非基因調控
近年來，盡管有關蛋白質和RNA合成抑制劑抑制凋亡研究已證實蛋白質大分子合成是凋亡的另一重要生化特征，同時證實細胞凋亡是一種由內在基因編碼調控的細胞死亡方式[10]。但也有Fas介導細胞凋亡不依賴蛋白質合成的報道[11]。一些損傷因子直接或間接損傷DNA而致細胞凋亡，如缺血再灌注等。這些現象表明凋亡除受基因調控外還受非基因調控。
Fujimoto等[12]用血管鉗鉗夾鼠胰腺下方的脾動脈1小時后再松開血管鉗造成選擇性胰尾部缺血再灌注的實驗模型，然后用DNA凝膠電泳方法觀察細胞凋亡情況，結果在缺血再灌注后48小時觀察到胰腺細胞凋亡的典型DNA梯形圖譜。該實驗表明，缺血再灌注可誘導胰腺細胞凋亡，但其機制尚不太清楚。
盡管從凋亡的分子機制研究凋亡與胰腺炎關系取得了一些進展，但仍需進一步闡明凋亡在胰腺炎中的確切作用機制，從而使之應用于臨床實踐。
新近，Matsuzaki等[13]研究發現，在雨蛙肽誘導的急性胰腺炎的急性階段很少觀察到細胞凋亡，但在急性期后恢復階段則見大量細胞凋亡。而Tanaka等[14]研究觀察到，在不同的慢性胰腺炎實驗模型中顯示凋亡的顯著性。這些結果表明，細胞凋亡可能是胰腺炎病理生理中的一個環節，可能使胰腺炎向好的方向發展，亦可能使病情惡化。
3實驗性胰腺炎的凋亡誘導治療
Kaiser等[15]報道，在五種急性胰腺炎模型中急性胰腺炎嚴重程度與凋亡呈負相關現象，即在阻塞鼠膽胰共同通路和輸注大劑量雨蛙肽誘導的輕度胰腺炎中可觀察到細胞凋亡，而在阻塞負鼠膽胰共同通路和年幼雌鼠CDE飲食（無膽堿而乙硫氨酸充足的食物）誘導的重癥胰腺炎則觀察到壞死。凋亡與胰腺炎嚴重程度呈負相關，表明細胞凋亡可能是對胰腺損傷的有利反應。最近有研究提出，誘導細胞凋亡可減輕胰腺炎的嚴重程度。Saluja等[16]報道，在細胞凋亡存在條件下可減輕雨蛙肽誘導的胰腺炎嚴重程度。給予實驗鼠5周大豆飲食后轉為正常飲食27小時，然后重復注射超大劑量雨蛙肽50μg·kg-1·h-1共12小時誘導胰腺炎，對照組給予5周正常飲食后注射同樣劑量的雨蛙肽誘導胰腺炎。結果發現，在5周大豆飲食繼而轉為正常飲食后，原來肥大的胰腺腺體迅速縮小，并且觀察到縮小期間伴有大量的腺細胞凋亡，在縮小期間注射雨蛙肽誘導的胰腺炎炎癥程度為2+，而對照組炎癥為4+（4+表示廣泛的炎癥，0表達無炎癥）。結果表明，在腺細胞凋亡時注射雨蛙肽，可減輕其誘導的胰腺炎嚴重程度。為進一步證實上述結果，Kaiser等[10]在結扎鼠膽胰共同通路誘導胰腺炎后給予蛋白質合成抑制劑環已酰亞胺以抑制細胞凋亡，結果發現抑制細胞凋亡后加重胰腺炎病變程度。另外一些學者用實驗證明DA-9601[17]和1-cyano-2-hydroxy-3-butene(CHB)[18]誘導細胞凋亡也減輕了雨蛙肽誘導的胰腺炎嚴重程度。
由此可見，誘導調亡可能會降低胰腺炎的嚴重程度。盡管這些研究僅限于動物實驗水平，但仍顯示出細胞凋亡用于胰腺炎臨床實踐的美好前景。相信隨著細胞凋亡的繼續深入研究，必將有助于揭示胰腺炎的發病機制，并有可能提高胰腺炎的診療水平。轉貼于 參考文獻
1 wada M et al. Gastroenterology，1996;110(4 Suppl):A440
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13 matsuzaki S et al. Gastroenterology，1996;110(4 Supp1):A416
14 tanaka T et al. Gastroenterology，1997;112(4 Supp1):A487
15 kaiser A et al. Am J Physiol，1995;269(5 Ptl):C1295～C1304
16 saluja A et al. Biochem Biophs Res Commun，1996;220:875～878
【論文摘要】細胞凋亡是通過正常的方式在多細胞生物中消除不需要的、衰老的和受損的細胞，使機體細胞有絲分裂的速度與凋亡的速度相平衡。認識肝病發生、發展中細胞的異常凋亡有重要作用。
細胞凋亡是一個主動過程，是機體在生理或病理條件下受到刺激后，導致細胞產生一系列形態和生化方面的改變而引起的程序性細胞死亡（programmedcelldeath，PCD）。
一、細胞凋亡機制與檢測方法
1.凋亡機制
細胞凋亡的生化特點包括質膜磷脂排列方向改變、細胞內離子環境自穩改變、蛋白酶和核酸內切酶激活分別致細胞蛋白質裂解和DNA斷裂、細胞內產生神經酰胺、線粒體功能障礙、谷胱甘肽耗竭以及轉谷氨酰胺酶激活。參與引發細胞凋亡的蛋白酶有多種，包括半胱氨酰天門冬氨酸特異蛋白酶家族成員和組織蛋白酶等。特別是caspase家族成員與細胞凋亡關系最為密切，至少有14種哺乳動物caspase已獲克隆，但僅對caspase-3和caspase-8的功能有所了解。caspase-8在細胞凋亡中發揮啟動作用；caspase-3在細胞凋亡中發揮效應作用。由于各caspase可相互激活，所以caspase蛋白酶級聯反應是導致細胞凋亡結構改變的主要環節。線粒體功能障礙在細胞凋亡發生機制中起關鍵作用，能促進線粒體功能障礙的因素很多，包括各種有害刺激和信號傳遞過程，其中某些配體/受體相互作用最為重要。配體與靶細胞表面受體相結合，就導致復雜的多蛋白復合物形成，即將凋亡信號傳遞給效應蛋白酶FLICE，FLICE與caspase-8相互反應可激活caspase-8，caspase-8激活后就通過某些不明的機制引發線粒體功能障礙。線粒體功能障礙導致細胞色素C釋放，細胞色素C與凋亡激活因子-2相結合，使caspase-3激活。caspase-3又激活DNA斷裂因子，導致靜息狀態的核酸內切酶激活，最終引起DNA斷裂。從線粒體功能障礙到DNA斷裂，是細胞凋亡生化途徑的共同途徑。在肝細胞凋亡發生機制中，以Fas配體/Fas受體引發凋亡信號級聯反應研究得最多。此外，轉化生長因子β1及其受體、腫瘤壞死因子及其受體在肝細胞凋亡發生機制中均起重要作用。細胞凋亡的主要調節因子是B細胞淋巴瘤/白血病-2蛋白家族的成員。Bcl-2，通過抑制凋亡以延長細胞存活時間，是哺乳類動物細胞凋亡的一種強大抑制因子。與Bcl-2關系密切的同源物是Bcl-x，有兩個RNA拼接變種，長Bcl-X是較大的拼接變種，短Bcl-X是短拼接變種。
2.檢查方法
（1）對細胞凋亡形態學的觀察有HE染色光鏡觀察以及電子顯微鏡、相差顯微鏡、共聚焦激光掃描顯微鏡檢查。
（2）對DNA降解片段的分析有瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA以及SouthernBlotting方法。
（3）熒光標記膜蛋白V的檢測。
（4）流式細胞技術（FCM）可以對活體或已固定的凋亡細胞進行定量分析。（5）末端脫氧核苷酸轉移酶介導的脫氧尿苷三磷酸缺口末端標記術（TUNEL）。（6）免疫組化。
二、肝中的細胞凋亡
近年來研究表明：肝細胞的死亡方式包括壞死和凋亡兩種。凋亡在肝臟疾病發展過程中的重要作用得到了人們的重視，現將有代表性的幾種肝臟疾病中的凋亡現象分述如下1.病毒性肝炎。Fas系統介導的細胞凋亡在肝炎發生發展過程中起著重要作用，在不同條件下，穿孔素、顆粒酶、TNF-α、TGF-β等也參與了肝細胞的凋亡。1998年Galle等報道乙型肝炎時肝細胞Fas表達增強，致敏的細胞毒性T細胞（CTL）表達Fas配基（FasL），CTL經過免疫途徑介導肝細胞凋亡，參與病毒的清理和肝炎的病理生理過程。若該反應過強，則可能誘發暴發性肝功能衰竭。
2.肝纖維化。肝纖維化是慢性肝病共有的病理改變，有研究表明各種類型的肝纖維化中都存在凋亡。肝星狀細胞（HSC）的激活是肝纖維化發生的中心環節。1998年Gong等報道HSC向肌成纖維細胞（MFB）的轉變與sFasL介導的凋亡增強相平行，Bcl-2和Bcl-XL在早期HSC上的表達高于晚期HSC和MFB，Bax則相反。這說明調節HSC的凋亡易感性在肝纖維化發生機制中起重要作用。
3.肝硬變。凋亡現象在肝硬變病例的肝細胞、膽管細胞、單核細胞中普遍存在。1999年Frommel等對照研究了正常肝組織、丙型肝炎和肝硬變標本，發現對Bcl-2的表達逐漸增強，肝硬變患者中表達最強，提出了一種解釋肝硬變患者中肝癌高發生率的新機制。
4.肝癌。肝細胞癌形成過程中，不僅癌細胞異常增生，而且突變的細胞凋亡減少，肝癌細胞對凋亡誘導反應明顯缺陷，1998年Jodo等報道肝癌血清中sFas水平升高，切除腫瘤后，sFas水平即下降。一些抑癌劑如:硒、類維生素A、化療藥物等可促進鼠肝的潛在惡性細胞的凋亡，從而降低肝癌的發病率，這從一個側面反映了凋亡在肝癌發病機制中的地位。1997年CrasL等報道在非基因毒性致癌物nafenopin所致的原發性肝癌中，正常肝細胞和肝腫瘤細胞都會受到抑制。當nafenopin的作用消失后，二者的凋亡都增加。后者的增殖率和凋亡率都高于前者。
急性腎功能衰竭（acute renal failure，ARF）是一種常見的臨床危急重癥，以泌尿功能急劇障礙和繼發的水、電解質平衡紊亂內環境穩態調節失衡為特征，死亡率在50%以上，甚至高達80%[1]。血管和腎小管是ARF發生的主要因素[2]，如急性腎小管上皮細胞壞死致小管液回漏可使ARF發生。但由于臨床活檢及實驗研究表明輕度急性腎小管壞死（acute renal tubule necrosis，ATN）與臨床表現的腎功能障礙程度之間不一致，因此有學者推測存在ATN以外的腎小管上皮細胞丟失途徑[3]，目前研究表明細胞凋亡是腎小管上皮細胞丟失的一個主要途徑[4]。
細胞凋亡（apoptosis）是在一定的生理或病理條件下細胞遵循其自身的程序結束其生命的過程。其特點為染色質凝聚、胞質濃縮、胞膜空化，最后形成凋亡小體[5]。研究表明[6]，細胞凋亡在ARF發病學中的兩個階段出現，第一個階段發生在急性缺血或腎毒素引起損傷后的12～48h內，細胞可以通過死亡配體與死亡受體、凋亡相關基因、氧化應激、線粒體細胞色素C等多種途徑引起腎小管上皮細胞凋亡和功能障礙，其相關基因家族有Bcl2家族、IAP（inhibitor of apoptosis）家族和caspase家族；第二個階段發生在腎衰竭的恢復階段，對于清除增生細胞、重建腎小管組織結構、恢復細胞功能是有利的，提示從凋亡途徑來控制和改善ARF。本文綜述ARF的細胞凋亡途徑及其防治對策。
1 死亡配體和死亡受體介導的細胞凋亡
死亡受體和死亡配體結合是一條形成細胞凋亡的獨立激活途徑，以fas和fas L為例。fas和fas L結合后形成由死亡配體-死亡受體FADD胱冬酶原分子構成的凋亡小體，經由caspase8、caspase6、caspase7參與最后激活caspase3而導致細胞凋亡。研究表明，fas/fas L、TNFα/TNFR L在LPS誘導ARF的發病學中具有重要作用：在注射LPS后TUNEL法測得腎小動脈、腎小管及周圍區域的細胞凋亡數目增加，凋亡小體與腎功能改變呈正相關；免疫組化結果顯示fas/fas L，TNFα/TNFR L在ARF腎組織的近曲小管、遠曲小管周圍表達增加。結果提示細胞凋亡可能是LPS誘導ARF的發病機制之一，且凋亡的fas/fas L、TNFα/TNFR L途徑參與了腎小管上皮細胞凋亡的發生。也有研究報道[7]，fas/fas L，TNFα/TNFR L介導的凋亡途徑在順鉑導致的腎小管上皮細胞損傷的病因學中與損傷直接相關：順鉑可上調小鼠fas/fas L、TNFα/TNFR L離體和在體腎臟的表達；給小鼠注射順鉑可提高腎臟中TNFR1和TNFR2 mRNA的水平，TNFα缺失小鼠TNFR2增高較TNFR1遲鈍，提示TNFR2的提高是配體依賴性的[8]；給TNFR1缺乏小鼠和野生型TNFR2缺乏小鼠注射順鉑后，其腎功能障礙程度、細胞凋亡指數、以及白細胞浸潤均較輕，表明TNFR參與了順鉑致腎損傷的病理過程。
2 P53 與細胞凋亡
野生型P53基因具有誘導細胞凋亡的功能，但該基因發生突變后，反而可以抑制細胞的的凋亡。P53導致的凋亡在P14缺乏的細胞中被順鉑激活，并且給予特異性的P53 SiRNA能夠增加順鉑耐受，說明P53在P14缺乏惡性胸膜臟層間皮瘤中起作用[9]。在RNA聚合酶Ⅲ作用下，ARF可抑制tRNA合成；當P53被敲除時，tRNA轉錄不受抑制，提示ARF時細胞凋亡與P53有關[10]。P53也參與負反饋途徑調節細胞凋亡，如E2F1P19P53途徑對局部缺血性ARF的腎小管上皮細胞增殖周期的調節起負反饋作用[11]。免疫組織化學染色發現急性損傷72h的腎小管上皮細胞在外髓表達P19蛋白。
3 氧自由基導致細胞凋亡
氧自由基（oxygen free radical，OFR）損傷細胞主要機制之一就是觸發細胞膜上的不飽和脂肪酸發生過氧化鏈式反應，使內質網、溶酶體、線粒體等生物膜結構破壞，可使DNA變性、蛋白質氧化、髓質過氧化，導致細胞的一系列功能紊亂，并可導致細胞凋亡[12]。研究表明，汞中毒所致ARF時表現的血液流變性異常[13]以及由其引起的自由基損傷[14]，是加重ARF家兔腎組織細胞損傷和凋亡的因素[15]。ARF的缺血性損傷也發生在缺血再灌注的過程中，缺血再灌注時腎組織OFR產生增加，導致細胞凋亡或損傷。OFR介導的細胞凋亡與OFR對DNA損傷導致的ADP核糖轉移酶活化和caspase酶原的活化以及脂質過氧化物等與胞內鈣離子水平增加有關[12]，同時，活化對其敏感的核轉錄因子誘導細胞凋亡。而抗氧化劑與自由基清除劑能不同程度地抑制細胞凋亡的發生，為探討凋亡相關疾病提供了方向[16]。
4 抑制凋亡與ARF治療
研究表明[17]，速尿阻止缺血再灌注致大鼠ARF的促凋亡基因的表達：缺血再灌注促使皮質和髓質的細胞凋亡，導致凋亡相關基因73的Akt磷酸化顯著下降，而給予速尿則明顯減少缺血再灌注大鼠腎組織凋亡相關基因72的表達，顯著提高AKt的磷酸化。缺血再灌注后不同時間注射抗炎因子alphaMSH可使血中尿素和肌酐的含量下降，減少fas/fas L表達，中性粒細胞浸潤和白細胞粘附分子1表達下降；提示alphaMSH可以減輕缺血再灌注引起的ARF[18]。Klotho基因具有抗衰老作用，缺血再灌注后，Klotho mRNA和蛋白的表達明顯下降，而實驗前給予adkl可以明顯提高Klotho在肝細胞而非腎細胞中Klotho mRNA和蛋白的表達，但可減輕腎組織細胞凋亡[19]。在葉酸導致的ARF中，在體實驗給予葉酸可以增強炎癥介質TNFα的產生，降低了Bclxl蛋白表達，導致腎小管上皮細胞凋亡；而給予抗TNFα的抗體后，降低腎組織TNFα含量，恢復腎組織Bclxl蛋白的表達，抑制腎小管上皮細胞凋亡，因此，給予TNFα阻斷劑是預防和治療ARF的良好途徑[20]。
2008年6月閆 斌等：細胞凋亡與急性腎功能衰竭第3期2008年6月河北北方學院學報（醫學版）第3期總之，多種誘發細胞凋亡的刺激因素通過使腎小管上皮細胞凋亡而導致腎功能障礙，在多種病因導致ARF的發病學中有重要意義。由于壞死具有不可逆的生物學特性，針對凋亡過程的不同靶點進行干預，抑制腎小管上皮細胞凋亡，從而減輕腎功能障礙或衰竭，可能是ARF極有希望的治療途徑，也為ARF的治療提供了新的思路。x
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急性腎功能衰竭（acute renal failure，ARF）是一種常見的臨床危急重癥，以泌尿功能急劇障礙和繼發的水、電解質平衡紊亂內環境穩態調節失衡為特征，死亡率在50%以上，甚至高達80%[1]。血管和腎小管是ARF發生的主要因素[2]，如急性腎小管上皮細胞壞死致小管液回漏可使ARF發生。但由于臨床活檢及實驗研究表明輕度急性腎小管壞死（acute renal tubule necrosis，ATN）與臨床表現的腎功能障礙程度之間不一致，因此有學者推測存在ATN以外的腎小管上皮細胞丟失途徑[3]，目前研究表明細胞凋亡是腎小管上皮細胞丟失的一個主要途徑[4]。
細胞凋亡（apoptosis）是在一定的生理或病理條件下細胞遵循其自身的程序結束其生命的過程。其特點為染色質凝聚、胞質濃縮、胞膜空化，最后形成凋亡小體[5]。研究表明[6]，細胞凋亡在ARF發病學中的兩個階段出現，第一個階段發生在急性缺血或腎毒素引起損傷后的12～48h內，細胞可以通過死亡配體與死亡受體、凋亡相關基因、氧化應激、線粒體細胞色素C等多種途徑引起腎小管上皮細胞凋亡和功能障礙，其相關基因家族有Bcl2家族、IAP（inhibitor of apoptosis）家族和caspase家族；第二個階段發生在腎衰竭的恢復階段，對于清除增生細胞、重建腎小管組織結構、恢復細胞功能是有利的，提示從凋亡途徑來控制和改善ARF。本文綜述ARF的細胞凋亡途徑及其防治對策。
1 死亡配體和死亡受體介導的細胞凋亡
死亡受體和死亡配體結合是一條形成細胞凋亡的獨立激活途徑，以fas和fas L為例。fas和fas L結合后形成由死亡配體-死亡受體FADD胱冬酶原分子構成的凋亡小體，經由caspase8、caspase6、caspase7參與最后激活caspase3而導致細胞凋亡。研究表明，fas/fas L、TNFα/TNFR L在LPS誘導ARF的發病學中具有重要作用：在注射LPS后TUNEL法測得腎小動脈、腎小管及周圍區域的細胞凋亡數目增加，凋亡小體與腎功能改變呈正相關；免疫組化結果顯示fas/fas L，TNFα/TNFR L在ARF腎組織的近曲小管、遠曲小管周圍表達增加。結果提示細胞凋亡可能是LPS誘導ARF的發病機制之一，且凋亡的fas/fas L、TNFα/TNFR L途徑參與了腎小管上皮細胞凋亡的發生。也有研究報道[7]，fas/fas L，TNFα/TNFR L介導的凋亡途徑在順鉑導致的腎小管上皮細胞損傷的病因學中與損傷直接相關：順鉑可上調小鼠fas/fas L、TNFα/TNFR L離體和在體腎臟的表達；給小鼠注射順鉑可提高腎臟中TNFR1和TNFR2 mRNA的水平，TNFα缺失小鼠TNFR2增高較TNFR1遲鈍，提示TNFR2的提高是配體依賴性的[8]；給TNFR1缺乏小鼠和野生型TNFR2缺乏小鼠注射順鉑后，其腎功能障礙程度、細胞凋亡指數、以及白細胞浸潤均較輕，表明TNFR參與了順鉑致腎損傷的病理過程。
2 P53 與細胞凋亡
野生型P53基因具有誘導細胞凋亡的功能，但該基因發生突變后，反而可以抑制細胞的的凋亡。P53導致的凋亡在P14缺乏的細胞中被順鉑激活，并且給予特異性的P53 SiRNA能夠增加順鉑耐受，說明P53在P14缺乏惡性胸膜臟層間皮瘤中起作用[9]。在RNA聚合酶Ⅲ作用下，ARF可抑制tRNA合成；當P53被敲除時，tRNA轉錄不受抑制，提示ARF時細胞凋亡與P53有關[10]。P53也參與負反饋途徑調節細胞凋亡，如E2F1P19P53途徑對局部缺血性ARF的腎小管上皮細胞增殖周期的調節起負反饋作用[11]。免疫組織化學染色發現急性損傷72h的腎小管上皮細胞在外髓表達P19蛋白。
3 氧自由基導致細胞凋亡
氧自由基（oxygen free radical，OFR）損傷細胞主要機制之一就是觸發細胞膜上的不飽和脂肪酸發生過氧化鏈式反應，使內質網、溶酶體、線粒體等生物膜結構破壞，可使DNA變性、蛋白質氧化、髓質過氧化，導致細胞的一系列功能紊亂，并可導致細胞凋亡[12]。研究表明，汞中毒所致ARF時表現的血液流變性異常[13]以及由其引起的自由基損傷[14]，是加重ARF家兔腎組織細胞損傷和凋亡的因素[15]。ARF的缺血性損傷也發生在缺血再灌注的過程中，缺血再灌注時腎組織OFR產生增加，導致細胞凋亡或損傷。OFR介導的細胞凋亡與OFR對DNA損傷導致的ADP核糖轉移酶活化和caspase酶原的活化以及脂質過氧化物等與胞內鈣離子水平增加有關[12]，同時，活化對其敏感的核轉錄因子誘導細胞凋亡。而抗氧化劑與自由基清除劑能不同程度地抑制細胞凋亡的發生，為探討凋亡相關疾病提供了方向[16]。
4 抑制凋亡與ARF治療
研究表明[17]，速尿阻止缺血再灌注致大鼠ARF的促凋亡基因的表達：缺血再灌注促使皮質和髓質的細胞凋亡，導致凋亡相關基因73的Akt磷酸化顯著下降，而給予速尿則明顯減少缺血再灌注大鼠腎組織凋亡相關基因72的表達，顯著提高AKt的磷酸化。缺血再灌注后不同時間注射抗炎因子alphaMSH可使血中尿素和肌酐的含量下降，減少fas/fas L表達，中性粒細胞浸潤和白細胞粘附分子1表達下降；提示alphaMSH可以減輕缺血再灌注引起的ARF[18]。Klotho基因具有抗衰老作用，缺血再灌注后，Klotho mRNA和蛋白的表達明顯下降，而實驗前給予adkl可以明顯提高Klotho在肝細胞而非腎細胞中Klotho mRNA和蛋白的表達，但可減輕腎組織細胞凋亡[19]。在葉酸導致的ARF中，在體實驗給予葉酸可以增強炎癥介質TNFα的產生，降低了Bclxl蛋白表達，導致腎小管上皮細胞凋亡；而給予抗TNFα的抗體后，降低腎組織TNFα含量，恢復腎組織Bclxl蛋白的表達，抑制腎小管上皮細胞凋亡，因此，給予TNFα阻斷劑是預防和治療ARF的良好途徑[20]。
2008年6月閆 斌等：細胞凋亡與急性腎功能衰竭第3期2008年6月河北北方學院學報（醫學版）第3期總之，多種誘發細胞凋亡的刺激因素通過使腎小管上皮細胞凋亡而導致腎功能障礙，在多種病因導致ARF的發病學中有重要意義。由于壞死具有不可逆的生物學特性，針對凋亡過程的不同靶點進行干預，抑制腎小管上皮細胞凋亡，從而減輕腎功能障礙或衰竭，可能是ARF極有希望的治療途徑，也為ARF的治療提供了新的思路。
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細胞凋亡(apoptosis)又稱為程序性死亡，是由基因控制的細胞自我消亡過程。其特征是質膜保持完整性，而核染色質固縮，內源性內切酶激活，將染色質DNA降解成寡聚小體，電泳帶譜表現為特征性梯狀帶，無整個組織的破壞和炎性反應。1992年英國科學家Hickman等首次提出可以將誘導腫瘤細胞凋亡作為以后腫瘤治療研究的主要目標和手段，誘導腫瘤細胞凋亡治療逐漸成為國際腫瘤研究的一個熱點。近年研究表明，許多中藥的有效成分或其提取液具有誘導腫瘤細胞凋亡的作用，中藥誘導腫瘤細胞凋亡的作用機制主要有以下幾個方面。
1 阻滯腫瘤細胞增殖周期
一般而言，每一代腫瘤細胞的增殖周期都需要依次經歷G1期、S期、G2期、M期四個階段。許多中藥的有效成份能夠作用于細胞周期的某一環節，從而使細胞增殖周期受阻，誘導其發生凋亡。用藤梨根氯仿提取液處理人肺腺癌A549細胞，可以對細胞周期產生影響，表現為G0/G1期細胞增多，S期和G2/M期細胞減少，出現G0/G1期阻滯，并呈現一定的劑量依賴關系，伴PI染色檢測的細胞凋亡率增加，提示藤梨根氯仿提取液可抑制A549細胞的有絲分裂，誘導腫瘤細胞凋亡[1]。Li等[2]報道黃連提取物及其主要成分小檗堿都可以在不影響CyclinB1 mRNA表達情況下，抑制CyclinB1蛋白活性，但不抑制Cyclin A～Cyclin E蛋白活性，使cdc2激酶活性降低，細胞進入有絲分裂受阻滯，被阻滯在G2期。某些藥物可以阻滯腫瘤細胞由S期進入G2/M期而誘發其凋亡。左云飛等[3]研究發現，欖香烯對肝癌腹水瘤細胞系Hca2F25/CL216A3的G0/G1期細胞無明顯作用，主要作用在S期，阻止細胞由S期進入G2/M期，從而抑制腫瘤生長。并觀察到在G0/G1期前出現一個凋亡特異的AP峰。黃志煜等[4]報道小檗胺可抑制人白血病Jurkat細胞的增殖，使細胞阻滯在S期，G0/G1期細胞比例也有減少，同時并也觀察到腫瘤細胞凋亡明顯增加。
較多的中藥通過阻滯腫瘤細胞于G2/M期而發揮誘導細胞凋亡的作用。馬東禮等[5]在研究欖香烯對HeLa細胞的作用時發現，HeLa細胞增殖受到明顯的抑制，細胞的分裂能力降低，絕大多數細胞阻滯在G2/M期。張曼穎等[6]研究發現，刺五加葉皂苷能誘導肺癌細胞SpcA1凋亡，細胞周期分析發現，G0/G1和S期細胞比例明顯降低，G2/M期細胞明顯升高，提示刺五加葉皂苷作用也是使SPCA1細胞阻滯于G2/M期。毛蘭素是從鼓槌石斛中分離得到的，也可以阻滯人早幼粒細胞白血病HL60細胞于G2/M期，并伴Bcl2表達下調，Bax表達上調，誘導腫瘤細胞凋亡[7]。
2 影響癌基因和抑癌基因的表達
在腫瘤的發生發展過程中，腫瘤細胞表達的凋亡相關基因起重要的調控作用，其中的某些基因發生缺失，突變或過度表達，可導致細胞增殖失控或凋亡受阻。因此，如何調控凋亡相關基因或其相應產物，提高腫瘤細胞對藥物的敏感性，并誘導細胞進入凋亡是腫瘤治療取得成功的關鍵。目前bcl2、cmyc、p53是幾個了解較為深入的、與凋亡調控有關的基因。
野生型p53(wtp53)基因的主要生物學功能為引起細胞周期阻滯，誘導細胞凋亡和促進分化，對細胞生長起負調控作用，而因基因缺失或突變產生的突變型P53(mtp53)蛋白則對細胞的增殖和轉化起促進作用，抑制細胞凋亡，導致腫瘤的發生[8]。p53基因發生突變是許多人類惡性腫瘤中常見的基因改變之一。實驗證明[9]，大蒜素通過促進抑癌基因p53和p21的表達誘導人早幼粒細胞白血病HL60細胞和胃癌BGC823細胞凋亡。Wilson等[10]發現金雀異黃素(genistein)能誘導大腸癌HCT2116細胞的抑癌基因非甾體抗炎藥活化基因NAG21和p53、p21的表達，并通過誘導p53基因來調節NAG21的表達。而在大腸癌HCT215細胞(p53基因缺失)中NAG21不能被誘導表達，提示金雀異黃素通過調節p53基因而誘導腫瘤細胞凋亡。
郭偉劍等[11]采用血清藥理學方法研究健脾理氣藥(黨參、白術、茯苓、八月札等)的體外誘導凋亡效應。結果顯示，含中藥血清作用2天后，誘導肝癌細胞凋亡，使細胞周期阻滯于S期，并上調p53蛋白的表達，提示上調p53蛋白的表達可能為健脾理氣藥誘導肝癌SMMC7721細胞凋亡的分子機制之一。抗癌口服液(由人參、靈芝和白花蛇舌草組成的復方水煎湯劑)作用于人胃癌MGC803細胞株，發現其具有明顯抑制增殖和誘導凋亡作用，用藥前后凋亡相關基因p53蛋白、Bcl2蛋白表達均減少，而Fas抗原表達明顯增高，差別均有顯著性改變[12]。
原癌基因bcl2、cmyc是主要的凋亡調控基因。bcl2能抑制細胞凋亡，bcl2受抑制被認為可能是細胞凋亡的共同通道[13]。而bax基因則傾向于分布在終末分化細胞、退化細胞，在凋亡旺盛的細胞中表達更強，在功能上與bcl2相反，其過度表達則觸發凋亡。袁懷波等[14]用RTPCR和蛋白質免疫印跡技術，發現葛根黃酮提取物、葛根素和大豆苷元處理HL60細胞后能夠上調bax mRNA表達水平，下調Bcl2蛋白表達和上調bax蛋白表達。姚保泰等[15]研究，發現鹽酸小檗堿可通過下調bcl2的表達而達到防治胃癌及癌前病變的目的。左小東等[16]研究華蟾素誘導腫瘤細胞凋亡與細胞周期阻斷和抗凋亡基因bcl2表達之間的關系。結果華蟾素能將腫瘤細胞阻斷在S期，并能抑制bcl2基因的表達。馬靖等[17]研究表明，cmyc、cjun和cfos上調參與甘草誘導腫瘤細胞凋亡的調控。何承偉等[18]研究半邊旗提取物6F對HL60細胞內cmyc、bcl2及增殖細胞核抗原(PCNA)表達的影響，發現給予6F 8～231nmol/L，作用HL60細胞12小時，流式細胞分析示cmyc、bcl2及PCNA蛋白表達水平明顯下降，并呈劑量效應關系。
因此，中藥誘導腫瘤細胞凋亡的機制可能與一些癌基因和抑癌基因的表達改變有關，但其中可能的具體機制仍需進一步研究。
3 抑制端粒酶活性
端粒酶可能是目前已知的最廣譜的惡性腫瘤分子標記物，并且與細胞周期和腫瘤凋亡基因表達關系密切。因此，鑒于端粒酶在腫瘤發生和發展中所扮演的重要角色，端粒酶活性的抑制可能是某些抗癌藥物發揮作用的機制。
陳偉忠等[19]利用TRAPELISA法半定量檢測了不同濃度的苦參堿對肝癌細胞HepG2端粒酶活性的影響。結果顯示，苦參堿對HepG2的端粒酶活性有一定的抑制作用。同時認為苦參堿抗腫瘤的機制可能與抑制hTERT表達、降低端粒酶活性有關。曾建新等[20]實驗發現，肝癌HCC9204細胞中端粒酶活性較高，而當用AS2O3處理48小時后，測得端粒酶活性顯著降低，提示抑制端粒酶活性是AS2O3誘導肝癌細胞凋亡的機制之一。黎丹戎等[21]實驗表明，茶多酚具有誘導BEL7402細胞分化的作用，并能降低端粒酶活性的表達。同時并沒有發現發生分化的細胞端粒酶活性不下降的情況。說明端粒酶的活性抑制是細胞分化過程所伴有的，提示茶多酚的抗癌機制可能是通過抑制端粒酶的活性而實現。李伏娥等[22]用PCRELISA法對胃癌細胞端粒酶活性進行檢測，苦參堿在誘導細胞凋亡的同時伴隨端粒酶活性下調，且隨苦參堿濃度增大和時間延長，抑制作用逐漸增強。提示苦參堿誘導細胞凋亡的調控可能與端粒酶表達調控之間存在密切聯系。
韓國槲寄生中的凝集素能抑制肝癌細胞端粒酶活性[23]，桔梗屬grandiflorum的水提取物能抑制肺癌細胞株A549端粒酶活性[24]。姜黃素能誘導白血病細胞株HL60細胞[25]和卵巢癌K562[26]細胞凋亡，伴有端粒酶活性抑制，且表現為濃度依賴性[25，26]。柴胡屬中的scorzonerifolium也能誘導肺癌細胞株A549細胞凋亡并能抑制其端粒酶活性[27]。
目前，多數研究認為，這些藥物抑制腫瘤細胞端粒酶活性可能是誘導腫瘤細胞凋亡的機制之一。
4 影響細胞凋亡信號傳導
caspase是一個半胱氨酸蛋白酶家族， 是細胞凋亡的主要執行者。 已發現的14種caspase均以酶原(procaspase)形式存在并定位于細胞內不同的亞細胞部位。 caspase8基因位于染色體2q3334。 caspase8也稱MACH、FLICE、Mch5，1996年被克隆成功， 以無活性的酶原(procaspase8)形式存在于成人及除胎兒腦組織外的各種組織中， 在外周血白細胞中分布較高。 procaspase8有479個氨基酸， 分子量為55kD， 其8種異構體中2種有完整的酶活性， 能啟動死亡受體介導的凋亡。 在死亡受體(Fas、DR4和HDR5等)介導的細胞凋亡途徑中， caspase8是關鍵的啟動型caspase。 caspase3是CE/CED3家族的重要成員， 是細胞凋亡調控的重要因子之一。 一般以23000相對分子質量的無活性前體存在于細胞質中， 當細胞進入凋亡時被激活， 并可促進ICE家族其他成員一起促進細胞凋亡， 被認為是多種凋亡途徑的共同作用因子。
Moragoda[28]報道，姜黃素能抑制胃癌KAT0III和結腸癌HCT116細胞增殖并誘導凋亡，使HCT2116細胞的細胞周期停止于G2/M期，免疫印跡結果顯示兩種細胞cyclinD、E水平下降，其誘導凋亡的機理是導致PARP斷裂，激括caspase8活性，啟動Fas凋亡途徑。
Pan等[29]研究烏龍茶多酚誘導人組織淋巴瘤U937細胞凋亡時發現，烏龍茶多酚可通過釋放細胞色素C，活化caspase9、caspase3來誘導細胞凋亡。
韓國槲寄生中凝集素[23]、桔梗屬grandiflorum[24]、姜黃素[25，26]、柴胡屬中的scorzonerifolium[27]已經被發現能誘導腫瘤細胞凋亡且能抑制端粒酶活性，具有毒副作用小的優點。他們的研究均提示誘導腫瘤細胞凋亡是通過觸發細胞色素C從線粒體向胞質的釋放，伴有一些caspase激活而實現的，并可見上調bax表達和下調bcl2蛋白表達。推測線粒體途徑是主要的通路。
盡管caspase3是多種凋亡途徑共同作用的因子，但并非是所有細胞凋亡途徑的共同通路。有報道證實，冬凌草素甲可以誘導人乳腺癌MCF7細胞凋亡，表現為caspase9依賴性，而非caspase3依賴性[30]。最近，還有報道白藜蘆醇MCF7細胞凋亡與caspase8和casDase3的激活無關，但與bcl2、NFkappaB下調有關[31]。曲古抑菌素A也能誘導胃癌細胞凋亡，可能與P53和bax蛋白表達增加，bcl2蛋白和SurViVin蛋白表達減少有關，并獨立于caspase途徑[32]，這也說明細胞凋亡可在沒有caspase參與的條件下發生，存在不依賴caspase的凋亡通路。
另外，某些中藥誘導肝癌細胞凋亡的機理還與蛋白激酶(PKC)、cAMP等信息分子有關。PKC可拮抗皮質激素誘導的胸腺細胞凋亡，槲皮素作為PKC的拮抗劑，可逆轉這種作用，增強機體對腫瘤細胞的吞噬能力，誘導細胞凋亡。槲皮素能降低PTK活性，抑制cAMP和cGMP的磷酸二酯酶，增加cAMP水平，降低cGMP水平，調節細胞內二者的比值，控制細胞凋亡的蛋白磷酸化，導致腫瘤細胞凋亡[33]。
5 展 望
隨著研究工作的不斷深入，細胞凋亡的研究為腫瘤治療提供了新的思路和靶點。人們已經認識到誘導腫瘤細胞凋亡很可能是腫瘤治療的一個新策略。但是，在中醫藥與細胞凋亡關系研究領域，相關中醫基礎理論研究明顯滯后于中藥作用機制研究，目前主要限于運用現代醫學手段檢測某些中藥或方劑對腫瘤細胞的誘導凋亡作用，而缺乏對相應中醫理論的探討。因此，將傳統中醫基礎理論與現代分子生物學有機地結合，開展“中醫分子生物學”的研究，對中醫藥現代化研究具有十分重要的意義。
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【關鍵詞】 肺腫瘤 蛋白質PTEN 細胞凋亡 細胞增殖 免疫組織化學
［ABSTRACT］ObjectiveTo study the expression of PTEN and its relationship with cell proliferation and apoptosis in nonsmallcell lung cancer (NSCLC). MethodsThe immunohistochemistry stain （SABC） method was applied to investigate the expression of PTEN and PCNA in samples of 43 NSCLC and 20 normal adjacent lung tissues. TUNEL method was applied to detect the apoptosis. The apoptosis index (AI) and mitotic index (MI) were defined. ResultsThe positive rate of PTEN was significantly lower in cancer tissues than in their normal adjacent tissue (χ2=13.609，P
［KEY WORDS］ lung neoplasms; protein PTEN; apoptosis; cell proliferation; immunohistochemistry
細胞周期失控是癌變的重要原因。細胞總是處于一種增殖與凋亡的動態平衡中，細胞的增殖和凋亡狀態受一系列基因的調控，當促增殖的基因過度表達，促進凋亡基因突變或缺失均會造成增殖和凋亡動態平衡的打破，導致腫瘤的發生。基因控制增殖與凋亡失衡在肺癌發生發展中起主要作用。本研究對PTEN基因在不同組織類型、分化程度、臨床分期及預后的肺癌組織標本中的表達進行檢測，旨在探討PTEN基因表達及細胞增殖、凋亡在肺癌發生發展中的作用和它們之間的關系。
1 材料與方法
1.1 標本及其來源
43例肺癌、20例癌旁正常肺組織標本均取自我院手術病理證實標本。43例肺癌病人中，男23例，女20例；年齡41～77歲，平均（59.2±9.7）歲。鱗癌17例，腺癌26例；高分化2例，中分化20例，低分化21例。有淋巴結轉移21例，無淋巴結轉移22例。按國際抗癌聯盟（UICC）1997年肺癌國際分期修正標準進行TNM分期：Ⅰ期10例，Ⅱ期10例，Ⅲ期19例，Ⅳ期4例。隨訪3年，存活19例，死亡24例。
1.2 方法
1.2.1 標本處理 標本均經40 g/L甲醛固定，石蠟包埋，按4 μm厚連續切片4張，1張行蘇木精伊紅染色，3張分別行PTEN、PCNA免疫組化染色和TUNEL法染色。
1.2.2 PTEN、增殖細胞核抗原（PCNA）以及TUNEL免疫組化染色 采用SABC免疫組化檢測技術，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，以PBS替代一抗作為陰性對照，以已知肺癌陽性切片作為陽性對照。
1.2.3 結果判斷 PTEN蛋白主要分布在胞漿，細胞漿顯示棕黃色顆粒者為陽性。腫瘤細胞核、胞漿均未見棕黃色顆粒為（－）；0～10%癌細胞內可見棕黃色顆粒為（±）；11％～30%癌細胞內可見棕黃色顆粒為（+）；31％～50%癌細胞可見棕黃色顆粒為（）；>50%癌細胞見棕黃色顆粒為（）。以（+）、（）及（）表達作為陽性，以（±）及（－）表達作為陰性。PCNA主要分布在胞核，細胞核出現棕黃色顆粒為增殖細胞。TUNEL染色陽性顆粒位于細胞核內，細胞核出現棕黃色顆粒為凋亡細胞。隨意計數5個以上高倍視野，不少于1 000個細胞，以凋亡細胞與總細胞比值作為凋亡指數（AI），增殖細胞與總細胞的比值作為增殖指數（MI）。
1.3 統計學處理
數據間比較采用四格表χ2檢驗和t檢驗。
2 結
果
2.1 肺癌與癌旁正常肺組織PTEN表達、細胞凋亡和增殖情況
本文43例肺癌組織PTEN陽性20例，陽性率為46.51%；20例癌旁正常肺組織PTEN陽性19例，陽性率為95%，兩者相比較差異有顯著意義（χ2=13.609，P
癌旁正常肺組織AI為（1.250±0.775）%，肺癌組織為（4.126±2.088）%，兩者比較，差異有顯著性(t=8.279，P
癌旁正常肺組織的AI與MI無相關性（r=0.026，P>0.05）。肺癌組織AI與MI比值呈正相關（r=0.622，P
2．2 肺癌組織PTEN蛋白表達、AI、MI與臨床病理的關系
鱗癌與腺癌PTEN表達、AI和MI差異無顯著性，提示肺癌PTEN蛋白表達、AI和MI與組織類型無關。高中分化肺癌與低分化肺癌比較，PTEN蛋白表達和AI差異有顯著性，MI差異無顯著性，提示肺癌PTEN蛋白表達和AI與組織分化程度有關，MI與組織分化程度無關。TNM分期Ⅰ～Ⅱ期與Ⅲ～Ⅳ期比較，PTEN蛋白表達和AI差異無顯著性，MI差異有顯著性，提示肺癌PTEN蛋白表達和AI與TNM分期無關，MI與臨床分期有關。肺癌淋巴結轉移組PTEN表達與淋巴結無轉移組差異有統計學意義，提示肺癌PTEN蛋白表達與淋巴結轉移有關。肺癌淋巴結轉移組AI和MI與淋巴結無轉移組差異無統計學意義，提示肺癌AI與MI與淋巴結轉移無關。肺癌存活組PTEN蛋白表達、AI及MI與死亡組比較有顯著性差異，提示肺癌PTEN蛋白表達、AI及MI與預后有關。見表1。
2.3 肺癌PTEN蛋白表達與細胞凋亡和增殖關系
PTEN陽性的肺癌組織細胞AI為（5.585±1.782）%，陰性者為（2.857±1.399）%，二者比較，差異有顯著性(t=5.525，P
3 討
論
PTEN（或稱MMAC1，TEP1）是1997年由STECK等3個研究小組分別發現并命名的一種新的抑癌基因，是至今為止發現的第一個具有磷酸酶活性的抑癌基因［1］。它在腫瘤細胞浸潤、血管發生以及腫瘤轉移中起重要作用［2］。研究發現，PTEN可去除3，4，5三磷酸磷脂酰肌（PIP3）3′位上的磷酸基團，調節絲蘇氨酸激酶（Akt）的功能， 對細胞增殖分化具有負調節作用［2，3］。丟失PTEN的細胞會失去這種負調節作用，促進腫瘤的進行性生長。在多種人體腫瘤中均發現PTEN基因的突變和雜合性丟失。KIM等［4］報道，42％～70%的小細胞肺癌和27％～50%的非小細胞肺癌有PTEN的雜合性丟失（LOH）。
本實驗結果顯示，肺癌組織中PTEN基因的蛋白表達主要分布在胞漿，在核膜上也有少量著色，癌旁正常肺組織較肺癌組織著色明顯增強，肺癌組織PTEN的蛋白表達顯著低于癌旁正常肺組織，肺癌PTEN表達下調，提示PTEN蛋白的缺失在肺癌的發生中可能起重要作用；PTEN蛋白表達與肺癌的組織類型、臨床分期無關，而與組織的分化程度、淋巴結轉移和病人的預后密切相關。MCMENAMIN等［5］報道，PTEN蛋白在前列腺癌中表達水平越低，腫瘤的惡性程度越高；臨床分期越晚，預后越差。本實驗結果也顯示，低分化肺癌PTEN蛋白表達水平低，說明PTEN蛋白表達水平越低，肺癌惡性程度越高。REIFENBERGER等［6］研究發現，PTEN突變的惡性黑色素瘤較未發生突變的黑色素瘤更易發生淋巴結轉移。本文實驗結果顯示，有淋巴結轉移的肺癌病人PTEN表達水平明顯低于無淋巴結轉移者，提示PTEN蛋白低表達的肺癌病人更容易發生淋巴結轉移，可能是因為PTEN蛋白缺失的肺癌病人失去PTEN對FAK介導細胞浸潤、轉移和生長的抑制作用，從而更容易發生淋巴結轉移。以上結果提示，PTEN的蛋白表達可以抑制腫瘤細胞的浸潤、轉移和生長。PTEN蛋白表達與肺癌病人預后的關系至今未見報道。MCMENAMIN等［5］研究發現，PTEN蛋白的丟失嚴重影響前列腺癌病人的預后。本實驗結果顯示，PTEN蛋白表達與腫瘤的惡性程度及淋巴結轉移密切相關，PTEN蛋白高表達的肺癌病人預后良好，PTEN可以作為判斷肺癌病情和預后的指標。
細胞凋亡是一種不同于細胞壞死的細胞生理性死亡方式，是受基因編碼的細胞主動“自殺”過程，又稱程序性細胞死亡。細胞凋亡在腫瘤發生發展過程中主要起負反饋調控作用，可以阻遏腫瘤細胞的迅速生長。
STAUNTON等［7］研究發現，不同類型的腫瘤有不同的細胞AI，而且與腫瘤分化、分級、進展和腫瘤的生物學行為有關。本文實驗結果與HWANG等［8］報道結果相似。AI與肺癌臨床病理特征之間的關系目前研究較少。本實驗結果顯示，細胞AI與肺癌組織的分化程度密切相關，細胞AI越高，肺癌惡性程度越高。但本實驗結果未顯示細胞AI與肺癌組織類型、TNM分期有關。LANGENDIJK等［9］報道，細胞AI越高的非小細胞肺癌，越容易發生淋巴結及遠處轉移。本組資料雖顯示淋巴結轉移組比非轉移組細胞AI高，但無統計學意義。
細胞AI與肺癌預后的關系報道較少，EEROLA等［10］報道，細胞AI高的手術治療的大細胞肺癌病人的預后差。本實驗資料顯示，肺癌死亡組細胞AI較存活組明顯增高，提示細胞AI可作為判斷肺癌預后的指標。另有文獻報道，行放療肺癌病人中高AI者提示預后良好。提示在臨床上可以通過檢測細胞AI，選擇細胞AI高的肺癌病人行放化療，或通過轉基因技術提高病人對放化療的敏感性。
腫瘤細胞增殖活性是指腫瘤組織的增生狀態，取決于進入細胞周期的增殖細胞及它們在全體腫瘤細胞所占的比例，是用以反映腫瘤良惡性及惡性程度的重要指標。PCNA也稱周期蛋白（cyclin），是存在細胞核內的一種蛋白質，它對細胞由G1期向S期過渡起著重要的調節作用。
有關PCNA與肺癌的關系，國內外學者作了較多研究。本實驗結果與KAWAI等［11］報道的結果相似。目前有關PCNA及MI與肺癌組織類型之間的關系還存在爭論，本實驗結果未發現MI與肺癌組織類型及淋巴結轉移有關，與大多數學者結果一致，認為PCNA的表達僅能反映細胞的增殖狀態，與組織類型無關。
本實驗結果顯示，癌旁正常肺組織細胞MI明顯低于肺癌組織，提示肺癌組織較癌旁正常肺組織細胞增殖明顯活躍，這可能也是肺癌得以發生發展的重要機制。有學者研究表明，PCNA表達與肺癌分期相關，分期越晚，PCNA表達越高［10］。本實驗結果也顯示，PCNA表達與肺癌臨床分期密切相關，臨床分期越晚，PCNA增殖指數越高。PCNA可作為肺癌早期診斷的參考指標。
有研究表明，PCNA表達隨肺癌的惡性程度增高而增高，PCNA及MI與腫瘤分級呈正相關，提示肺癌PCNA的表達可反映肺癌細胞分化的程度，預示腫瘤惡性度的高低。本實驗顯示，高分化肺癌較低分化癌MI低，但無統計學意義。OYAMA等［12］報道，PCNA的表達與非小細胞肺癌的預后密切相關，PCNA的陽性表達越強，病人的預后越差。本實驗結果也顯示，PCNA及MI與肺癌病人的預后密切相關，MI越高，病人的預后越差。PCNA可作為判斷肺癌病人病情及預后的指標。
以往認為腫瘤的發生僅僅是由細胞凋亡減少引起。許多證據證實，在大多數腫瘤，細胞凋亡不是減少了，而是增多了。王潔等［13］報道肺癌組織細胞凋亡較癌旁肺組織明顯增多，且隨著細胞增殖的增加而增加。本實驗結果顯示，肺癌組織細胞增殖和凋亡均較活躍，細胞AI與細胞MI呈正相關。推測其機制可能是肺癌惡性細胞無限度增殖，打破細胞增殖與凋亡的平衡，啟動了凋亡機制。本實驗結果顯示，肺癌組織MI/AI比值為11.97，癌旁正常肺組織為10.96，肺癌組織MI/AI值同癌旁肺組織基本一致，提示細胞凋亡隨細胞增殖的增加而呈比例增加。本實驗結果還顯示，癌旁正常肺組織AI與MI無相關性，而肺癌組織AI與MI呈正相關。這也說明肺癌組織細胞凋亡增加是由于增殖增加引起。但因為增殖細胞在數量上遠遠大于凋亡細胞，凋亡速度不可能跟上增殖的速度，在腫瘤的發生發展過程中所謂細胞凋亡減少是相對過快的細胞增殖而言的，癌細胞過度增殖及凋亡的相對不足在肺癌的發展過程中起重要作用，這可能是腫瘤得以迅速發展的原因之一。
PTEN蛋白與細胞凋亡的關系至今未見報道。本實驗結果顯示，PTEN蛋白陽性表達的肺癌細胞AI明顯增高，MI明顯降低，提示PTEN蛋白在肺癌具有促進細胞凋亡、抑制細胞增殖的雙重作用。在眾多抑癌基因中，具有雙重抑癌作用者是不多見的，已有研究將PTEN作為靶基因用于肺癌基因治療中。因此，PTEN很有可能成為將來肺癌轉基因治療最為有效的基因之一。
PTEN是通過誘導細胞凋亡和抑制癌細胞增殖雙重作用來抑制肺癌發生發展過程的。而細胞增殖與凋亡又是癌細胞周期失控發生癌變的根源。基因治療癌癥是一種新的有效方法。目前主要是難以篩選出一種較為有效的靶基因。PTEN可能成為今后肺癌基因治療最為重要的靶基因。
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【關鍵詞】 Ghrelin；高血糖；心肌細胞；凋亡caspase3
心肌細胞凋亡是糖尿病心肌病主要病理改變之一，長期心肌細胞凋亡的發生，將會導致臨床早期心肌舒張功能障礙、晚期合并心肌收縮功能障礙及心力衰竭的形成〔1〕。近期研究發現，Ghrelin可以抑制多種細胞的凋亡，如成骨細胞、胰島β細胞、脂肪細胞、內皮細胞及神經元等，但Ghrelin對高糖環境下心肌細胞凋亡影響的相關文獻報道較少。因此，本實驗以高糖環境培養心肌細胞，Ghrelin作為干預因素，旨在探討Ghrelin對高糖誘導心肌細胞凋亡的影響，從而為糖尿病心肌病的防治提供新思路。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 細胞來源
新生1～3 d的SD大鼠的心肌細胞（重慶醫科大學動物實驗中心提供）。
1.1.2 主要試劑
Ghrelin(美國Phoenix Biotech公司)，DMEM培養基（Gibco公司），胎牛血清（Hyclone公司），Ⅱ型膠原酶及胰酶（均購于Sigma公司），PBS、αactin單克隆抗體、SABC試劑盒、TUNEL檢測試劑盒及DAB顯色試劑盒（均購于武漢博士德生物技術公司），caspase3 活性檢測試劑盒（購于南京凱基生物公司）。
1.2 實驗方法
1.2.1 原代心肌細胞的分離與培養
取出生1～3 d齡SD大鼠10～15只，無菌條件下取心臟，仔細剝離心包膜去除心房及大血管，剩余組織于PBS液中漂洗多次，放于青霉素小瓶側壁上，用眼科剪將心組織剪成約1 mm3碎塊。加入5倍體積的0.08％胰蛋白酶，反復吹打后36℃水浴消化7 min，靜置，待自然沉降后棄上清。剩余沉淀再加入約5倍體積0.08％胰蛋白酶及Ⅱ型膠原酶1∶1混合液，置36℃水浴消化5～8 min，靜置后將上清液移入10 ml離心管中，反復吹打至無細胞團塊后用等體積含10％胎牛血清的DMEM培養液終止消化。剩余沉淀用同樣條件及方法繼續消化，一般經8～10次消化即可將組織消化完畢。各次消化產物以1 000 r／min離心8 min，棄去上清液后將細胞重懸于含15％胎牛血清的DMEM培養液，然后接種于50 ml培養瓶，37℃，5％ CO2培養箱中孵育1.5 h去除貼壁的成纖維細胞。輕輕吸出上層細胞懸液，調整接種密度，將細胞接種于24孔板（板底鋪蓋玻片），置37℃，5％CO2培養箱中培養(培養液中加入5溴脫氧尿嘧啶0.1 mmol/L，以抑制成纖維細胞增殖)，培養48 h換液，以后每2 d換液1次。
1.2.2 臺盼藍拒染實驗檢測原代心肌細胞存活率
將0.4％臺盼藍溶液與細胞懸液等比例混勻，滴入細胞計數板，2 min后于倒置相差顯微鏡下計數，未著色的為活細胞，呈藍色的為死細胞，計算細胞存活率〔%，活細胞數/(活細胞數+死細胞數)×100%〕，重復3次。
1.2.3 心肌細胞純度鑒定
細胞培養第3天取出細胞爬片，4％多聚甲醛固定30 min后，用0.01 mol／L PBS漂洗3次。加入3％H2O2消除過氧化氫酶，封閉血清，室溫封閉30 min后加入以1∶300稀釋的兔抗大鼠特異性αactin抗體于4℃孵育過夜。然后分別用熒光標記的山羊抗兔IgG抗體37℃避光孵育60 min。PBS清洗3次后立刻熒光顯微鏡下觀察，綠色熒光染色的細胞即為陽性心肌細胞。陽性細胞百分率(%)＝陽性細胞數/細胞總數×100%，重復3次。
1.2.4 實驗分組
原代心肌細胞培養3 d后進行實驗分組，分為以下3組：①正常對照組（N組)：葡萄糖濃度為5.5 mmol／L;②高糖組（H組）：葡萄糖濃度為25.0 mmol/L；③高糖+Ghrelin組（G組）：酰基化Ghrelin終濃度為107 mol/L，葡萄糖濃度為25.0 mmol/L。
1.2.5 TUNEL法檢測心肌細胞凋亡
將各組細胞爬片用PBS洗3次后，4％多聚甲醛固定30 min，采用TUNEL法檢測細胞凋亡情況，同時設置陽性與陰性對照。檢測結果判斷：光鏡下陽性細胞為細胞核中有深淺不一的棕黃色顆粒（DAB顯色）。而正常非凋亡細胞及陰性對照胞核被蘇木素復染呈藍色。凋亡細胞分析：計數200倍視野下的凋亡細胞數及細胞總數，每組拍攝10個視野，計算凋亡細胞百分率(凋亡細胞/心肌細胞總數×100%)，重復5次。
1.2.6 caspase3活性測定
按照caspase3活性試劑盒說明書進行操作。收集各組實驗細胞，PBS清洗2次，2 000 r/min離心5 min，去除PBS。沉淀細胞中加入50 μl預冷裂解液和0.5 μl DTT。 吹打，冰上裂解60 min，期間渦旋4次，每次10 s，4℃10 000 r ／min離心1 min，吸取上清至新管中置冰上，測蛋白濃度。各組應采用同樣蛋白量進行實驗，加入50 μl的2×Reaction Buffer和0.5 μl DTT，加入5 μl caspase3 substrate并于37℃ 避光孵育4 h ，分光光度計在400 nm波長測定其吸光值，計算OD誘導劑／OD陰性對照確定各組caspase3活性值。
1.3 統計學處理
數據以x±s表示，用SPSS11.0軟件對數據進行各組間單因素方差分析。組間兩兩比較采用t檢驗。
2 結果
2.1 心肌細胞存活率測定
臺盼藍染色隨即觀察細胞存活率分別為95.4％，98％，96％。
2.2 心肌細胞形態學觀察
剛接種的心肌細胞尚未貼壁，以圓形為主。8～12 h后，部分心肌細胞逐漸變形并貼壁生長，可出現單個細胞自發性搏動。24 h后觀察細胞已大部分貼壁，單個搏動細胞數目增加，并逐漸在瓶底鋪展，伸出偽足，相互接觸交織成網，第48小時可形成呈同心圓放射狀排列的細胞簇，搏動頻率、節律、強度穩定，60～140次／min左右。
2.3 心肌細胞純度鑒定
心肌特異性αactin單克隆抗體做免疫熒光染色鑒定，陽性率接近96％。見圖1。
2.5 caspase3 活性測定 N組心肌細胞caspase3 活性較低；H組caspase3 活性較N組明顯增加(P＜0.05)；G組caspase3活性較高糖組明顯降低(P＜0.05)。見表1。表1 各組心肌細胞凋亡率及caspase3活性測定比較(略)
3 討論
糖尿病心肌病是糖尿病主要的心血管并發癥之一。越來越多的證據表明，心肌細胞凋亡與糖尿病心肌病密切相關，并在糖尿病心肌病的病程發展過程中起著重要作用。
Ghrelin是首先從大鼠胃黏膜中分離得到的一種含28個氨基酸的多肽，是生長激素促分泌素受體（GHSR）的內源性配體〔2〕。GHSR在全身多器官組織中廣泛分布，心臟和血管均有表達〔3～5〕。Ghrelin與受體GHSR結合后，通過自分泌、旁分泌及內分泌形式發揮多種生物學效應。近期研究發現，除可刺激生長激素釋放外，Ghrelin能夠抑制多種細胞的凋亡〔6～12〕，如成骨細胞、脂肪細胞、胰島β細胞、小腸上皮細胞、內皮細胞及大腦皮層神經元等。但目前尚未見Ghrelin對高糖環境下心肌細胞凋亡影響的相關文獻報道。
本研究顯示，H組心肌細胞凋亡率較N組明顯增高，說明高糖環境可以增加心肌細胞凋亡。引起心肌細胞凋亡的機制尚不清楚，可能與高血糖狀態下線粒體通路及死亡受體通路激活、PKC同工酶的凋節、P53基因的參與、活性氧物質的積累和氧化應激等有關〔13〕。與H組比較，G組心肌細胞凋亡率明顯降低，表明Ghrelin對高糖誘導的心肌細胞凋亡具有抑制作用。caspase3是細胞凋亡中的關鍵蛋白酶，是最重要的凋亡執行者。一旦caspase3被激活，細胞凋亡的發生將不可避免，因此caspase3活化也被稱為凋亡發生的標志性事件。本研究中，H組較N組心肌細胞caspase3活性顯著升高，表明高糖環境可以增加caspase3活性，誘導心肌細胞凋亡。而Ghrelin處理后，caspase3活性與H組相比明顯降低，提示Ghrelin可能通過抑制caspase3的活化發揮抗凋亡作用。
本研究提示，caspase3活性降低，可能是Ghrelin保護細胞凋亡的重要機制之一。除此之外，Ghrelin還可以通過下述途徑抑制細胞凋亡：①上調腫瘤壞死因子α（TNFα），激活NFκB途徑。有研究報道，Ghrelin能夠減少心力衰竭時心肌細胞凋亡，同時伴有心肌細胞內TNFα增加，NFκB活性升高。表明Ghrelin抑制心肌細胞凋亡，部分可能通過激活TNFα、NFκB的死亡受體途徑介導〔14〕；②激活PI3K/Akt通路。PI3K/Akt是細胞內重要的信號轉導分子。活化的Akt通過磷酸化作用進一步激活或抑制下游靶蛋白，進而發揮調節細胞增殖、分化等作用。研究發現，Ghrelin可以激活Akt，抑制caspase3的激活，減少高糖引起的內皮細胞凋亡。予以PI3K抑制劑LY294002后，Ghrelin對caspase3的抑制作用明顯減弱，顯示Ghrelin可以通過PI3K／Akt通路實現抗內皮細胞凋亡的作用〔12，15〕；③抑制活性氧簇的產生。活性氧物質的過多積累是導致細胞凋亡的原因之一。Ghrelin能夠抑制活性氧簇的產生，提示Ghrelin保護神經元凋亡的機制可能與減少活性氧簇產生有關〔16〕。
總之，研究表明Ghrelin能夠抑制多種細胞的凋亡，但其影響細胞凋亡的具體作用機制尚未完全明了，有待進一步研究。Ghrelin可以通過降低caspase3的活性減少高糖誘導的心肌細胞凋亡，可能為今后糖尿病心肌病的防治提供新的治療靶點。
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血管平滑肌細胞（VSMC）的凋亡在動脈粥樣硬化的進展中有十分重要的作用，因此對于其誘導因素的研究十分有意義。本文就VSMC凋亡誘導因素做淺要的概述。
1血管平滑肌凋亡的誘導因素
1.1氧化型低密度脂蛋白（OX-LDL）沈洪[1]等報道OX-LDL刺激可使培養的VSMC表現明顯的細胞增殖，NS-398可減弱VSMC的增殖，但卻協同OX-LDL導致凋亡作用的增強。巴玉峰[2]等發現7-酮膽固醇能誘導VSMC凋亡，并且是由脂質過氧化作用引起。Ding[3]等研究發現高濃度OX-LDL能增強平滑肌細胞凋亡。Ingueneau[4]等也發現OX-LDL誘導VSMC凋亡，其機制與caveolin-1有關。Zhang[5]等實驗發現OX-LD誘導大鼠血管平滑肌細胞的增殖且其機制與ERK1/2和Ki-67的表達增加有關。因此筆者認為如何在AS的不同階段控制OX-LDL的濃度對于預防和治療AS是極為重要的。
1.2一氧化氮田宏[6]等發現一氧化氮（NO）可以促使平滑肌細胞中Fas抗原高表達，誘導血管平滑肌細胞發生凋亡，其機制與NF-kB信號通路有關。
1.3E1A激活基因阻遏子E1A激活基因阻遏子（CREG）是新近發現的一種分泌型糖蛋白，實驗表明[7]在藥物刺激后，CREG表達抑制的VSMC更容易發生凋亡，而CREG過表達明顯抑制細胞凋亡。
1.4MG132郭芳[8]等的研究表明MG132能阻止26S蛋白酶體對泛素結合蛋白的降解、抑制20S蛋白酶體的糜凝乳蛋白酶活性，從而阻斷UPP，它能激活c-Jun氨基端激酶（JNK1）從而啟動凋亡。此外，MG132還可以通過上調caspase3來誘導凋亡。
1.5同型半胱氨酸同型半胱氨酸（HCY）被稱為是致動脈粥樣硬化獨立而非傳統的危險因素。張偉偉[9]等發現HCY呈時間依賴性誘導人VSMC的死亡受體Fas等表達上調，表明HCY誘導人VSMC凋亡可能是由Fas和TNFR1參與的死亡信號通路介導的。
1.6其他微小RNA-146a可以促進血管平滑肌細胞的增殖，抑制凋亡[10]。此外，活性氧、細胞成分細胞生長因子和炎癥因子等也能調控平滑肌細胞的凋亡。
2展望
血管平滑肌細胞凋亡的誘導因素很多也十分復雜，如何控制好凋亡的速度，使血管平滑肌的增生和凋亡處于動態平衡是穩定粥樣斑塊的關鍵。雖然近年來對于血管平滑肌細胞凋亡機制的研究十分迅速，但仍有許多問題亟待解決，這些問題的不斷深入研究對臨床應用有十分重要的意義。
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《中華中醫藥雜志》2014年第七期
一、軟骨細胞凋亡調控軟骨退變的作用機制
細胞凋亡（細胞程序性死亡）是一個主動的、信號依賴的過程，并由基因控制的主動的、高度有序的死亡過程。在正常情況下，軟骨細胞也存在著凋亡的現象，軟骨細胞凋亡對維持關節軟骨的形態結構及功能發揮重要的調控作用。不同年齡組動物關節軟骨中細胞凋亡程度與年齡增長有關，軟骨細胞的凋亡在成熟關節軟骨形態結構的維持、再建和更新過程中也發揮重要的調控作用。若軟骨細胞的凋亡超出一定的范圍，會導致軟骨細胞數量減少，軟骨細胞數量的變化不僅引起軟骨基質合成與分泌的減少，而且還能引起維持軟骨基質合成與降解酶系統平衡的紊亂，最終引起軟骨基質的質與量發生變化，軟骨基質的這種變化又會促進軟骨細胞的凋亡，從而導致軟骨退變。目前研究表明，線粒體凋亡、內質網應激性凋亡、細胞自噬在OA的發病過程中發揮重要的調控作用。
1.軟骨細胞線粒體凋亡信號通路與軟骨退變的關系軟骨退變是OA發生發展的一個重要因素，出現軟骨細胞數減少、抗氧化防御能力下降、生長因子和細胞因子免疫應答改變及基因和蛋白表達模式改變等。促凋亡與抗凋亡信號之間的失衡是介導軟骨細胞凋亡的關鍵，各種因素引起的凋亡信號傳至軟骨細胞內的作用位點，激活靶分子而產生酶級聯效應，誘導細胞凋亡，線粒體凋亡通路是軟骨細胞凋亡的重要途徑之一。線粒體具有傳遞電子、氧化磷酸化、能量代謝、貯存Ca2+、抗活性氧化等重要生理作用。線粒體功能障礙時生成活性氧，過多的活性氧可引起線粒體損傷，從而釋放促凋亡因子，導致細胞凋亡。活性氧可作用于線粒體內膜通透改變孔道（permeabilitytransitionpore，PTP），加速PTP開放，釋放細胞色素C（cytochromeC，CytoC）促進軟骨細胞凋亡，而釋放的CytoC又改變線粒體內電子傳遞鏈的功能，引起活性氧生成增加。正常細胞中CytoC位于線粒體內外膜之間，在電子呼吸傳遞鏈中起重要作用。當在凋亡發生時，CytoC從線粒體釋放入胞質，啟動半胱氨酸蛋白水解酶活化，與半胱氨酸蛋白酶-9前體、凋亡蛋白酶活化因子-1（Apaf-1）形成凋亡小體，并在脫氧腺苷三磷酸（deoxy-adenosinetriphosphate，dATP）輔助下激活Caspase-9；Caspase-9激活Caspase-3，活化的Caspase-3瀑布式活化Caspase-2、6、8、10，而激活的Caspases最終活化脫氧核糖核酸酶（CAD/DFF45），水解核酸及細胞骨架，引起細胞凋亡[7-8]。Bcl-2通過抑制CytoC釋放，降低活性氧生成，從而抑制凋亡。Bax為編碼Bcl-2相關蛋白X的基因，具有誘導細胞凋亡的功能，Bcl-2/Bax之間的比例是調控細胞凋亡的關鍵因素。p53位于線粒體上的轉錄因子，能上調促凋亡基因的表達，下調抗凋亡基因的表達。p53基因表達產物的聚集使Bax表達增加，進而釋放CytoC并激活Caspase，引發細胞凋亡。
2.內質網應激反應與軟骨退變的關系軟骨內無血管和神經支配，代謝主要通過滲透作用，對缺氧、鈣代謝紊亂、機械性壓力、自由基侵襲等應激因素很敏感，易發生內質網應激反應，引發內質網相關性死亡。內質網在膜蛋白的合成、修飾和折疊及維持細胞內鈣Ca2+的穩定等方面都發揮關鍵性作用。當機體細胞受到缺氧、饑餓、自由基侵襲及鈣代謝紊亂等應激因素刺激時，內質網腔內未折疊蛋白增多或鈣失衡，引發內質網應激反應。內質網應激感受蛋白（PEAK、ATF-6和IRE-1）介導的信號轉導不僅是糾正內質網功能紊亂的重要機制，在強烈、持久應激刺激時，內環境紊亂無法糾正，內質網應激感受蛋白則會啟動凋亡程序，誘發細胞凋亡。內質網應激引起的細胞凋亡異于其他凋亡路徑，有其自身的信號通路，稱為內質網相關性死亡途徑，此途徑包含內質網應激誘導CHOP/GADD153表達、C-JUN氨基末端激酶（JNK）活化和內質網特有的Capase-12蛋白水解酶活化。CHOP/GADD153是內質網應激特異的轉錄因子，PEAK、ATF-6和IRE-1的活化均能促進CHOP的大量產生。CHOP表達增加會下調抗凋亡蛋白Bcl-2表達，促進反應性氧中介物（ROIs）和減少細胞內谷胱甘肽生成，從而引發細胞凋亡。內質網應激時，活化的IRE1招募JNK和腫瘤壞死因子受體相關因子TRAF2，TRAF2激活細胞凋亡信號激酶1（ASK1），并形成IRE-1/TRAF2/ASK1三聚體，隨后激活JNK，誘導細胞凋亡。Caspase-12位于內質網膜上，內質網Ca2+平衡的破壞或內質網未折疊蛋白的過量積聚均會誘導Caspase-12表達，同時也導致胞質內Caspase-7轉移到內質網表面，Caspase-7激活Caspase-12，激活的Caspase-12可進一步活化Caspase-3，引發細胞凋亡。內質網上Bcl-2家族中抑凋亡蛋白則可調節網腔中游離Ca2+濃度，維持胞質內的Ca2+濃度在合適的水平，進而抑制細胞凋亡[14-15]。
3.細胞自噬與軟骨退變的關系細胞自噬（autophagy）是依賴溶酶體途徑對胞質蛋白和細胞器進行降解的一種過程，并利用降解產物提供能量和重建細胞結構，在維持細胞穩態和細胞生命活動等方面起重要作用。細胞自噬與凋亡間的關系較為復雜，目前研究表明，自噬標志性基因ULK、Beclin1、LC3在正常的關節軟骨中有明顯表達，退變軟骨中自噬水平下降（其機制與溶酶體水解失敗密切相關），導致退變軟骨中自噬體清除減緩和毒性蛋白增加。自噬在骨關節炎軟骨細胞凋亡中更傾向于保護軟骨細胞，當細胞器受損時，細胞內自噬水平明顯升高，以清除受損的細胞器，阻止細胞凋亡啟動，但自噬過度或不足均可能導致自噬性細胞死亡[17-18]。因此，細胞自噬一方面保護細胞，另一方面則可導致自噬性細胞死亡。Atg1、Atg6、Atg8（哺乳動物中的同源物分別稱作ULK1、Beclin1、LC3）是自噬途徑的3個主要管理者，分別充當誘導者、調節者、執行者的角色。在哺乳動物中，mTOR整合生長因子、營養分子、氨基酸和能量感受信號，調控細胞生長、增殖、營養運輸、蛋白合成和自噬。細胞內營養缺乏時，mTOR活性受抑制，導致Atg家族成員激活，從而促進自噬泡形成；細胞內營養充足時，mTOR激活，從而抑制細胞自噬的發生。死亡相關蛋白激酶（DAPK）也是細胞自噬的重要調節因子，可使微管相關蛋白（MAP）1B磷酸化，進而使MAP1輕鏈3（LC3）-Ⅱ與自噬體膜結合。自噬蛋白Beclin1的BH3結構域與DAPK相互作用，可使BH3結構域磷酸化，從而阻斷Beclin1與凋亡基因Bcl-2和凋亡抑制基因Bcl-xL相互作用，促進自噬發生。
二、獨活寄生湯干預軟骨細胞凋亡的機制
軟骨細胞凋亡原因是多方面的，但最終都離不開凋亡相關因子的參與和調節。肝腎虧虛證存在不同程度的下丘腦-垂體-靶腺（腎上腺、甲狀腺、性腺及胸腺）軸功能紊亂，影響機體的神經-內分泌-免疫系統功能，從而產生一系列的臨床癥狀及體征。補腎柔肝藥能多方位調節下丘腦-垂體-靶腺軸及神經-內分泌-免疫網絡系統的功能，調節異常的細胞因子水平，上調性激素水平，保護軟骨細胞，調節軟骨基質的降解，參與調控軟骨退變；補腎柔肝、祛風活血藥通過影響凋亡信號通路，抑制促凋亡基因并促進抗凋亡基因的表達，從而抑制軟骨細胞凋亡和促進增殖。因此，獨活寄生湯作用機制可能是通過調節神經-內分泌-免疫系統、神經-內分泌-骨代謝系統的功能，調節線粒體功能、內質網應激反應、細胞自噬水平是獨活寄生湯干預軟骨細胞凋亡的重要作用途徑。
作者：劉發元李西海葉蕻芝劉獻祥單位：福建中醫藥大學中西醫結合研究院
【關鍵詞】 超聲;凋亡;形態學
Abstract: Objective To investigate the effect of diagnostic ultrasound exposure on the apoptosis of human embryonic kidney (HEK293) cells. Methods HEK293 cells were exposure to abdominal ultrasound probe for 0， 10， 20 and 30 min， and their apoptosis was detected by Hoechst 33258 staining. Results Compared with control group， apoptotic rate of HEK293 cells increased significantly after 20min exposure (P
Key words:ultrasound; apoptosis; morphology
超聲應用于產科，可以推算胎齡、診斷先天畸型及了解胎兒宮內發育情況，它能為胎兒、胚胎甚至正在發育成熟的卵泡提供一個清晰的圖像，同時也需要更高的超聲輸出功率。隨著孕前卵泡檢測和產前檢查越來越細致和精確，超聲運用的頻率、時間、輸出功率也在不斷增加，敏感的胚胎組織及生殖細胞受到的威脅也隨之加大。人們對超聲使用的安全性也越發關心。有關產科超聲的安全性，目前尚無統一定論，更無具體的輻照劑量可引起哪方面的影響這樣的規律可循，孕期超聲檢查只能盡可能地使用最低劑量。這使超聲的產前檢查安全性的遵循原則帶有盲目性，或者引起因不了解超聲的安全范圍而濫用超聲，為產前檢查帶來隱患。要明確知道產前超聲的安全范圍還需要一個漫長的過程，本實驗擬探討超聲近距離輻照對體外培養細胞凋亡形態學改變的影響，為產前超聲的安全使用提供一定的理論依據。
1 材料和方法
1.1 試劑
Hoechst 33258購自美國Sigma公司，DMEM培養基購自美國Gibco公司，胎牛血清(FBS)購自杭州四季青生物工程公司，胰蛋白酶購自美國Gibco公司，其余試劑為國產分析純。HEK293細胞株由廣東醫學院生化教研室提供。1 mg Hoechst 33258溶解于10mL PBS中，配成100 mg/L的10×Hoechst 33258儲存液，密封避光，4℃短期保存。
1.2 儀器
MCO15A CO2細胞培養箱(日本SANYO公司)，YJ875DA 醫用凈化工作臺(蘇州凈化設備廠)，IMTI型熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，Vivid 7彩色多普勒超聲診斷儀(GE公司)。
1.3 細胞培養與處理
HEK293細胞采用常規培養方法，無血清饑餓培養調整細胞周期一致后進行實驗。將細胞分成超聲照射0 、10、20、30 min組，空白組予以假照，腹部探頭產科診斷條件(3.5 MHz、MI 0.8)，介質為細胞培養液(主要成分為DMEM培養基)，輻照距離
1.4 細胞染色與觀察
收集處理后的細胞，PBS洗滌離心2次后取10μL細胞懸液滴于蓋玻片上，加1mL固定液(甲醇∶冰乙酸3∶1)，4℃固定5 min，棄去固定液，用PBS洗兩遍，吸盡液體。加入1mL Hoechst 33258工作液(10 mg/L)，搖床輕搖，染色10 min，棄去染色液，用熒光顯微鏡避光拍照，激發波長350 nm左右，發射波長460 nm左右。
1.5 結果評判
細胞凋亡過程中細胞核染色質的形態學改變分為三期：Ⅰ期的細胞核呈波紋狀或呈折縫樣，部分染色質出現濃縮狀態;Ⅱa期細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化;Ⅱb期的細胞核裂解為碎塊，產生凋亡小體。由兩位病理學技術人員對圖片進行分析對照。
1.6 凋亡百分率的計算
把載波片置于24孔板培養細胞，細胞爬片，調整周期及分組照射(方法同1.3)后培養24h，5mg/L的Hoechst 33258避光染色5min，熒光顯微鏡觀察。計算每孔5個高倍(×400)視野平均細胞總數、凋亡細胞數，最終算出細胞凋亡百分率。
1.7 統計學處理
計量數據以(±s)表示，使用SPSS10.0統計軟件進行處理，多個樣本均數的比較采用單因素方差分析及q檢驗。
2 結果
2.1 HEK293細胞體外培養
HEK293體外培養成功，經傳代培養后，待細胞生長疏密適中，于倒置相差顯微鏡下進行放大倍數為600倍拍照，光鏡下HEK293細胞的形態呈多角形，貼壁生長，細胞間有連接，細胞核圓形或橢圓形，大小約占整個細胞的1/3，核內染色質及核仁清晰，部分可見分裂相。
2.2 凋亡細胞Hoechst 33258染色的形態學變化
空白組：超聲處理0 min(假照)，細胞核大小較一致，核膜完整，核內染色質呈小點狀均勻分布，部分可見有絲分裂相，未見異型核，見圖1。
1組：超聲處理10 min，細胞核形態尚規則，核膜完整，未見異形核，但對比空白組，本組細胞核部分出現大小不一，核內染色質聚集的現象，見圖2。
2組：超聲處理20 min，細胞核大小不均，一部分細胞核脹大，染色質邊集，一部分細胞核縮小濃染，呈小顆粒狀，個別細胞核膜不完整，染色質疏松，表現為凋亡Ⅰ期和Ⅱa期改變，見圖3。
3組：超聲處理30 min，細胞核大小不均，部分可見異形核的出現，部分細胞核內染色質濃染邊集，呈小團塊狀，個別核膜破裂染色質疏松分布于胞質中，表現為凋亡Ⅱa期和Ⅱb期改變，見圖4。
圖1圖2圖3圖4
圖1 空白組細胞Hoechst 33258染色結果(×600);圖2 超聲照射10 min組細胞Hoechst 33258染色結果(×600);
圖3 超聲照射20 min組細胞Hoechst 33258染色結 (×600);圖4 超聲照射30 min組細胞Hoechst 33258染色結果(×600)。
2.3 細胞凋亡率比較
詳見表1。
3 討論
細胞凋亡是多細胞有機體為保持自身組織穩定、調控自身細胞的增殖和死亡之間的平衡、由基因控制的細胞主動性死亡過程。細胞凋亡的主要特點為：細胞體積小，染色質濃縮，呈塊狀致密染色區，DNA分子被特異性DNA內切酶在核小體間切斷，核裂解，形成凋亡小體[1]。生殖細胞、受精卵和胚胎組織中，即便是個別細胞出現異常的凋亡，都有可能對其生長發育造成影響。因此超聲對細胞凋亡的影響受到學者們的關注。bcl2是一種重要的凋亡抑制因子，周海燕等[2]研究證明，長時間連續超聲照射可引起胎鼠腎小管上皮表1 不同劑量的超聲作用HEK293細胞凋亡百分率的改變細胞bcl2蛋白表達水平下降。p53基因在誘導神經細胞凋亡時有重要的作用，趙晶等[3]研究表明，超聲輻照時間和劑量的增加可引起p53基因的蛋白表達水平增加。何明生等[4]發現，電壓為10 mV條件下超聲輻照K562細胞10 min以上，輻照組細胞形態變化較大，核染色質濃縮呈斑塊狀，并有核碎裂、凋亡小體出現。有學者發現低頻超聲輻照HL60后細胞膜空隙率增加，這可能是凋亡前的形態學改變[5]。Lagneaux等[6]則認為低頻超聲效應與聲化學機制有關，超聲誘導的聲化學冷光能觸發光敏感性單態氧的產生，從而對細胞產生一個“氧化應激”，繼而啟動細胞凋亡反應。一般以細胞核染色質的形態學改變為指標來評判細胞凋亡的進展情況，常用的DNA特異性染料有Hoechst 33258，它能與DNA非嵌入式結合，主要結合在AT堿基區，紫外光激發時發射明亮的藍色熒光，從而對細胞核進行形態學的觀察。Hoechst 33258凋亡染色法具有直觀，方便的優點，并可通過形態學的變化對其凋亡的早中晚期進行估測。本實驗用Hoechst 33258對空白組和處理組細胞染色后，經熒光顯微鏡觀察，與凋亡形態的標準相符合，其中超聲處理30 min組部分細胞核染色質高度凝聚、邊緣化并產生了凋亡Ⅱb期的形態學改變，部分細胞核呈異形核，細胞核形態改變最明顯，細胞凋亡比例最高(P
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從20世紀80年代末期以來，人們對細胞凋亡的認識逐漸深入，對細胞凋亡發生機理的了解越來越透徹，同時也發現這一過程包含著非常復雜的調控機制。盡管仍有許多問題甚至是關鍵的問題沒有搞清楚，但近幾年的研究在凋亡信號轉導途徑、細胞凋亡的生化反應機制以及細胞凋亡的基因調控等方面都取得了顯著的進展。本文就細胞凋亡的機理與調節作用進行綜述。
1 細胞凋亡的生物學特征
1.1 形態學變化：從形態學觀察，細胞凋亡的變化是多階段的，細胞凋亡往往涉及單個細胞，即便是一小部分細胞也是非同步發生的。首先出現的是細胞體積縮小，胞間連接消失，與周圍的細胞脫離， 核質濃縮，核膜核仁破碎 ；胞膜有小泡狀形成， 胞膜結構仍然完整，最終可將凋亡細胞分割為幾個凋亡小體[1] 。 1.2 生物化學變化
1.2.1 DNA降解：細胞凋亡的一個顯著特點是細胞染色體的DNA降解，這是一個較普遍的現象。這種降解非常特異并有規律，所產生的不同長度的DN段約為180~200 bp的整倍數，而這正好是纏繞組蛋白寡聚體的長度，提示染色體DNA恰好是在核小體與核小體的連接部位被切斷，產生不同長度的寡聚核小體片段。實驗證明，這種DNA的有控降解是一種內源性核酸內切酶作用的結果，該酶在核小體連接部位切斷染色體DNA，這種降解表現在瓊脂糖凝膠電泳中就呈現特異的梯狀Ladder圖譜，而壞死細胞呈彌漫的連續圖譜[2]。
1.2.2 生物大分子合成：細胞凋亡的生化改變不僅僅是DNA的有控降解，在細胞凋亡的過程中往往還有新的基因的表達和某些生物大分子的合成作為調控因子[3]。 如在糖皮質激素誘導鼠胸腺細胞凋亡過程中，加入RNA合成抑制劑或蛋白質合成抑制劑即能抑制細胞凋亡的發生。
2 細胞凋亡的機理
2.1 接受凋亡信號：細胞凋亡的啟動是細胞在感受到相應的信號刺激后胞內一系列控制開關的開啟或關閉，不同的外界因素啟動凋亡的方式不同，所引起的信號轉導也不相同。
2.2 凋亡的重要執行者：現已能確定Caspase即半胱天冬蛋白酶在凋亡過程中是起著必不可少的作用，細胞凋亡的過程實際上是Caspase不可逆有限水解底物的級聯放大反應過程。目前，至少有10多種Caspase被發現，Caspase分子間的同源性很高，結構相似，都是半胱氨酸家族蛋白酶。根據功能可把Caspase基本分為二類：一類參與細胞的加工；另一類參與細胞凋亡。Caspase家族一般具以下特征。
2.2.1 常以酶原的形式存在：Caspases在細胞內以無活性的酶原形式存在（相對分子質量29~49 kDa），在受到激活后其內部保守的天冬氨酸殘基經水解形成大（P20）小（P10）兩個亞單位，并進而形成兩兩組成的有活性的四聚體，其中，每個P20/P10異二聚體可來源于同一前體分子也可來源于兩個不同的前體分子[4]。
2.2.2 具有半胱氨酸激活位點和底物裂解位點：Caspases C端同源區具有半胱氨酸激活位點和底物裂解位點，當作用于胞內特異性底物后將引起細胞凋亡。Caspases的底物特異性由其裂解位點N-端的4個氨基酸殘基決定，其底物裂解部位通常位于靶蛋白質一級結構中Asp殘基后，數目由1個到多個不等。Caspase酶系作為細胞凋亡的中樞效應器，在細胞凋亡的啟動及進程中發揮著極為重要的作用[5，6]。
2.2.3 Caspase活化機制：Caspase的活化是有順序的多步驟水解的過程，Caspase分子各異，但是它們活化的過程相似。首先在caspase前體的N-端前肽和大亞基之間的特定位點被水解去除N-端前肽，然后再在大小亞基之間切割釋放大小亞基，由大亞基和小亞基組成異源二聚體，再由兩個二聚體形成有活性的四聚體[7]。
2.2.4 Caspase的效應機制
2.2.4.1 凋亡抑制物：正常活細胞因為核酸酶處于無活性狀態，而不出現DNA斷裂，這是由于核酸酶和抑制物結合在一起，如果抑制物被破壞，核酸酶即可激活，引起DN段化（fragmentation）。現知Caspase可以裂解這種抑制物而激活核酸酶，因而把這種酶稱為Caspase激活的脫氧核糖核酸酶（caspase-activated deoxyribonulease CAD），而把它的抑制物稱為ICAD。因而，在正常情況下，CAD不顯示活性是因為CAD-ICAD以一種無活性的復合物形式存在。ICAD一旦被Caspase水解，即賦予CAD以核酸酶活性，DN段化即產生。研究發現CAD只在ICAD存在時才能合成并顯示活性[8]，提示CAD-ICAD以一種其轉錄方式存在，因而ICAD對CAD的活化與抑制卻是必需要的。
2.2.4.2 破壞細胞結構：Caspase可直接破壞細胞結構，如裂解核纖層，核纖層（Lamina）是由核纖層蛋白通過聚合作用而連成頭尾相接的多聚體，由此形成核膜的骨架結構，使染色質（chromatin）得以形成并進行正常的排列。在細胞發生凋亡時，核纖層蛋白作為底物被Caspase在一個近中部的固定部位所裂解，從而使核纖層蛋白崩解，導致細胞染色質的固縮[9]。
2.2.4.3 使調節蛋白喪失功能：Caspase可作用于幾種與細胞骨架調節有關的酶或蛋白，改變細胞結構。其中包括凝膠原蛋白（gelsin）、聚合黏附激酶（focal adhesion kinase，FAK）、P21活化激酶α（PAKα）等。這些蛋白的裂解導致其活性下降，如Caspase可裂解凝膠原蛋白而產生片段，使之不能通過肌動蛋白（actin）纖維來調節細胞骨架[10]。
2.2.4.4 其它功能：Caspase還能滅活或下調與DNA修復有關的酶、mRNA剪切蛋白和DNA交聯蛋白。由于DNA的作用，這些蛋白功能被抑制，使細胞的增殖與復制受阻并發生凋亡。
3 細胞凋亡的調節
細胞凋亡受到嚴格調控，在正常細胞Caspase處于非活化的酶原狀態，凋亡程序一旦開始，Caspase被活化后發生凋亡蛋白酶的級聯反應，發生不可逆的凋亡。 這與一系列凋亡抑制分子有關，現已發現多種凋亡抑制分子，包括P35，CrmA，IAPs，FLIPs以及Bcl-2家族的凋亡抑制分子。
3.1 P35和CrmA：P35和CrmA是廣譜凋亡抑制劑，研究結果表明P35以競爭性結合方式與靶分子形成穩定的具有空間位阻效應的復合體并且抑制Caspases活性，同時Caspases在特定位點特異切割P35，切割后的P35與caspase的結合更強[11]；CrmA（Cytokine response modfer A）是血清蛋白酶抑制劑，能夠直接抑制多種蛋白酶的活性。
3.2 FLIPs：FLIPs(FLICE-imhibirory proterins)能抑制Fas/TNFR1介導的細胞凋亡。它有多種變異體，但其N-端功能前區（Prodomain）完全相同，C端長短不一。FLIPs通過DED功能區，與FADD和Caspase-8，10結合，拮抗它們之間的相互作用，從而抑制Caspase8，10的作用[12]。
3.3 凋亡抑制蛋白：凋亡抑制蛋白（IAPs，inhibitors of Apoptosis protien）為一組具有抑制凋亡作用的蛋白質[13]，它首先是從桿狀病毒基因組克隆并發現能夠抑制由病毒感染引起的宿主細胞死亡反應。具有大約20氨基酸組成的功能區，這對IAPs抑制凋亡是必需要的，既可以結合活化的Caspase，又可結合Caspase酶原，進而抑制細胞凋亡。
3.4 Bcl-2家族：Bcl-2家族成員眾多， 它們分別既有抗凋亡作用，也有促凋亡的作用。多數成員間有兩個結構同源區域，在介導成員之間的二聚體化過程中起重要作用。Bcl-2成員之間的二聚體化是成員之間功能實現或功能調節的重要形式。Bcl-2生理功能是阻遏細胞凋亡，延長細胞壽命，在一些白血病中Bcl-2呈過度表達。Bcl-2的亞細胞定位已經明確，它在不同的細胞類型可以定位于線粒體、內質網以及核膜上，并通過阻止線粒體細胞色素C的釋放而發揮抗凋亡作用[14]。此外， Bcl-2具有保護細胞的功能， Bcl-2的過度表達可引起細胞核谷胱苷肽（GSH）的積聚，導致核內氧化還原平衡的改變，從而降低了Caspase的活性。Bax是Bcl-2家族中參與細胞凋亡的一個成員，當誘導凋亡時，它從細胞質基質遷移到線粒體和核膜。
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目的：研究應用順鉑聯合姜黃素對誘導胃癌細胞HGC27凋亡的影響及機制。方法：用CCK8法檢測單獨或聯合使用不同劑量順鉑或/和姜黃素對胃癌細胞HGC27增殖的影響；用Hochest33258染色檢測聯合應用順鉑和姜黃素誘導胃癌細胞HGC27凋亡的發生率。用Westernblot檢測細胞凋亡相關分子PARP1蛋白剪切體和DNA損傷蛋白p-γH2AX的表達變化。結果：單用順鉑可以呈劑量依賴性地促進HGC27細胞凋亡。5μmol•L-1姜黃素對HGC27細胞增殖無明顯作用，10μmol•L-1姜黃素反而輕微促進HGC27細胞增殖。20、40、80μmol•L-1姜黃素對HGC27細胞的增殖抑制率分別為10.97%、15.15%、32.93%。分析聯合用藥組：5μmol•L-1姜黃素聯合順鉑組反而促進HGC27細胞生長；10μmol•L-1姜黃素聯合不同劑量順鉑和單用順鉑組比較，組間抑制率沒有統計學差異（P>0.05）。20μmol•L-1姜黃素聯合4、6μmol•L-1順鉑有明顯的促進細胞的凋亡作用,抑制率分別為70.68%、87.30%。Hochest33258染色結果顯示，聯合用藥組細胞凋亡小體和壞死細胞明顯增多。Westernblot結果顯示，在聯合用藥組HGC27細胞PARP1剪切體蛋白和p-γH2AX蛋白表達明顯增加。結論：順鉑聯合姜黃素可以促進胃癌細胞HGC27的凋亡，機制是姜黃素可以加重順鉑引起的細胞DNA雙鏈損傷。
關鍵詞
順鉑；姜黃素；細胞凋亡；p-γH2AX
自從Rosenberg等[1]發現順鉑的抗腫瘤活性后，鉑類藥物的研究得到迅速發展。鉑類藥物已被廣泛應用于各種惡性腫瘤的臨床治療中。據統計，目前臨床化療或者聯合化療治療惡性腫瘤的方案中有70%~80%應用到鉑類藥物。由于鉑類藥物在治療過程中伴發嚴重的胃腸反應、腎毒性、耳毒性、神經毒性和耐藥性等[2]，因此，如何減弱該類藥物的毒副作用和增加其化療敏感性日益受到關注。姜黃素是從姜黃根莖中提取的一種植物多酚。姜黃素的抗腫瘤作用為多靶點，因而日益引起重視。姜黃素對消化系統、生殖系統的多種腫瘤等均具有一定程度的抑制作用[3]。化療藥物增敏方面，聯合使用順鉑和姜黃素已用于肝癌[4]、肺癌[5]、卵巢癌[6]等研究。目前，對于順鉑聯合姜黃素是否可以直接通過引起DNA雙鏈損傷的加重而誘導胃癌HGC27細胞凋亡尚未見報道。本實驗通過聯合用藥直接觀察雙鏈損傷的指標p-γH2AX和凋亡相關標志物PARP1蛋白剪切體的變化，初步探討這兩種藥物聯合作用誘導胃癌細胞HGC27凋亡的作用機制。
1材料
1.1細胞來源及培養人胃癌細胞HGC27購自中國科學院上海細胞生物研究所。細胞培養于含100μg•mL-1鏈霉素、100U•mL-1青霉素和10%胎牛血清的RMPI1640培養液中，于37℃、5%CO2培養箱中培養。
1.2試藥與儀器RMPI1640培養基（Invitrogen，美國）；胎牛血清（四季青，杭州）；青霉素（山東新華魯抗，批號20141007）；鏈霉素（華北制藥，批號F31121126）；順鉑注射液（江蘇豪森藥業股份有限公司，諾欣TM，批號140302）；姜黃素（Turmeric，原植物Curcumalon-ga，Sigma公司）；BCA（BicinchoninicAcidproteinsaykit）蛋白濃度測定試劑盒、熒光染料Hochest33258試劑盒、RIPA裂解液[50mmol•L-1Tris（pH7.4），150mmol•L-1NaCl，1%TritonX-100，0.1%十二烷基磺酸鈉，1%去氧膽酸鈉]；裂液、單克隆抗α-tubulin抗體、抗熒光淬滅劑（南通碧云天生物技術有限公司）；CCK-8（CellCountingKit-8）試劑盒（上海同仁化學有限公司）；抗PARP1抗體、抗p-γH2AX抗體（美國Abcam公司）；增強化學發光液（Enhancedchemi-luminescence，ECL，美國Millipore公司）；其它生化試劑均為國產分析純。CO2恒溫培養箱（美國Thermo公司）；IX-70倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；垂直電泳儀；半干式電轉移裝置（美國Bio-Rad公司）；酶聯免疫檢測儀（美國Bio-TEKInstruments公司）。
2方法
2.1CCK-8法檢測順鉑和姜黃素抑制胃癌細胞HGC27增殖培養HGC27細胞：在96孔板中每孔接種5000個細胞。對細胞進行分組處理：單用順鉑組（0、2、4、6、8μmol•L-1）、單用姜黃素組（0、5、10、20、40、80μmol•L-1）、順鉑聯合姜黃素組，即2、4、6、8μmol•L-1順鉑分別聯合5、10、20μmol•L-1姜黃素，以上各組處理細胞24h，每孔加入CCK-8試劑10μL，37℃繼續培養1.5h，在酶標儀上450nm檢測吸光度A450nm。每組設3平行實驗。計算藥物（或藥物組合）對細胞增殖的抑制率。
2.2Hochest33258染色法檢測順鉑聯合姜黃素誘導胃癌細胞HGC27凋亡在6孔板中接種HGC27細胞，待細胞培養至80%滿6孔板孔底。分別設4組：對照組、單用4μmol•L-1順鉑組、單用20μmol•L-1姜黃素組、4μmol•L-1順鉑聯合20μmol•L-1姜黃素用藥組。處理HGC27細胞24h，去培養液，用甲醇室溫固定30min。每孔加入Hochest33258染色液50μL。避光染色30min后，應用磷酸鹽緩沖液（PBS）液洗滌3遍，加入抗熒光淬滅劑20μL，立即在熒光顯微鏡下觀察細胞中凋亡小體的情況。
2.3免疫印跡法檢測HGC27細胞凋亡相關分子的變化在培養的HGC27細胞，按照“2.2”方法分別設立對照組和處理組，處理細胞24h。用RIPA裂解液裂解細胞，4℃、12000r•min-1離心10min，取上清液，運用BCA法測定蛋白濃度。灌制12.5%分離膠的SDS-PAGE。分別按照60μg/孔的上樣量，加入全蛋白，經90V穩壓電泳后，運用200mA恒流半干式電轉移1h，5%脫脂奶粉室溫封閉膜1h，PBST液洗滌3次，孵育抗體按照α-tubulin（1∶1000）、PARP1（1∶1000）；p-γH2AX（1∶500）稀釋，4℃孵育過夜，PBST液洗滌；加入1∶1000稀釋的辣根過氧化酶（HRP）標記二抗，37℃孵育1h，PBST液洗滌。ECL化學發光液曝光、檢測。進行灰度值比較（相對灰度值=處理組灰度值/對照組）。
2.4統計學處理運用SPSS16.0統計軟件包進行分析。計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，組間樣本均數間采用多因數方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。
3結果
3.1順鉑和姜黃素對HGC27細胞增殖的抑制作用
3.1.1順鉑和姜黃素單獨作用結果預實驗分別考察4種不同濃度順鉑和5種不同濃度姜黃素組對HGC27細胞的抑制作用，由表1可見，2、4、6、8μmol•L-1順鉑可以呈劑量依賴性的抑制細胞增殖。5μmol•L-1姜黃素對HGC27細胞增殖無明顯影響；10μmol•L-1姜黃素對HGC27細胞增殖反而略有促進作用；20、40、80μmol•L-1姜黃素可以不同程度地抑制HGC27細胞增殖。其中20、40μmol•L-1姜黃素組間沒有差異；80μmol•L-1姜黃素有明顯抑制HGC27細胞增殖的作用（見表1）。
3.1.2順鉑聯合姜黃素對HGC27細胞增殖的影響聯合用藥結果（見表2）顯示：2、4、6μmol•L-1順鉑和5μmol•L-1的姜黃素聯合應用對HGC27細胞增殖的抑制率分別為17.64%、36.90%、66.29%。單用2、4、6μmol•L-1順鉑對HGC27細胞抑制率分別是34.09%、46.18%、71.55%。提示5μmol•L-1的姜黃素和順鉑聯用反而抑制腫瘤細胞的凋亡。2、4、6、8μmol•L-1順鉑聯合10μmol•L-1的姜黃素作用時，誘導HGC27細胞凋亡率分別為32.32%、49.00%、72.80%、86.21%，與單用順鉑組細胞凋亡率34.09%、46.18%、71.55%、86.21%相接近，兩組間抑制率沒有統計學差異（P>0.05）。當4、6μmol•L-1的順鉑聯合20μmol•L-1的姜黃素作用時，誘導細胞凋亡率為70.68%、87.30%，顯著高于單用順鉑的凋亡率，P<0.05，差異具有統計學意義（見表2）。
3.2順鉑聯合姜黃素對HGC27細胞凋亡的影響聯合用藥作用于HGC27細胞24h后，經Hochest33258染色，并計數500個細胞中凋亡細胞的個數，折算凋亡率（每組3平行）。結果顯示，單用順鉑可以引起細胞凋亡（圖1-B），其凋亡率為23.2%；20μmol•L-1姜黃素可以誘導少量細胞凋亡（圖1-C），凋亡率為5.71%；聯合應用順鉑和姜黃素作用于HGC27細胞組發生的凋亡最明顯（圖1-D），其凋亡率為35.60%，顯著高于單用順鉑組和單用姜黃素處理組（圖2）（P<0.05）。
3.3免疫印跡法檢測HGC27細胞在凋亡過程中相關因子的變化運用Westernblot法檢測單用4μmol•L-1順鉑、單用20μmol•L-1姜黃素和順鉑聯合姜黃素作用24h，HGC27細胞內DNA雙鏈損傷分子標志物p-γH2AX和凋亡蛋白PARP1剪切體的表達水平。結果顯示，單用4μmol•L-1順鉑和20μmol•L-1姜黃素均可以引起p-γH2AX表達增加，其相對灰度值分別為：6.70和3.7；聯合用藥組p-γH2AX表達增加最明顯，其相對灰度值為8.52。單用順鉑和姜黃素也可以誘導HGC27細胞中PARP1蛋白的剪切體表達，其相對灰度值分別為5.32和3.27。聯合用藥組中，細胞內PARP1蛋白的剪切體表達增加最明顯，其相對灰度值為6.27。與單用順鉑組比較，聯合用藥組p-γH2AX和PARP1剪切體均顯著增加（P<0.05），提示姜黃素可促進順鉑誘導的HGC27細胞DNA損傷和凋亡（圖3、圖4）。
4討論
我國胃癌的發病率占所有惡性腫瘤的第四位，死亡率占第二位。作為一線化療藥物，順鉑被廣泛用于胃癌等實體瘤治療中。順鉑主要通過主動運輸形式進入細胞，與DNA嘌呤形成鏈內交聯或鏈間交聯，導致DNA雙鏈損傷，引發細胞凋亡[7]，DNA損傷可激活PARP1蛋白，從而殺傷腫瘤細胞[7]。但是，應用順鉑治療的同時會引發多種副作用和產生藥物耐藥性。如何降低鉑類藥物的耐藥性，增加機體藥物敏感性，愈來愈受到人們重視。將中藥提取單體姜黃素聯合順鉑用于誘導HGC27細胞DNA損傷和凋亡，結果顯示，順鉑可以濃度依賴性誘導胃癌細胞凋亡；而姜黃素只有當濃度達20μmol•L-1時才有誘導HGC27細胞凋亡的作用。所以，最終選擇4μmol•L-1順鉑和20μmol•L-1姜黃素用于觀察其聯合作用，其抑制率是單用4μmol•L-1順鉑的1.53倍，明顯提高HGC27增殖抑制和誘導凋亡的效果。DNA雙鏈損傷的早期反應是使組蛋白γH2AX蛋白的羧基末端磷酸化，γH2AX蛋白磷酸化的升高，激活凋亡相關蛋白PARP1的剪切體的表達，可顯著增加癌細胞對順鉑等化療藥物的敏感性[8]。磷酸化γH2AX蛋白是DNA雙鏈損傷的效應器，其變化可反映DNA雙鏈損傷的程度[9]。本研究顯示，4μmol•L-1順鉑聯合20μmol•L-1的姜黃素可以引起磷酸化γH2AX表達明顯上升，PARP1蛋白剪切體表達增加；聯合用藥誘導HGC27細胞的凋亡也相應增加。本研究結果為如何降低順鉑毒副作用、提高順鉑化療藥物的敏感性提供了新的思路。
順鉑聯合姜黃素作用于HGC27細胞，可以增強順鉑誘導細胞凋亡的作用。姜黃素增強順鉑殺傷HGC27細胞作用的原因可能是姜黃素增強了順鉑和DNA的結合能力，從而抑制DNA修復功能[10]，使腫瘤細胞DNA損傷加重，促進細胞的凋亡。本文對順鉑聯合姜黃素促進胃癌細胞凋亡作用進行了初步研究。姜黃素是否能增加其它化療藥物效果或用于逆轉順鉑耐藥細胞的敏感性和減少化療藥物毒副作用等值得深入研究。
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【摘要】 目的： 探討羥甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑氟伐他汀對氧化亞氮缺乏性高血壓大鼠腎臟細胞凋亡的影響。方法： 給予左旋硝基精氨酸甲酯(Lnitroargininemethylester，LNAME)建立氧化亞氮缺乏性高血壓腎臟硬化大鼠模型，觀察氟伐他汀對高血壓腎臟硬化大鼠Fas、FasL、Bax和Bcl2蛋白表達水平的影響。結果： 氟伐他汀使高血壓腎臟硬化大鼠凋亡蛋白Fas、FasL、Bax表達減少，抗凋亡蛋白Bcl2表達增加。結論： 氟伐他汀能夠改善高血壓腎臟硬化，調節細胞凋亡水平可能是其機制之一。
【關鍵詞】 高血壓腎臟硬化; 氟伐他汀; 細胞凋亡
[Abstract] Objective: To assess the apoptosis occurring in the kidney of SD rats induced by Lnitroargininemethylester(LNAME)over time and investigate the effects of fluvastatin treatment. Methods： Male SD rats were administered by LNAME to form hypertensive nephropathy，then the rats were administered by fluvastatin，at last the rats had their kidneys removed to measure protein expression of Fas，FasL，Bax and Bcl2 genes by Western blot. Pathologic measurement had been taken. Results: After fluvastatin treatment the protein expression of Fas， FasL and Bax were more depressed and the protein expression of Bcl2 was higher. Conclusion：Fluvastatin prevented or retarded hypertensioninduced renal nephropathy via inhibition of renal nephropathy fibrosis，the apoptosis might be one of the mechanisms.
[Key words] hypertensive nephropathy; fluvastatin; apoptosis
近來，隨著我國人口的老齡化和人們生活方式的改變，原發性高血壓的患病率逐年升高，高血壓所導致的終末期腎衰發生率呈上升趨勢，在終末期腎衰竭患者中，高血壓腎臟硬化占第二位[1]。氟伐他汀是一種新型的3羥基3甲基戊二酰輔酶A(HMGCoA)還原酶抑制劑，不僅具有降脂作用，還是有一定的腎保護作用[2]。本實驗通過觀察大鼠腎臟凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的變化，以探討氟伐他汀對高血壓腎臟硬化大鼠腎臟細胞凋亡的影響。
1 材料與方法
1.1 材 料
1.1.1 實驗動物 健康成年雄性SD大鼠30只，體質量(230±20)g，由江蘇大學醫學院實驗動物中心提供。
1.1.2 藥品及試劑 左旋硝基精氨酸甲酯(Lnitroargininemethylester，LNAME，Sigma公司)，氯胺酮(江蘇恒瑞醫藥有限公司)，氟伐他汀(北京諾華制藥公司)，Fas、FasL、Bax和Bcl2抗體(南京凱基生物工程有限公司)。
1.1.3 實驗儀器 無創尾動脈血壓分析系統(上海奧爾科特生物科技有限公司)，病理切片機(德國Leica RM2135)，顯微照相及圖像分析系統(德國Leica QWIN3)，凝膠成像系統(美國BIORAD公司)。
1.2 方 法
1.2.1 大鼠分組及模型制備 選擇健康成年雄性SD大鼠30只，隨機取20只大鼠制備高血壓腎臟硬化模型，另10只在相同條件下飼養，設為正常對照組。造模大鼠予LNAME 50 mg·kg-1·d-1灌胃給藥，8周后造模成功的15只大鼠隨機分為兩組，一組為氟伐他汀組(8只)：給予5 mg·kg-1.d-1氟伐他汀灌胃，共8周;另一組為高血壓腎臟硬化組(7只)：予等量生理鹽水灌胃，共8周，每周測量各組大鼠體質量，根據體質量調整藥物劑量。
1.2.2 血壓的測定 第0，2，4，6，8，10，12，14，16周予尾動脈測血壓，收縮壓≥140 mmHg定為高血壓。
1.2.3 組織標本的采集 給藥結束后無痛處死大鼠，取出腎臟，并用冰生理鹽水經腎動脈沖洗至發白，標本一部分用4%低聚甲醛固定，石蠟包埋制備切片，行HE和Masson染色，由兩位病理科醫生進行腎小球硬化評分：觀察5個視野20個腎小球，計算每個腎小球內細胞數，再取平均值，計算出單個腎小球內細胞數;根據每個腎小球變性壞死程度、單個腎小球內細胞數、系膜基質區大小、毛細血管狹窄或擴張程度及球囊粘連程度等，進行損傷性評分：沒有損傷記為0分，輕度損傷記1分，中度損傷記2分，重度損傷記3分，幾乎完全損傷記4分。腎小球損傷指數=(1×n1/20+2×n2/20+3×n3/20+4×n4/20) ×100，其中n分別代表不同損傷程度的腎小球個數。
1.2.4 細胞凋亡的檢測 采用蛋白質印跡方法測定Fas、FasL、Bax和Bcl2蛋白濃度。首先將腎皮質稱重，加入裂解液以及蛋白酶抑制劑，制作勻漿，按比例配制分離膠和濃縮膠，加樣后電泳，轉膜，封閉抗體雜交，最后將PVDF膜放入 BIORAD凝膠成像系統，用軟件計算灰度值。
1.2.5 統計學分析 所有資料采用SPSS11.5軟件處理，計量資料以均數±標準差表示，多組間比較用單因素方差分析，兩組比較用LSD法。
2 結 果
2.1 各組大鼠收縮壓的變化
LNAME灌胃后，造模大鼠2周血壓即升高，到第4周時形成穩定的高血壓模型，4周時收縮壓>140 mmHg，均達到高血壓診斷標準。8周時正常對照組收縮壓為(102.6±6.48)mmHg，高血壓腎臟硬化組為(213.8±13.44)mmHg，氟伐他汀組為(216.6±11.44)mmHg，高血壓腎臟硬化組和氟伐他汀組相比，血壓的差異無統計學意義(P>0.05)。16周時正常對照組收縮壓為(106.7±7.26)mmHg，高血壓腎臟硬化組為(207.3±11.53)mmHg，氟伐他汀組為(199.3±11.61)mmHg，高血壓腎臟硬化組和氟伐他汀組相比，血壓的差異無統計學意義(P>0.05)，氟伐他汀對血壓沒有影響，見圖1。
2.2 腎臟病理變化
與正常對照組相比，高血壓腎臟硬化組大鼠多數腎小球存在嚴重硬化，腎小球萎縮，囊腔縮小，球囊明顯粘連，重度系膜細胞增生，基底膜增厚明顯，單個腎小球內細胞數增多，HE染色可見系膜旁及系膜區嗜紅物質基質沉積，見圖2。Masson染色可見腎小球內有較強的基質膠原陽性染色(藍色)，見圖3。高血壓腎臟硬化組的腎小球內細胞數、腎小球硬化評分與正常對照組比較顯著提高，兩組比較差異有統計學意義(P
2.3 細胞凋亡的檢測結果
高血壓腎臟硬化組腎皮質的Bax、Fas和FasL 蛋白表達水平顯著高于正常對照組，Bcl2蛋白表達水平顯著低于正常對照組，兩組比較差異有統計學意義(P
3 討 論
細胞凋亡和細胞增生共同調節腎臟各部分細胞總量的平衡，細胞凋亡可參與高血壓腎臟硬化的發生， 并在調節靶器官細胞數量方面發揮重要作用。高血壓可能作為一種觸發因素， 激活凋亡基因表達， 從而誘導或抑制細胞凋亡， 參與高血壓所致腎損害。
本研究結果表明，高血壓腎臟硬化組的Fas、FasL和Bax蛋白水平明顯高于正常對照組，而Bcl2蛋白水平低于正常對照組。目前認為腎實質細胞的凋亡是高血壓腎臟硬化的重要機制之一，細胞凋亡是腎小球硬化時腎小球細胞清除的重要形式。高血壓時腎實質細胞凋亡增加與下列因素有關：① 系膜細胞分泌的異常細胞外基質。在人腎小球腎炎和大鼠腎小球硬化模型中，系膜細胞凋亡主要出現在細胞外基質成分和結構發生改變的時期，提示在進行性腎小球硬化時，腎小球細胞凋亡可能受其周圍細胞外基質的控制。② TGFβ1的增加。新近的研究發現TGFβ1對腎小球細胞是否發生凋亡也起重要調控作用，TGFβ1可誘導體外培養的腎小球足突細胞凋亡[3]。氟伐他汀使用8周后Fas和FasL的蛋白水平明顯低于高血壓腎臟硬化組，并且促凋亡基因Bax蛋白水平顯著低于高血壓腎臟硬化組，而抗凋亡基因Bcl2的蛋白水平顯著高于高血壓腎臟硬化組。氟伐他汀可能通過減少腎實質細胞的凋亡，改善腎臟硬化。已有研究表明，他汀類藥物能夠抑制細胞凋亡，辛伐他汀對糖尿病腎病晚期細胞凋亡有一定的抑制作用[4]。Mizuguchi等[5]研究表明，阿伐他汀顯著抑制單側輸尿管梗阻模型大鼠腎小管上皮細胞凋亡，促進腎小管上皮細胞的再生。Usui等[6]研究表明，他汀類藥物通過抑制法呢基焦磷酸(FPP)和攏牛兒基攏牛兒焦磷酸(GGPP)的產生，阻斷了由Ras介導的細胞內信號傳遞，從而引起腎臟細胞的凋亡減少。他汀減少了小G蛋白p21RhoB的異戊二烯化，從而減少了血管平滑肌細胞的凋亡，通過調節信號途徑而減少了細胞的凋亡。
我們認為在高血壓腎臟硬化后期以腎實質細胞凋亡為主要表現時，他汀類藥物可通過降低TGFβ1的作用而達到抑制細胞凋亡的作用。Zhang等[7]發現阿伐他汀治療大鼠異體移植腎臟時，可降低TGFβ1的表達。體外研究也表明他汀類藥物可降低TGFβ1的表達，可能是通過降低血管緊張素Ⅱ來下調其表達的[8]。另一方面他汀類藥物可通過調節纖溶酶原減少細胞外基質沉積而減少細胞凋亡。他汀可通過調節纖溶酶原系統的活性使失活的纖溶酶原再生。董一飛等[8]研究表明，無論在mRNA水平還是蛋白水平，阿伐他汀都能明顯抑制膠原Ⅰ和纖溶酶原激活物抑制劑1的表達，表明阿伐他汀能影響系膜細胞的細胞外基質合成和降解，改善大鼠系膜細胞的細胞外基質積聚。他汀通過減少細胞外基質沉積，使受其控制的腎小球細胞凋亡受到抑制。
因此，我們認為氟伐他汀可能通過減少細胞外基質沉積和降低TGFβ1的表達而抑制了腎實質細胞的凋亡，改善了高血壓腎臟硬化。
參考文獻
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