時間：2023-05-30 10:06:43
開篇：寫作不僅是一種記錄，更是一種創造，它讓我們能夠捕捉那些稍縱即逝的靈感，將它們永久地定格在紙上。下面是小編精心整理的12篇纖維素酶，希望這些內容能成為您創作過程中的良師益友，陪伴您不斷探索和進步。
纖維素是煙草中主要的細胞壁物質，其含量高低直接影響煙葉的品質。低等級煙葉由于纖維素含量較高，其煙氣會產生強烈的刺激性、嗆咳、澀口、枯焦氣［1］，因此，測定煙草中的纖維素，對于評價煙葉品質具有重要意義。傳統的測定方法主要采用稀酸、稀堿與樣品依次共煮后用有機溶劑處理，再經烘干后稱重［2-4］，這種方法操作繁瑣，費力耗時，且由于操作人員的技術差異會帶來很大的誤差。近年來，近紅外（NIR）光譜分析技術也被用于煙草中纖維素含量的測定［5］，但是因其數據模型的建立需要大量的數據支撐，其應用受到一定的局限。根據纖維素水解后生成葡萄糖的性質，采用酶解纖維素得到葡萄糖［6-7］，然后利用流動分析儀檢測還原糖含量［8］，可計算得到纖維素的含量，而且酶水解具有專一性和高效性［9-10］，流動分析儀在行業內的應用也比較廣泛，因此，建立測定煙草中纖維素含量的流動分析法，可為評價煙葉的品質提供技術支持。
1材料與方法
1.1材料、試劑與儀器2009年初烤煙葉樣品17個（川渝中煙工業公司提供）。冰醋酸、檸檬酸、檸檬酸三鈉（AR，重慶川東化工有限公司化學試劑廠）；葡萄糖、氯化鈣、氫氧化鈉（AR，重慶北碚化學試劑廠）；纖維素酶（BR，活力>15000DU，國藥集團化學試劑有限公司）；聚乙氧基月桂醚、對羥基苯甲酸酰肼（AR，荷蘭Skalar公司）。SkalarSan++流動分析儀（荷蘭Skalar公司）；AX504分析天平（感量：0.0001g，瑞士MettlerToledo公司）；恒溫搖床（中國科學院武漢科學儀器廠）；循環水真空泵（鞏義市英峪予華儀器廠）；G3玻璃砂心漏斗（長春市玻璃儀器廠）。
1.2樣品處理和分析準確稱取0.25g40目煙粉，置于100mL錐形瓶中，加入25mL5%醋酸溶液，搖床振蕩萃取30min，萃取出樣品本身含有的水溶性糖［8］，用G3漏斗過濾，濾渣用蒸餾水沖洗3次，每次50mL；將濾渣轉移到100mL錐形瓶中，加入60mL含有0.25g纖維素酶的檸檬酸/檸檬酸三鈉緩沖溶液（pH4.7）［7，11］，然后放入37℃恒溫搖床水解24h；水解結束后將樣品冷卻至室溫，過濾，用蒸餾水將濾液定容至100mL，利用流動分析儀測定樣品液中的葡萄糖，測得葡萄糖含量乘以轉換系數0.9（由纖維素水解方程式計算得到）即得纖維素含量。
2結果與討論
2.1酶解條件的選擇
2.1.1緩沖溶液用量對纖維素水解的影響準確稱取0.25g煙粉樣品5份，按照1.2的方法除水溶性糖，然后分別加入固定纖維素酶量（0.25g纖維素酶）的緩沖溶液40，50，60，70，80mL，在固定溫度（37℃）條件下水解24h，纖維素含量的測定結果如圖1所示。由圖1可知，隨著緩沖液體積的增大，纖維素測定量也逐漸升高，當緩沖溶液用量為60mL時，達到最高值，說明此時纖維素水解完全；當緩沖溶液用量大于60mL后，纖維素測定量逐漸降低，這可能是由于緩沖溶液用量過大，導致了酶濃度降低，酶不能與底物充分接觸，從而使酶解效果變差。因此，選擇緩沖液用量為60mL。
2.1.2酶用量對纖維素水解的影響在緩沖液用量為60mL、其他條件不變的情況下，分別考察酶用量為0.05，0.10，0.15，0.20和0.25g時的酶解效果，結果如圖2所示。由圖2可知，當酶用量為0.20g時，纖維素測定量最高，考慮到生物酶較容易部分失活，為保證纖維素水解完全，所以確定酶用量為0.25g。
2.1.3溫度對纖維素水解的影響在緩沖液用量為60mL和酶用量為0.25g的情況下，分別考察纖維素在30，35，40，45和50℃下的水解效果，結果如圖3所示。由圖3可知，當溫度<35℃時，纖維素水解不完全，測定量較低；當溫度>40℃時，纖維素測定量降低，這可能是因為溫度過高導致酶失活，使纖維素水解不完全；較適宜的水解溫度為35~40℃，實驗選擇37℃。
2.1.4時間對纖維素水解的影響在緩沖液用量為60mL、酶用量為0.25g和水解溫度為37℃的情況下，分別水解20，22，24，26和28h，結果（圖4）表明，24h后，纖維素水解完全，所以確定水解時間為24h。
2.2工作曲線與檢測限準確稱取2.2009g葡萄糖，用蒸餾水溶解并定容至100mL，搖勻，得標準儲備液。移取1，2，3，4，5mL標準儲備液，分別用蒸餾水稀釋并定容至100mL，搖勻，即得葡萄糖系列標準溶液，濃度分別為0.2，0.4，0.6，0.8和1.0mg/mL，相當于纖維素0.18，0.36，0.54，0.72，0.90mg/mL。用流動分析儀測定標準溶液中的葡萄糖含量，并對電信號響應值Y（峰高，DU），與其濃度X（纖維素含量，mg/mL）進行線性回歸分析，得其工作曲線回歸方程為：Y=15893.3X+2117.5，r=0.9998。可以看出，纖維素在0.18~0.90mg/mL濃度范圍內，工作曲線線性良好，適合于定量分析。通過測定空白試樣，測得纖維素的檢測限［12］為0.11mg/mL。
2.3精密度和回收率采用本方法對煙草樣品的纖維素分別測定6次，測定量分別為125.8，120.7，126.9，127.3，126.2和125.1mg/g，相對標準偏差（RSD）為2.40%，說明本方法的重復性較好。在脫糖煙草樣品中加入葡萄糖，測定其回收率，結果如表1所示。纖維素的回收率為96.7%~103.8%，說明本方法的準確性較高。
2.4與經典方法［3］比較分別用本方法和經典方法測定16個煙草樣品的纖維素含量，結果如表2所示。通過對兩組數據進行配對樣品t檢驗，發現二者無顯著性差異，說明該方法適合于煙草中纖維素含量的檢測。
關鍵詞 米曲霉；固態發酵；纖維素酶活
中圖分類號 S147.4 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2016）08-0197-02
Abstract The culture conditions affected the production of cellulose enzyme by Aspergillus oryzae，such as carbon source，nitrogen source，initial pH，water content，culture temperature，culture time，etc.The results showed that when the carbon source was bran，nitrogen source was powder of bean cake，initial pH value was 6.5，moisture content was 50%，culture temperature was 30 ℃，training time was 60 h，the cellulose enzyme activity produced by Aspergillus oryzae was the highest.
Key words Aspergillus oryzae；solid-state fermentation；cellulose enzyme activity
我國農作物秸稈的利用率普遍很低，多數作物秸稈都作焚燒處理，對環境的污染很大。作物秸稈中含有豐富的有機質、氮、磷、鉀等作物生長所需的營養元素，如果能得到合理的利用，將會為人類帶來巨大的收益。作物秸稈的處理方式有物理、化學、生物方法，其中生物降解具有污染少、能耗低等優點[1]。作物秸稈中含有豐富的纖維素，纖維素在纖維素酶的作用下可以水解生成單糖被作物和微生物利用，但纖維素不易被降解，幾十年來，人們對于纖維素的預處理及酶水解過程進行了大量研究，其中纖維素酶的使用大大提高了纖維素的降解率[2]。
米曲霉屬半知菌亞門絲孢綱絲孢目從梗孢科曲霉屬真菌中的一個常見種。米曲霉（Aspergillus oryzae）是纖維素酶的主要生產菌種之一。工業用米曲霉菌種所產的酶系較多、酶系組成較復雜[3]，國內對該菌株的相關研究并不多，對其酶系在工業發酵過程中受到的影響因素及其作用機理并不十分了解，從而導致在工業生產過程中不能夠十分精確地控制米曲霉的產酶過程，限制了這一傳統的食用菌株在工業應用領域的進一步拓展[4]。本試驗對米曲霉M1102產纖維素酶在固體發酵過程中所受的影響及活性變化進行了研究，以期為米曲霉產纖維素酶的工業化生產提供相關的理論依據。
1 材料與方法
1.1 供試材料
1.1.1 菌種。米曲霉菌株M1102，來自中國菌種保藏中心。
1.1.2 培養基與主要試劑。斜面培養基：土豆培養基（PDA）；液體種子培養基：豆餅粉5 g/L，蛋白胨5 g/L，蔗糖10 g/L，MgSO4 0.3 g/L，K2HPO4 0.3 g/L，調節pH值至7.0；營養鹽溶液：NaCl 2 g/L、KH2PO4 1.5 g/L、CaCO3 0.5 g/L、MgSO4 0.5 g/L，調節 pH值至7.0；固體培養基：木質纖維素培養基；主要試劑：麩皮、稻殼粉、玉米粉、玉米芯粉、葡萄糖、蔗糖、豆餅粉、干酪素、蛋白胨、硫酸銨、尿素。
1.1.3 儀器設備。酒精燈、接種環、超凈工作臺、高壓蒸汽滅菌鍋、pH測定儀、紫外分光光度計、水浴鍋、恒溫培養箱、電子天平、控溫搖床。
1.2 試驗方法
1.2.1 培養方法。一是米曲霉種子液制備：將米曲霉接種于PDA斜面上進行活化，用接種環挑取一環接種于250 mL三角瓶的種子液中，裝液量為50 mL，30 ℃，180 r/min，培養24 h。二是固體培養：在250 mL三角瓶中加入10 g風干后過篩的木質纖維原料和5 mL營養鹽溶液，拌勻，121 ℃滅菌30 min，冷卻后將種子液以3%的接種量接種于固體培養基中，32 ℃下培養60 h，測定其產纖維素酶活[5]。粗酶液的制備：每1g固態培養物加入磷酸緩沖溶液5.0 mL（pH值 7.2），室溫下浸提1 h，10 000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液。
1.2.2 培養條件的優化。一是碳源對纖維素酶活的影響：分別用3%含量的麩皮、稻殼粉、玉米粉、玉米芯粉、葡萄糖、蔗糖作為培養基的碳源，其他成分同初始培養基，培養結束后測定其纖維素酶含量[6]。二是氮源對纖維素酶活的影響：分別以2%的豆餅粉、干酪素、蛋白胨、硫酸銨、尿素作為培養基的氮源，其他成分同初始培養基，培養結束后測定培養基中纖維素酶含量[6]。三是發酵條件優化：采用優化后的最佳發酵培養基，在固定其他發酵條件的基礎上，逐一對發酵培養的初始pH值、培養基含水量、培養時間、發酵溫度等培養條件進行優化。
1.2.3 纖維素酶活的測定方法。采用GB-羧甲基纖維素法（CMC法）。
2 結果與分析
2.1 培養基碳源對纖維素酶活力的影響
酶誘導物和酶蛋白質前體同時對纖維素酶的合成有調控作用，酶誘導物一般為可利用的碳源，纖維素作為酶誘導物對纖維素酶的產生有重要作用。從圖1可以看出，在培養基其他基礎營養成分不變的前提下，改變碳源含量后，米曲霉產纖維素酶活發生顯著變化，其中碳源為麩皮時纖維素酶活最高；稻殼粉和玉米芯粉次之，為最高酶活的72%和68%；玉米粉和蔗糖為最高酶活的60%和37%；碳源為葡萄糖時纖維素酶活最低，僅為最高酶活的30%。當碳源中纖維素含量豐富時，米曲霉產纖維素酶活力高，這是由于纖維素作為酶誘導物能刺激纖維素酶的產生，將其分解為可利用的單糖，而葡萄糖和蔗糖作為碳源時，米曲霉能直接利用其作為碳源，所以抑制了纖維素酶的產生。
2.2 培養基氮源對纖維素酶活力影響
氮源是酶蛋白質前體的主要來源，因此氮源的類型和性質同樣會影響纖維素酶的合成和分泌。選擇不同氮源作為單一氮源進行發酵試驗，來考察其對米曲霉產酶的影響。
從圖2可以看出，在試驗選用的5種有機和無機氮源中，以豆餅粉作為氮源時米曲霉所產纖維素酶活性最高；干酪素和蛋白胨次之，纖維素酶活是豆餅粉作為單一氮源時活性的96%和81%；當分別以硫酸銨和尿素為單一氮源時，米曲霉所產纖維素酶活性僅為最高酶活性的70%和68%。由此表明，有機氮源對纖維素酶活的影響大于無機氮源，這可能與有機氮源中營養成分含量多元化有關。
2.3 培養基初始pH值對纖維素酶活力的影響
微生物在生長繁殖和代謝過程中，由于營養物質被分解利用和代謝產物的形成與積累，導致培養基pH值發生變化，而培養基初始pH值不僅影響微生物的生長繁殖，且對其產酶情況有顯著的影響。在優化培養基碳氮源基礎上，調節初始pH值為4.0～9.0來考察米曲霉產酶活性的變化。從圖3 可以看出，米曲霉產生纖維素酶的最佳初始pH 值為6.0～7.5，當培養基初始pH值為5.5，米曲霉仍能產生相對于最高活性 72%的纖維素酶；而當培養基初始pH值調至8.0 時，米曲霉產生纖維素酶活性則迅速下降至最高酶活性的34%。試驗表明米曲霉產纖維素酶的pH值適應范圍較寬，但過酸或過堿的環境不利于纖維素酶的生產。這可能是由于過酸或過堿的環境不利于米曲霉生長或破壞了纖維素酶活力。
2.4 培養基含水量對纖維素酶活力的影響
水分是微生物生長代謝的重要物質，在固體發酵中，水分對微生物活性有重要影響。從圖4可以看出，隨著培養基中含水量的增加，米曲霉產纖維素酶活呈現先增高后降低的趨勢，當培養基含水量為50%時，纖維素酶活最高。所以含水量過高或過低都會抑制米曲霉生長，這可能是由于低水分使米曲霉培養基中的營養物質溶解性降低，抑制了米曲霉生長；當水分含量過高時，培養基過于黏稠，破壞了培養基的多孔結構，降低了其透氣性，而米曲霉是耗氧微生物，低氧環境不利于其生長。
2.5 培養溫度對纖維素酶活力的影響
微生物最適宜的溫度范圍一般為16～30 ℃，最高溫度在37～43 ℃，溫度過高或過低均不利于米曲霉生長。從圖5可以看出，在30～35 ℃時，纖維素酶活最高，溫度過低或過高都會降低纖維素酶活。這是由于，當溫度過低時，米曲霉生
長緩慢導致產生纖維素酶少，而且低溫環境會降低酶活力；當溫度過高時，米曲霉會由于高溫而出現老化現象，抑制了纖維素酶產生，并且高溫容易使纖維素酶失活。
2.6 培養時間對纖維素酶活力的影響
微生物處于不同的生長期時，其相應的生長代謝機理也不同。從圖6可以看出，隨著培養時間的延長，米曲霉產纖維素酶活呈先升高后降低的趨勢。當培養至60 h時，纖維素
酶活最高。這是由于培養初期米曲霉處于繁殖階段，產生孢子數量有限，故分泌的纖維素酶少；而在培養后期，由于米曲霉出現老化，導致纖維素酶分泌量減少。
3 結論
本試驗研究了米曲霉菌株M1102在不同固體發酵條件下產纖維素酶的變化。結果表明：當碳源為麩皮，氮源為豆餅粉，初始pH值為6.5，含水量為50%，培養溫度為30 ℃，培養時間為60 h時，米曲霉產纖維素酶活力最高。為了深入了解米曲霉固體發酵產纖維素酶的影響因素，還需要對纖維素酶的生產條件和作用機理做更深一步的研究。
4 參考文獻
[1] 袁喜慶.秸稈生物降解技術的效應[J].現代農業科技，2011（4）：261.
[2] 湯鳴強，鄭 挺，曾小芳，等.釀造醬油米曲霉產中性蛋白酶提取與酶學性質研究[J].中國調味品，2008（348）：38-40.
[3] 高曉梅，李楊，劉曉輝，等.固態發酵法生產大豆多肽的初步研究[J].山東農業科學，2014（7）：78-81.
[4] 孫春華，燕磊，常維山，等.不同碳源和氮源對米曲霉產酶影響的研究[J].西南農業學報，2007，20（5）：986-990.
1.1葡萄糖內切酶
該酶作用于纖維素分子內的非結晶區，隨機水解β-1，4-糖甘鍵，截短長鏈纖維素分子，產生許多帶有非還原性末端的小分子纖維素，但不能單獨作用于結晶的纖維素。同時它也能水解小分子的纖維寡糖。
1.2葡萄糖外切酶
這類酶作用于纖維素分子的末端，依次切下纖維素分子中的纖維二糖，可作用于纖維素分子內的結晶區、無定形區和羧甲基纖維素。
1.3β-葡萄糖苷酶
也稱纖維二糖酶，是一種可將纖維二糖、纖維三糖和纖維六糖等水解為葡萄糖的非專一性酶；在水解過程中低聚糖對外切酶和內切酶的產物產生抑制作用，這種酶的存在可以顯著降低抑制作用，提高水解效率。
2食品工業纖維素酶的來源
纖維素酶的來源非常廣泛，昆蟲、動物體、微生物（細菌、放線菌、真菌、酵母）等都能產生纖維素酶。由于動物體和放線菌的纖維素酶產量極低，所以很少研究。細菌所產生的酶是胞內酶，或者吸附在菌壁上，很少能分泌到細胞外，提取純化的難度大。而且產量也不高，主要是中性和堿性的葡萄糖內切酶。因其多數對結晶纖維素沒有活性，所以主要用于棉織品水洗整理工藝及洗滌劑工業中，在食品工業中應用也較少[4]。目前，報道較多的是真菌，其產生的纖維素酶通常是胞外酶，酶一般被分泌到培養基中，用過濾和離心等方法就可較容易地得到無細胞酶制品。絲狀真菌產生的纖維素酶一般在酸性或中性偏酸性條件下水解纖維素底物，其中木霉纖維素酶產量高、酶系全，故而被廣泛應用，尤其是里氏木霉、綠色木霉的研究較多。
2.1產纖維素酶里氏木霉的研究進展
由于里氏木霉產纖維素酶量高、穩定性好、適應性強，便于生產和管理，因此具有突出的研究和利用價值。目前，在菌株選育上普遍采用人工誘變和基因工程改造兩種方案獲得高效分解纖維素的菌株。誘變的方法一般是傳統的物理誘變(紫外線)和化學誘變(亞硝基胍)。IKEM等以里氏木霉ATCC66589為出發菌株，經紫外線誘變，獲得兩株突變菌株M2-1和M3-1。其濾紙酶活分別達到257U和281U。張素敏等利用紫外線誘變里氏木霉T306，得到突變菌株的CMCA活力達到64.2U/mL[5]。在化學誘變劑中，烷化劑可與巰基、氨基和羧基等直接反應，故更易誘發基因突變。DURANDH等用亞硝基胍誘變里氏木霉QM9414，得到一株穩定性較好的突變菌株CL847，FPA酶活最高達到5.2U/mL，較出發菌株提高了4倍[6]。也有紫外線與亞硝酸鈉、亞硝基胍等化學試劑復合誘變的研究，取得了較好的效果。這些研究對里氏木霉高產纖維素酶菌株的選育及其工業化應用具有顯著意義。基因工程改造可以從不同產纖維素酶菌株中篩選出比活力高、酶學性質穩定的基因重組在一起并高效表達，具有定向性，是選育出高產纖維素酶菌株的有效途徑。目前已成功在里氏木霉中克隆表達的基因有纖維二糖酶基因、celEn、pBGL1、af211、Neg[7]。
2.2產纖維素酶綠色木霉的研究進展
綠色木霉酶活較大，是目前公認較好的纖維素酶生產菌。目前的研究主要集中于綠色木霉產纖維素酶生產工藝的研究。陳莉等采用固態發酵方法研究了不同條件對其產纖維素酶活的影響。得出綠色木霉固態產酶發酵的最優條件是培養溫度30℃，培養時間5d，接種量5%，含水量250%。在實際發酵過程中，不同的酶組分達到最大酶活的時間也有不同，例如FPA酶活在發酵2d后達到最高值,Cx酶活在發酵3d后達到最高值。以蛋白胨為唯一氮源時，纖維素酶活力最高，以尿素為唯一氮源時，纖維素酶活力最低。綠色木霉分泌的酶系偏酸性,發酵液初始pH值為4.5時，FPA酶活和Cx酶活都出現最高值。因此在實際應用中也可以根據需要來調整不同酶組分的含量，以及合適的氮源，適宜的pH值等[8-9]。黃發等人對綠色木霉產β-葡聚糖酶的工藝條件研究也得出了類似的結果[10]。
3纖維素酶在食品工業的應用
3.1在果蔬加工中的應用
在果蔬的加工過程中,為了使得植物組織快速軟化和膨潤,常常采用加熱蒸煮或酸堿處理等方法。這樣一來就使得蔬菜、果實的香味和維生素等損失很大。通過使用纖維素酶來進行蔬菜的軟化可以避免這一缺點。除此以外,通過采用纖維素酶對蔬菜和果實進行分解,可以使加工的果醬口感增加;還可以用纖維素酶來分解蘑菇,制造一種很好的調味料;在糖果品加工工藝中也可以采用纖維素酶來縮短砂糖進入果實當中的時間，以更快地達到浸透效果[11]。朱莉莉等研究了羊棲菜汁浸提工藝條件,通過研究最適范圍各個單因素發現，在復合酶酶解提取羊棲菜汁的最佳浸提方案中,添加纖維素酶與果膠酶配比3:2可以大大提高浸提率[12]。
3.2在大豆加工中的應用
纖維素酶用于對大豆的處理,可以促使其大豆快速脫皮,與此同時,由于纖維素酶可以破壞其細胞壁,從而使得包含在細胞中的油脂和蛋白質完全的分離開來,導致大豆和豆餅中提取優質的水溶性蛋白質和油脂的得率明顯增加，不但降低了生產成本，而且還顯著地縮短了生產時間,更是提高了生產產品的品質。
3.3在茶葉加工中的應用
隨著茶飲料工業的快速發展，茶水飲料生產的方式漸漸地由最初飲料廠的全程生產方式向由原料廠商只是生產茶濃縮汁這一方式過度,這就使得我國的茶葉濃縮汁、速溶茶等生產發展快速。隨著近現代生物技術的快速發展,外源的生物酶在茶葉提取、加工中得到充分的應用。酶法提取的原理為利用其纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶等水解酶分解茶葉的細胞壁,使得細胞結構破壞,導致茶葉中的有效成分快速擴散與浸出,有利于提高固形物的溶出和浸提率。在茶葉提取生產的過程中，纖維素酶可以提升其可溶性糖類的含量以及水浸出物得率，并且還可以促進氨基酸、茶多酚、咖啡堿等物質的溶出，有利于釋放出芳香性物質，有顯著的增香效果[13]。
4纖維素酶在釀造、發酵工業中的應用
4.1在醬油、食醋釀造中的應用
醬油釀造主要是利用蛋白酶及淀粉酶等酶類對原料進行相應的酶解，而在該過程中如果添加使用纖維素酶，就可以使大豆等原料的細胞膜軟化、膨脹等細胞破壞作用更加明顯，使得包藏在細胞中的碳水化合物、蛋白質等順利釋放，從而縮短釀造時間，并且可以顯著提高產率及品質，使醬油中的還原糖和色度明顯增加，風味得到明顯改善[14]。在食醋釀造過程中，通過纖維素酶與糖化酶混合使用，可以顯著提升原料利用率及出品率。郝建新等以綠原酸為評價指標，進行了添加纖維素酶發酵醋的工藝研究。結果發現，利用纖維素酶等酶后，得到的發酵醋色澤澄清，并具備醋特有的香氣，口感也很柔和，而且具有比較好的體外抗氧化的效果[15]。
4.2在啤酒加工過程中的應用
把纖維素酶利用在啤酒工業的麥芽生產當中，可以增加麥粒等的溶解性，減少糖化液中R-葡萄糖的含量，明顯提高過濾性能。張麟等對啤酒糟進行了研究，發現預處理過程中添加纖維素酶水解比只用機械處理得到的可溶性糖含量有明顯提高[16]。
4.3在飲料中的應用
馮丹等用新鮮的豆渣為原材料，利用纖維素酶對原料進行酶解，可以獲得其水溶性膳食纖維等提取液，添加輔料可混合調配成一類酸甜適口，體系均一，滋味純正，并且具有一定保健功能的膳食纖維類飲料。且研究發現其具有較好的穩定性[17]。
4.4在酒精發酵中的應用
通過在原料中添加纖維素酶來釀酒，可以增加出酒量，節約糧食20%左右，而且釀出的酒酒味醇香，雜醇油含量低。尤其是白酒當中，添加纖維素酶以后，可以同時將淀粉和纖維素轉化為可發酵性的糖，再經過酵母分解而全部轉化為酒精，提高出酒率且酒的品質純正。在實際生產中應用纖維素酶，不僅可以提高發酵產率，而且能夠顯著縮短發酵時間[1]。此外，利用纖維素酶水解木質素生產乙醇用于化工、能源等方面對于目前的全球資源短缺現狀的緩解也具有重要意義。
5纖維素酶在纖維廢渣回收利用方面的應用
利用其纖維素酶或微生物,把農副產品、城市廢料中的纖維素進一步轉化成為酒精、葡萄糖和單細胞蛋白質等產品,這對于開辟食品工業的原材料來源、提供新型能源和變廢為寶等方面具有十分重要的價值和意義。例如纖維素酶應用于動物飼料的添加劑、紡織、造紙、醫藥保健、石油開采、新型能源、環保等領域都具有很大的潛力。
6展望
關鍵詞：纖維素分解菌；發酵條件；纖維素酶；酶活力
中圖分類號：TQ920．1 文獻標識碼：A 文章編號：0439－8114（2012）06－1232-02
Research on the Optimum Fermentation Conditions of High-Yield Cellulolytic
Enzymes Strain ZJW-6
TANG Rui
（Department of Biology and Chemistry， Xingtai University， Xingtai 054001， Hebei， China）
Abstract： The optimum fermentation conditions of high－yield cellulolytic enzymes strain ZJW－6 were studied in this paper． The strain was cultured under different liquid fermentation conditions and enzymes activity of bacteria suspension was determined using DNS method． The results showed that the optimum fermentation conditions of ZJW－6 was as follows： peptone and （NH4）2SO4 as nitrogen source， shaking for 48h at 30℃ and pH 6．
Key words： cellulose－decomposing microorganisms； fermentation conditions； cellulose； enzyme activity
纖維素酶是指能降解纖維素生成纖維素二糖和葡萄糖等小分子物質的一組酶的總稱。隨著人們對纖維素酶研究的深入，纖維素酶在食品、飼料、環境保護、能源和資源開發等各個領域中發揮著越來越大的作用，因而引起了全世界的關注，其研究也取得了很大進展。但是纖維素酶的生產仍然存在著酶活力低、生產周期長等問題，大大限制了其大規模工業化生產［1］。對高產纖維素酶菌株ZJW－6采用單因素試驗法進行不同條件下的液體發酵培養，使用DNS法對發酵后的菌懸液進行酶活力測定從而獲得最優發酵條件，旨在為其工業化發酵生產打下基礎。
1 材料與方法
1．1 材料
1．1．1 菌種 菌種為邢臺學院生物化學系微生物實驗室篩選并保存的產纖維素酶菌株。
1．1．2 培養基 液體培養基：羧甲基纖維素鈉10.0 g／L，蛋白胨10.0 g／L，磷酸二氫鉀1.0 g／L，硫酸銨0．2 g／L，氯化鈉10.0 g／L，去離子水1 000 mL，pH 7.0［2］。
1．2 方法
1．2．1 待測酶液的制備 將各種不同培養條件下的單因素限制性的液體發酵菌懸液倒入離心管中，3 000 r／min離心15 min，取上清液作為待測粗酶液。
1．2．2 纖維素酶活力的測定 參照文獻［3］和文獻［4］使用DNS法測定酶活力。將在40 ℃、pH 4．6條件下，1 min分解羧甲基纖維素鈉產生相當于1 μg同葡萄糖的還原糖量所需的酶量，規定為一個酶活力單位。
1．2．3 發酵條件優化研究［5，6］ 分別取ZJW－6的菌懸液1 mL加入到含有等量培養基的試管中，在不同時間、不同培養方式、不同培養溫度、不同初始pH的條件下培養，測其酶活力。
2 結果與分析
2．1 不同培養時間對纖維素酶活力的影響
菌株ZJW－6不同培養時間所產纖維素酶的活力見圖1。從圖1可以看出，在培養48 h以前酶活力顯著提高，48~72 h酶活力顯著下降，在培養72 h以后酶活力雖有上升，但增幅較小，可見培養48 h為其最適發酵培養時間。
2．2 不同培養方式對纖維素酶活力的影響
菌株ZJW－6不同培養方式所產纖維素酶的活力測定結果見表1。從表1可以看出，靜置培養4 d酶活力為118 U／mL，振蕩培養4 d酶活力達138 U／mL，明顯高于靜置培養。可見振蕩條件下培養對菌株ZJW－6產纖維素酶有利。
2．3 不同培養溫度對纖維素酶活力的影響
菌株ZJW－6不同培養溫度所產纖維素酶的活力測定結果見圖2。從圖2可以看出，在26~28 ℃條件下培養，酶活力有所提高，當達到30 ℃時酶活力明顯提高，到了32 ℃時酶活力又顯著降低，可見菌株ZJW－6產酶的最適培養溫度為30 ℃。
2．4 不同培養基初始pH對纖維素酶活力的影響
菌株ZJW－6在不同培養基初始pH條件下所產纖維素酶的活力測定結果見圖3。從圖3可以看出，在培養基初始pH由5變為6時酶活力顯著提高，在培養基初始pH大于6以后酶活力又逐漸下降，表明培養基初始pH 6是其最適產酶pH。
3 小結與討論
綜合試驗中最適培養基和最優發酵條件的結果，得出菌株ZJW－6產纖維素酶的最優發酵條件為在蛋白胨+（NH4）2SO4的氮源培養基上，30 ℃、培養基初始pH 6、振蕩培養48 h。
試驗充分說明了產纖維素酶菌株在不同的培養條件下產纖維素酶的能力明顯不同，對其最優發酵條件進行研究很有必要。國內外對于產纖維素酶菌株發酵條件優化的研究比較少，遲乃玉等［7］對纖維素酶高產菌株97－B最優發酵條件進行了研究，陳亮等［8］對低溫纖維素酶菌株CNY086進行了選育及發酵培養基的優化研究，徐長安等［4］篩選得到一株海洋芽孢桿菌B09并對其進行了發酵條件優化研究。因為產纖維素酶菌株的產酶能力受多種因素的影響，因此不同的菌株，不同的培養條件，不同的培養基配方都還有很大的研究空間，需要進一步研究。
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[關鍵詞] 青蒿素；纖維素酶；提取
[中圖分類號] R965.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2013）08（c）-0014-03
青蒿素（artemisinin，C15H22O5）是治療瘧疾的特效藥，具有速效、高效和低毒等抗瘧性能[1]。目前，青蒿素主要從黃花蒿（Artemisia annua L.）中提取[2]。近年來，用于天然產物提取的新技術如微波技術、酶技術等迅速涌現，并取得顯著的成效[3]。酶技術具有反應效率高、條件溫和、專一性強和有效成分破壞少等優點[4]，受到廣泛關注。
我國是黃花蒿的主產國，將酶技術應用于青蒿素的提取過程，對提高提取效率、充分利用資源有重要意義。本研究對纖維素酶輔助提取青蒿素的條件進行研究，分析各因素對提取率的影響，并采用正交實驗的方法對酶輔助提取工藝進行優化，為纖維素酶在青蒿素提取工藝中的應用提供參考。
1材料與方法
1.1 材料
青蒿藥材購于廣州市清平中藥材市場（生產批號120711），經鑒定為菊科植物黃花蒿的干燥地上部分，藥材經粉碎后過40目篩備用。纖維素酶Cellulase T4（來源于綠色木霉Trichoderma viride，生產批號20120922）購自天野酶制劑（上海）有限公司。青蒿素標準品（生產批號A2118）購自百靈威科技有限公司，無水乙醇、95%乙醇、氫氧化鈉、乙酸、乙酸鈉等試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑公司。
1.2 儀器設備
FW135型中藥粉碎機，SHA-2型恒溫水浴振蕩器，HH-4型恒溫水浴鍋，752型紫外可見分光光度計，SHZ-D型循環水真空泵。
1.3 方法
1.3.1纖維素酶輔助提取青蒿素的方法
稱取1 g粉碎后的青蒿樣品置于100 ml具塞三角瓶中，加入50 ml乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，先常溫下浸泡10 min，再加入一定量的纖維素酶，然后在一定溫度下水浴振蕩進行酶反應。酶反應結束后，抽濾，將濾餅置于100 ml具塞三角瓶中，加入50 ml 無水乙醇，在45℃下水浴振蕩1 h，抽濾，取濾液測定青蒿素含量。
1.3.2青蒿素含量的測定方法
青蒿素僅在紫外區203 nm處有較弱的末端吸收，但與堿反應后，生成一化合物Q292，該物質在292 nm處有最大吸收，可用紫外分光光度法檢測[5]。取樣品溶液0.5 ml加入95%乙醇4.5 ml，再加入0.2% NaOH 20 ml定容至25 ml，50℃水浴加熱30 min，取出快速冷卻，在292 nm處測定吸光值，每組測定3個平行樣品，取平均值。根據標準曲線換算出青蒿素含量。
2結果
2.1青蒿素含量測定的標準曲線
精確稱取青蒿素標準樣品10 mg，溶于95%的乙醇溶液，定容至100 ml容量瓶中，配制成0.1 g/L的標準溶液。分別取標準溶液0、1、2、3、4、5 ml，加95%的乙醇溶液至5 ml，再加入0.2%NaOH 20 ml定容至25 ml，50℃水浴加熱30 min，取出快速冷卻，在292 nm處測定吸光值，每組取3個平行樣品，取平均值。以青蒿素樣品濃度x（g/L）為橫坐標，292 nm吸光值y為縱坐標作圖，結果見圖1。在292 nm下，青蒿素濃度在0～1 g/L的范圍內，與吸光值呈良好的線性關系，表明測定方法準確可靠。
2.2 不同酶反應時間對青蒿素提取的影響
按照2.1中的方法，在100 ml具塞三角瓶中加入0.1 g纖維素酶，在45℃下水浴振蕩反應，酶反應緩沖液pH值為4.5，反應時間分別為1、2、3、4、5 h，測定酶輔助提取后樣品青蒿素含量。以不加入纖維素酶進行提取的樣品中青蒿素含量為100%進行對照，結果見圖2。隨著時間的延長，青蒿素的提取率逐漸增加，在3 h左右達到最大值，再延長提取酶反應的時間，青蒿素的提取率基本不變。
2.3 不同加酶量對青蒿素提取的影響
按照2.1中的方法，在100 ml具塞三角瓶中分別加入0.1、0.2、0.3、0.4g纖維素酶，在45℃下水浴振蕩反應，酶反應緩沖液pH值為4.5，反應時間1 h，測定酶輔助提取后樣品青蒿素含量。以不加入纖維素酶進行提取的樣品中青蒿素含量為100%進行對照，結果見圖3。隨著酶添加量的增加，青蒿素的提取率逐漸增加，當加入0.3 g的纖維素酶時，達到最大值，再增加酶用量，青蒿素的提取率基本不變。
2.4 不同酶反應溫度對青蒿素提取的影響
按照2.1中的方法，在100 ml具塞三角瓶中加入0.1 g纖維素酶，分別在40、45、50、55℃下水浴振蕩反應，酶反應緩沖液pH值為4.5，反應時間為1 h，測定酶輔助提取后樣品青蒿素含量。以不加入纖維素酶進行提取的樣品中青蒿素含量為100%進行對照，結果見圖4。隨著溫度的增加，青蒿素的提取率呈現先增加后減小的趨勢，在酶反應溫度為45℃時達到最大值。
2.5不同酶反應pH值對青蒿素提取的影響
按照2.1中的方法，在100 ml具塞三角瓶中加入0.1 g纖維素酶，在45℃下水浴振蕩反應，酶反應緩沖液pH值分別為4.0、4.5、5.0和5.5，反應時間為1 h，測定酶輔助提取后樣品青蒿素含量。以不加入纖維素酶進行提取的樣品中青蒿素含量為100%進行對照，結果如圖5。酶反應的pH值對青蒿素的提取率基本無影響，在pH值為4.5時，青蒿素提取率達到最大值。
2.6 纖維素酶輔助提取青蒿素工藝條件的優化
在纖維素酶輔助提取青蒿素的過程中，酶反應時間、酶的添加量和酶反應溫度對青蒿素的提取影響較大，而酶反應過程中緩沖液的pH值對青蒿素的提取基本無影響。因此，選取酶反應時間、酶添加量和反應溫度作為主要影響條件，利用試驗設計軟件Design expert 7.5作三因素兩水平正交實驗L4（23），正交實驗水平見表1。
按照軟件設計的正交實驗表中各因素水平，開展實驗，然后對試驗結果進行分析。正交實驗表和結果分析見表2。對實驗結果進行極差分析表明：酶輔助提取反應各條件對提取率的影響試驗中，酶反應時間（A）的最優值為水平1，酶添加量（B）的最優值為水平2，溫度（C）的最優值為水平2，實驗中各因素對輔助提取反應的影響順序為：酶反應時間>酶添加量>溫度。
利用Design expert7.5對實驗結果進行方差分析，方差分析結果見表3。方差分析結果表明：在P
3討論
黃花蒿為菊科艾屬一年生草本植物，在我國各地均有分布[6]。青蒿素是從黃花蒿干燥地上部分分離提取得到的一種新型化合物，其具有含過氧基團的倍半萜內酯結構，與已知抗瘧藥物化學結構完全不同[7]，被世界衛生組織稱為“唯一有效的瘧疾治療藥物”。由于青蒿素的化學合成尚未顯示出商業可行性，目前商用的青蒿素主要通過植物提取[8]。工業化提取青蒿素中應用范圍最廣的是有機溶劑提取法，但存在提取效率低、提取率不高、溶劑消耗大和安全隱患等問題[3]。
天然產物的有效成分主要存在細胞質中，細胞壁的阻礙影響了提取率。纖維素酶是最常見的破壁酶，它可作用于天然產物纖維素為主的細胞壁，破壞細胞壁的致密結構，增加細胞內活性成分的溶出量，提高提取率[9]。纖維素酶Cellulase T4來源于綠色木霉，本實驗結果表明，纖維素酶能夠有效降解青蒿植物的細胞壁，增加青蒿素的提取率。不同的纖維素酶有不同的最佳反應條件，常見的影響因素有溫度、pH、酶的用量、激活劑和抑制劑等[10]。本文單因素及正交實驗結果表明Cellulase T4水解青蒿植物細胞壁的最佳條件為酶反應時間為2 h，酶添加量為0.30 g，反應溫度為45 ℃，酶反應pH值4.5。在最優條件下，纖維素酶輔助提取青蒿素較未使用酶輔助的提取方法，提取率提高了1.96倍。本實驗為纖維素酶在青蒿素提取方面的應用提供了理論指導，為酶技術在中藥制藥方面的研究和應用開拓了更為廣闊的空間。
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關鍵詞 稻草秸稈；固態發酵；纖維素酶
中圖分類號 TQ929 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2011）12-0049-03
纖維素是可再生能源物質，總產量占地球植物干重的1/3～1/2，植物纖維素因其含量豐富及巨大的潛在利用價值而被認為是一種極有開發前景的原料。因此，纖維素的分解利用對于解決未來的能源危機與環境問題具有十分重大的意義。利用纖維素酶將植物纖維原料水解是合理利用可再生資源的一條有效途徑，其關鍵環節是纖維素酶的生產。纖維素酶在食品、飼料、農副產品加工、印染紡織、制漿造紙、石油開采和資源再生等方面具有廣泛的用途和應用前景[1]。
高成本、低收益是限制纖維素酶在工業應用中的主要問題，研究人員在利用廉價的基質進行纖維素酶生產方面做了大量的研究工作，在把注意力放在選育高效降解纖維素的微生物的同時，也十分關注如何改善發酵的過程。固態發酵與液態發酵相比，具有設備投資少、生產成本低等特點。因此，固態發酵技術在纖維素酶生產方面已引起了廣泛的重視[2]。該文對綠色木霉-M1固態發酵產纖維素酶的條件進行了優化，對綠色木霉-M1的產酶曲線進行了科學研究，以期為進一步利用廉價基質生產纖維素酶奠定堅實的基礎。
1 材料與方法
1.1 試驗材料
1.1.1 原料。氨化預處理稻草粉，麩皮（市售）。
1.1.2 菌種。綠色木霉-M1菌株（實驗室保存）。
1.1.3 培養基。具體種類如下：①斜面培養基。即PDA培養基。液態種子培養基：馬鈴薯汁，2%葡萄糖，pH值自然，121 ℃滅菌20 min。②固態發酵產酶基礎培養基。稻草粉7 g，麩皮3 g，（NH4）2SO4 0.2 g，水20 mL，pH值自然，121 ℃滅菌50 min。
1.1.4 試劑。鹽酸、硫酸、氨水、氫氧化鈉、3，5－二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、苯酚、硫酸銨、尿素、蛋白胨、硝酸鈉、硝酸銨、氯化銨、無水葡萄糖等試劑均為國產分析純。
1.1.5 儀器與設備。電熱鼓風干燥箱、電子天平、離心機、分光光度計、高壓蒸汽滅菌鍋、生化培養箱、恒溫振蕩器、水浴鍋、超凈工作臺等。
1.2 試驗方法
1.2.1 葡萄糖標準曲線的繪制。準確稱取100.0 mg分析純無水葡萄糖（預先在105 ℃烘干至恒重），用少量蒸餾水溶解后，定量轉移到100 mL容量瓶中，再定容至刻度，搖勻，濃度為1 mg/mL。取8支試管，分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL葡萄糖標準溶液，加入2.5 mL DNS試劑混合均勻，在沸水浴中加熱5 min，取出后立即用流水冷卻到室溫，定容至25 mL，搖勻。于520 nm波長處測定OD值，以OD值為縱坐標，葡萄糖含量為橫坐標，繪制標準曲線，標準曲線方程為y=0.832 x+0.000 3，R2=0.999 5。葡萄糖標準曲線如圖1所示。
1.2.2 DNS試劑配制。稱取200 g酒石酸鉀鈉，溶于一定量水中，加熱溶解，添加10.0 g 3，5-二硝基水楊酸、10.0 g氫氧化鈉，溶解后加入2 g苯酚、0.5 g無水亞硫酸鈉，全部加熱溶解后，冷卻至室溫，定容至1 000 mL。用前一周配制。
1.2.3 固態發酵產酶培養方法。將綠色木霉-M1接種于PDA斜面活化，用接種環挑取一環接種于裝有30 mL液態種子培養基的250 mL三角瓶中，28 ℃ 150 r/min搖床培養72 h；然后接種于裝有固態發酵產酶基礎培養基的250 mL三角瓶中，混勻后于試驗要求的條件下靜置培養。
1.2.4 粗酶液的制備。稱取1 g發酵后的鮮曲，加10 mL蒸餾水，攪拌，于40 ℃水浴中保溫45 min，用脫脂棉過濾，3 000 r/min離心10 min，取上清液即為粗酶液。另取一定量發酵后的鮮曲，80 ℃烘干至恒重，測定水分含量。
1.2.5 FPA、CMC酶活力的測定[3-4]。酶活力單位規定：以每克干物質1 min水解生成1 mg葡萄糖的酶量為1個國際單位（IU，簡寫為U）[5]。
1.2.6 單因素試驗。根據相關文獻報道和前期試驗，影響綠色木霉-M1固態發酵產纖維素酶的主要因素有稻草和麩皮比例、氮源濃度、料液比、培養溫度等，分別對這些影響因素進行單因素試驗。
1.2.7 正交試驗。在單因素試驗基礎上進行正交試驗，對綠色木霉-M1固態發酵產纖維素酶的條件進行優化，具體設計見表1。
2 結果與分析
2.1 稻草粉和麩皮比例對酶活的影響
改變固態發酵產酶基礎培養基中稻草粉和麩皮的比例進行試驗，接種10%的液態種子，混勻后于28 ℃靜置培養4 d后測酶活，結果見圖2。
可以看出，當固態發酵培養基中麩皮含量增大時，固態發酵后所得粗酶液的FPA和CMC酶活逐漸增大，當稻草粉和麩皮比例為7∶3時，FPA和CMC酶活均達到最大。隨著麩皮含量繼續增加，培養基蓬松程度降低，減少了通氣量，影響產酶，FPA和CMC酶活呈下降趨勢。
2.2 氮源濃度對酶活的影響
改變固態發酵產酶基礎培養基中氮源的濃度，接種10%的液態種子，混勻后于28 ℃靜置培養4 d后測酶活，結果如圖3。
可以看出，隨著氮源濃度的增大，發酵后所得粗酶液的酶活也逐漸增大，但當加入氮源的濃度超過2.0%時，所得粗酶液的酶活緩慢下降。氮源濃度過低，不能滿足菌體生長，氮源濃度過大，對產酶有一定的抑制作用。
2.3 料液比對酶活的影響
改變固態發酵產酶基礎培養基中的料液比，接種10%的液態種子，28 ℃靜置培養4 d后測酶活，結果見圖4。
可以看出，水分含量過低時，菌體生長得不到充足的水分，不利于菌體的生長，發酵后所得粗酶液的酶活較低；水分含量過高時，影響氧的傳送，會抑制菌體生長，因而粗酶液的酶活也較低。當料液比為1∶2.5時，固態發酵所得粗酶液的酶活最大。
2.4 培養溫度對酶活的影響
以固態發酵產酶基礎培養基為產酶培養基，接種10%的液態種子，搖勻后分別置于24、26、28、30、32 ℃靜置培養4 d后測酶活，結果見圖5。
可以看出，溫度過低不利于菌體的生長，溫度過高也會限制菌體的生長。培養溫度為28 ℃時，所得粗酶液的酶活最高。
2.5 正交試驗結果
根據正交試驗表的設計方案，改變固態發酵產酶基礎培養基的組成和培養條件，接種10%的液態種子，搖勻后靜置培養4 d測酶活，結果見表2。
由表2可知，綠色木霉-M1固態發酵產FPA酶的較優條件為D2A2B3C3，即培養溫度28 ℃，稻草和麩皮比例為7∶3，氮源濃度為2.5%，料液比為1∶3；綠色木霉-M1固態發酵產CMC酶的較優條件為D2C2B1A1，即培養溫度28℃，料液比為1∶2.5，氮源濃度1.5%，稻草和麩皮比例為8∶2。綜合考慮FPA和CMC酶活2個指標，綠色木霉-M1固態發酵產纖維素酶的較優條件為D2C2B1A2，即培養溫度28℃，料液比為1∶2.5，氮源濃度1.5%，稻草和麩皮比例為7∶3。
2.6 培養時間與酶活的關系
根據正交試驗結果，對于固態發酵產酶基礎培養基，設定如下條件培養：溫度28 ℃，料液比為1∶2.5，氮源濃度1.5%，稻草和麩皮比例為7∶3，液態種子接種量為10%的液態種子，pH值自然。從培養0 h開始，每隔12 h測定FPA和CMC酶活，培養時間與酶活的關系見圖6。
由于麩皮中含有多種維生素和微生物所必須的生長因子，在發酵開始的0～60 h，綠色木霉-M1利用麩皮產生纖維素酶，60 h后麩皮中的營養物質幾乎被消耗殆盡，綠色木霉-M1開始利用稻草粉產生纖維素酶，由于從利用麩皮到利用稻草粉之間需要適應的過程，因而在60～72 h內纖維素酶的活力下降，綠色木霉-M1適應在稻草粉上生長后，纖維素酶的活力又開始上升，在108 h時酶活力達到最大值。隨著生長時間的延長，一方面，酶解產物對纖維素酶產生了抑制作用；另一方面，由于菌體逐漸衰老，導致酶活力開始下降。
3 結論
對綠色木霉-M1固態發酵產纖維素酶的條件進行了研究，結果表明：綠色木霉-M1固態發酵產纖維素酶的較優條件為培養溫度28 ℃，料液比1∶2.5，氮源濃度1.5%，稻草和麩皮比例為7∶3。綠色木霉-M1在固態發酵產纖維素酶的0～60 h，利用麩皮產生纖維素酶，60 h后麩皮中的營養物質被利用完，開始利用稻草粉產生纖維素酶，在60～72 h內纖維素酶酶活下降，72 h后，纖維素酶酶活又開始上升，在108 h酶活力最高。纖維素是地球上數量最大的可再生資源，其生物轉化與利用對解決當前世界面臨的能源危機、糧食短缺和環境污染等問題具有非常重要的意義，隨著研究工作的不斷深入開展，纖維素酶的應用領域將越來越廣。
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【關鍵詞】 黃柏 小檗堿 纖維素酶 超聲波
Extraction Study of Berberine from Cortex Phellodendri by Ultrasonic Wave- Cellulase
XU Yan，LIU Shaoxia，SUN Juan
School of Bioscience and Technology，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110161， China
Abstract：ObjectiveTo study the application effect on extraction of berberine from Cortex phellodendri by ultrasonic wave- cellulase.MethodsBased on the single factors test and orthogonal test the effect of different factors on extraction of berberine from Cortex phellodendri by ultrasonic wave-cellulase was studied，and extracting conditions was optimized.ResultsThe best extraction condition was that time was 2.5 h， the power of ultrasonic wave was 80 ℃ ， the volume of cellulase was 25 ml， temperature was 60 ℃.ConclusionThe berberine of Cortex Phellodendri is extracted by Ultrasonic wave-Cellulase ，which can save time and enhance extract-efficiency， save organic solvent and reduce the use of energy .
Key words：Cortex Phellodendri; Berberine; Cellulase; Ultrasonic wave
黃柏是蕓香科植物黃皮樹或黃檗的干燥樹皮，黃柏具有抗病原微生物、抗潰瘍、降壓、抗心律失常等藥理作用。臨床常用于治療中耳炎、皮膚感染、燒傷、慢性前列腺炎、急性細菌性痢疾、急性胃腸炎等病癥［1］。經實驗證明小檗堿是其主要成分之一。本實驗主要利用正交設計研究纖維素酶、超聲波對黃柏中小檗堿提取量的影響。
1 材料與儀器
1.1 材料
黃柏購自沈陽東北大藥房，纖維素酶由沈陽農業大學生物工程實驗室自制。所用試劑均為國產分析純。
1.2 儀器
722-型光柵分光光度計（山東高密彩虹分析儀器有限公司），KQ3200DE型醫用數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司) 。
2 方法與結果
2.1 纖維素酶活力的測定
2.1.1 酶液配制準確稱取500 mg纖維素酶，溶解后定容至100 ml容量瓶中，此酶液濃度為5 mg/ml。
2.1.2 葡萄糖標準溶液的配制準確稱取100 mg分析純無水葡萄糖，用蒸餾水溶解后，轉移至100 ml容量瓶中，定容至刻度，搖勻。
2.1.3 葡萄糖標準曲線的制作取8支20 ml刻度試管標號后按表1加入各試劑。表1 葡萄糖標準曲線的制作（略）
將上述溶液混勻后，在沸水浴中煮沸5 min，冷卻后定容至20 ml，搖勻。將分光光度計調零，在540 nm下測其A值。以每個試管中葡萄糖毫克數為橫坐標，以對應的A值為縱坐標，繪制標準曲線。
2.1.4 樣品測定取4支20 ml刻度試管，分別依次加入0.5 ml 0.05M檸檬酸緩沖液（pH 4.5），向各試管中加入0.5 ml酶液，在其中一支試管內立即加入1.5 ml 3，5二硝基水楊酸終止酶作用，作為空白與另3支試管一起在50 ℃水浴鍋中保溫1 h。取出后在后3支試管中加入3，5二硝基水楊酸，然后一起在沸水中煮沸5 min，冷卻后定容至20 ml。以空白液調零。在540 nm下比色，由標準曲線查出所測A值對應的葡萄糖生成量。以上述條件，每小時由底物產生1 μmol葡萄糖所需的酶量定義為1個酶活單位。
2.1.5 濾紙酶活力計算濾紙酶活力（U/g） 依據公式：濾紙酶活力（U/g）=葡萄糖生成量（mg）×酶液定容總體積×5.56/［反應液中酶液加入量（ml）×樣品重（g）×時間（h）］，1 mg葡萄糖換算成μmol：1 000 μg/180 μg=5.56 μmol，經實驗測得，纖維素酶作用后，3個試管的A值為0.013，0.011，0.012。取其平均值為0.012，通過葡萄糖標準曲線查得葡萄糖生成量為0.123 mg帶入公式得： 濾紙酶活力=547.104 U/g
2.2 小檗堿的提取及標準曲線的繪制
2.2.1 粗提將黃柏5 g碎成粉狀，置燒杯中，加入1/10量的生石灰細粉，加水溶脹30 min后，再加入30倍量水浸泡24 h后紗布過濾，再用10 %的鹽酸將濾液pH值調至2～3，然后加入濾液體積10 %的NaCl，放置過夜后抽濾，得到鹽酸小檗堿的粗提物，此時還含有雜質。將鹽酸小檗堿的粗提物用熱水溶解并趁熱抽濾，濾液冷卻靜止1 h抽濾得到鹽酸小檗堿與掌葉防己堿等的混合物，至此黃柏的粗提完畢［2］。
2.2.2 鹽酸小檗堿標準曲線的繪制精密稱取鹽酸小檗堿純品10 mg，置50 ml容量瓶中，加95 %的乙醇溶解并定容至刻度，作為鹽酸小檗堿標準溶液。精密稱取此液0.2，0.4，0.8，1.6，2.0 ml于50 ml容量瓶中，繼續加95 %乙醇至刻度并在348 nm下測定吸光度值，
y=0.805 5x-0.009 7。
2.3 纖維素酶-超聲波對鹽酸小檗堿提取率的影響取兩組黃柏各5 g，粉碎。在一組樣品中加入150 ml石灰水，在另一組中加入130 ml石灰水和20 ml濃度為5 mg/ml的酶液。第一組樣品浸泡24 h后雙層紗布過濾，第二組樣品在60 ℃，功率為60 %的超聲波清洗器里超聲清洗90 min后雙層紗布過濾，兩組濾液用10 %的鹽酸調pH 2～3，最后加入濾液體積10%的NaCl，放置過夜，抽濾，得兩組鹽酸小檗堿樣品。用乙醇溶解并分別定容至50 ml，在348 nm下分別測其吸光度值，并在鹽酸小檗堿標準曲線上查出各自的鹽酸小檗堿。
2.4 提取條件的單因素考察
2.4.1 水浴溫度對提取效果的影響
稱取干燥的黃柏粗粉5 g左右，分別于 20，40，60，80，100 ℃時加入20 ml酶液，作用1.5 h，結果在60℃時提取量比較高。
2.4.2 水浴時間的確定
稱取干燥的黃柏粗粉5 g左右，于 60 ℃時加入20 ml酶液，分別作用0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h，結果水浴1.5 h時提取量比較高。表2 纖維素酶-超聲波對鹽酸小檗堿提取率的影響（略）
2.4.3 加酶量的確定稱取干燥的黃柏粗粉5 g左右，于 60℃時加入酶液10，15，20，25，30 ml，分別作用1.5 h，結果加酶量為25 ml時提取量比較高。
2.4.4 超聲功率的確定稱取干燥的黃柏粗粉5 g左右，于 60℃時加入酶液20 ml，超聲時間1.5 h，超升功率分別為40 %，50%，60 %，70 %，80 %，結果超聲功率范圍為60 %時，提取量比較高。
2.5 正交實驗設計根據黃柏中鹽酸小檗堿的提取條件，選定加酶量、溫度、時間、超聲功率4個因素，以L9（34）正交實驗設計系統進行實驗。因素水平見表3，正交表見表4。表3 因素及水平（略）表4 正交實驗（略）
以上分析可以得出結論:各因素對實驗指標(含量)的影響按大小次序來說應當是C(水浴時間)、D(超聲功率)、A(加酶量)、B(水浴溫度)，最好的實驗方案應當是C3A2D3B2，即水浴時間2.5 h， 超聲功率 80 %， 加酶 25 ml， 水浴溫度 60℃。
2.6 利用薄層色譜法檢測纖維素酶、超聲波對鹽酸小檗堿成分的影響制備硅膠薄層板一塊，取鹽酸小檗堿標準樣品、未用纖維素酶提取的鹽酸小檗堿樣品、用纖維素酶提取的鹽酸小檗堿樣品和用纖維素酶-超聲波提取的鹽酸小檗堿樣品各0.5μl，點樣。按CHCl3∶MeOH∶冰HAC=7∶1∶2的比例配制展開劑，將點樣后的薄層板放入層析缸中，待展開至規定距離時取出晾干。在可見與紫外燈下觀察，未用纖維素酶提取的鹽酸小檗堿樣品、用纖維素酶提取的鹽酸小檗堿樣品和用纖維素酶-超聲波提取的鹽酸小檗堿樣品薄層色譜圖相同。說明，用纖維素酶提取的鹽酸小檗堿的成分無變化。
3 討論
3.1 為什么纖維素酶不會影響鹽酸小檗堿的成分纖維素酶是一組能夠降解纖維素生成葡萄糖的酶的總稱。纖維素酶只是破壞黃柏細胞的細胞壁，其細胞內部物質并不含有纖維素類物質，因此纖維素酶對其內容物的成分沒有任何影響。所以，提取出來的鹽酸小檗堿的成分并不會變化。
3.2 為什么超聲提取會使黃柏中小檗堿的提取量增加且不影響其成分超聲提取法是基于超聲波的空化作用來加速物質分子運動的頻率和速度、增加溶劑穿透能力，以提高藥物溶出速度和溶出次數，從而有利于植物有效成分的浸出提取，而它的次級效應，如機械振動、乳化、擴散、擊碎、化學效應等也能加速欲提取成分的擴散釋放并充分與溶劑混合，有利于中藥中絕大部分有效成分的提取。超聲提取還避免了高溫加熱對有效成分的破壞。
【參考文獻】
關鍵詞：姜黃色素；酶輔助水提法；酶解溫度
中圖分類號 S632.5 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2013）24-99-02
姜黃（Curcuma）屬姜科植物，又名色姜黃、子姜黃、寶鼎香，其味辛苦而性寒，入肝、膽、脾、胃經。其盛產于我國南方，主要作為中藥材使用或作為天然色素原料出口。姜黃作為藥食兩用材料，還具有通經行氣、活血降壓、驅寒消炎等效能[1]。
從植物姜黃的根莖中提取的姜黃色素，是一種食用天然黃色素。姜黃色素具有良好的染著性和分散性，其染色力大于其作用，是國內外允許使用的重要的天然食用色素之一[2]，并具有熱穩定性好、著色力強、色澤鮮艷等特點，在食品行業中被廣泛用作天然著色劑[3]，目前已被廣泛應用于飲料、果酒、糖果、糕點、罐頭、果汁及烹飪菜肴中。
本文通過對酶量及酶解溫度的優化，確定水酶法從姜黃中提取姜黃色素的工藝參數。
1 材料與方法
1.1 試驗材料 姜黃：購于臨安康銳大藥房；鹽酸、氫氧化鈉：均為分析純；蒸餾水：自制；纖維素酶（80 000U）：為張家港金源牌產品；果膠酶（30 000U）：為無錫市雪梅酶制劑科技有限公司生產。
1.2 試驗研究基本內容 （1）單一酶用量的確定；（2）酶復合用量配比的確定；（3）酶解溫度的確定。
2 結果與分析
2.1 單因素實驗
2.1.1 最適果膠酶用量的確定 由圖1可以看出：當果膠酶量小于4%時，隨著果膠酶量的增加，吸光度值變化較大；當果膠酶量超過4%后，吸光度值變化較小。在酶促反應中，酶濃度越高水解越完全，但濃度過高吸光值增加反而不明顯。綜合考慮酶制劑成本，所以選擇4%的果膠酶加量。
2.1.2 最適纖維素酶用量的確定 由圖2可以看出：當纖維素酶量小于0.4%時，隨著纖維素酶量的增加，吸光度值變化較大；當纖維素酶量超過0.4%后，吸光度值變化較小。在酶促反應中，酶濃度越高姜黃水解越完全，但濃度過高吸光值增加反而不明顯，綜合考慮酶制劑成本，所以選擇0.4%的纖維素酶加量。
圖1 果膠酶用量對吸光值的影響
圖2 纖維素酶用量對吸光值的影響
2.1.3 最適復合酶量的確定 由圖3可以看出：當復合酶量小于3% 時，隨著復合酶量的增加，吸光度值變化較大；當復合酶量超過3%后，吸光度值曲線逐漸趨于水平。在酶促反應中，酶濃度越高反應速度越快，但過高速度增加反而不明顯。綜合考慮酶制劑成本，所以選擇3%的復合酶量。
圖3 復合酶用量對吸光值的影響
2.1.4 最適酶解溫度的確定 由圖4可以看出：（下轉108頁）（上接99頁）在反應的初始階段，隨著溫度的升高吸光值在增大，但超過50℃后，吸光值反而下降。低于50℃酶活不能充分發揮，酶反應速度過低導致色素不能充分溶出。在此溫度范圍內，溫度升高可提高反應速度。超過此溫度酶逐漸失活，減少了參與反應的分子數，反應速度逐漸降低。由此酶解的最佳溫度為50℃。
圖4 酶解溫度對吸光值的影響
3 結論
本試驗采用酶輔助水提法提取姜黃色素的最佳工藝參數是：纖維素酶用量為0.4%，果膠酶用量為4%，復合酶用量為3%，酶解溫度為50℃。
參考文獻
[1]楊云，馮衛生.中藥化學成分提取分離手冊[M].北京：中國中醫藥出版社，1998.
[2]楊軍君，李湘洲，曠春桃，等.超聲-微波協同提取姜黃色素的研究[J].中國調品，2009，（5）：114.
【摘要】 目的：確定杜仲中多糖的酶法提取工藝。方法：用正交試驗的方法分別研究果膠酶、中性蛋白酶和纖維素酶對杜仲多糖提取率的影響。結果：果膠酶增加多糖提取率效果最為顯著，其最佳提取條件是：酶加量0.10mg/L，酶處理溫度50℃，酶處理時間3h。其次是中性蛋白酶，纖維素酶的效果最差。結論：果膠酶可明顯增加杜仲多糖的提取率。
【關鍵詞】 杜仲；杜仲多糖；聚半乳糖醛酸酶；纖維素酶；正交試驗
【ABSTRACT】 Objective:To study the effect of extraction rate from Eucommia ulmoides oliv polysaccharide by enzyme.Methods:It was investigated by orthogonal experiment design L9(34) on the influence of the extraction rate of Eucommia ulmoides oliv polysaccharide、neutral protein enzyme and cellulose enzyme.Results:The effectiveness of enzyme was the best.The optimal condition of extraction was when enzyme was as much as 10%，and 50℃ heat preservation up to 1h.The second was neutral protein enzyme，The cellulose enzyme was the last.Conclusion:The enzyme can increase the extraction rate of Eucommia ulmoides oliv polysaccharide.
【KEY WORDS】 Eucommia Ulmoides Oliv，EUCOMMAN，Polygalacturonase，Cellulase，Orthogonal Test
杜仲（Eucommia ulmoides oliv）是我國名貴的滋補藥材，具有降血壓、降血脂、降血糖、抗菌消炎、抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗癌、抗腫瘤等作用；含有苯丙素類、環烯醚萜類、黃酮類、多糖類等多種物質，杜仲多糖是一類天然的免疫增強劑，通過提高機體免疫力起到抗癌、抗腫瘤作用[1]。目前提取杜仲多糖主要是用水提醇沉法[2]和酸堿提取法，用水提取法時，多糖的得率較低，后處理過程較為繁瑣，而酸堿提取法又容易使多糖水解，破壞其活性結構，有關酶法提取杜仲多糖的研究報道少見。本文參照有關文獻[3，4]，探討了果膠酶、中性蛋白酶和纖維素酶提取杜仲多糖的最佳條件，為杜仲的進一步開發提供實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 儀器與試劑
1.1.1 儀器 UV754紫外可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）；XJ80離心機（江蘇醫療器械廠）；RE52A旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）。
1.1.2 試劑 杜仲購于本院中醫門診部（于硅膠干燥器中干燥兩天后備用）；果膠酶、中性蛋白酶、纖維素酶（Fluka公司產品）；其余試劑均為國產分析純。
1.2 方法
1.2.1 多糖的提取方法 選取酶加量、酶處理溫度和酶處理時間三個因素。采用L9(34)正交設計表，以多糖的提取率為指標，作正交試驗。正交試驗因素水平見表1。表1 L9(34)正交試驗因素水平表
因素水平酶加量
（mg/L）酶處理溫度（℃）果膠酶中性蛋白酶纖維素酶酶處理時間
（h）10.03455535120.07506040230.105565453
稱取杜仲0.5g于燒杯中，加入50倍量水，沸水浸提2h，離心取上清液，濃縮，定容后測定多糖含量，以該提取率為100%作對照，另稱取杜仲0.5g于燒杯中，加入10倍量水，按正交試驗設計，加入酶。酶解后，再加入20倍水，沸水浸提2h，離心取上清液，定容后測定多糖含量，每個提取平行做3次。
1.2.2 多糖測定方法 采用苯酚—硫酸法測定總糖含量，采用3，5二硝基水楊酸法測定還原性糖含量。總糖含量減去還原糖含量即為多糖含量。
2009年6月劉曉河等：酶法提取杜仲多糖的工藝研究第3期2009年6月河北北方學院學報（醫學版）第3期表2 果膠酶提取杜仲多糖的正交試驗結果分析表3 中性蛋白酶提取杜仲多糖的正交試驗結果分析
2 結果
按1.2.1多糖的提取方法進行提取，再按1.2.2多糖的測定方法測定多糖含量。以不加酶時多糖的提取率為100%作對照。加入酶后增加的多糖提取率見表2、表3和表4。表4 纖維素酶提取杜仲多糖的正交試驗結果分析
酶法提取杜仲多糖的試驗結果表明，果膠酶增加多糖提取率的效果最明顯，最高處理組比對照組高4.1倍(見表2第8組），纖維素酶效果最差。三種酶提取杜仲多糖的關鍵因子與最佳提取條件見表5。表5 三種酶提取杜仲多糖的關鍵因子與最佳提取條件
3 討論
酶法可明顯增加杜仲多糖的提取率，這可能是因為杜仲中除了含有多糖外，還含有纖維素、杜仲膠、蛋白質等物質。這些物質酶解后，有利于多糖類物質的釋放，其中果膠酶增加杜仲多糖提取率的效果最為顯著，而纖維素酶的效果最差。這主要是因為纖維素酶雖然提高了總糖的提取率，同時，使杜仲中的纖維素水解，更增加了還原糖的浸提率，導致多糖的提取率下降。
參考文獻
1 管淑玉，蘇薇薇．杜仲化學成分與藥理研究進展[J]．中藥材，2003，26（2）：124129
2 劉軍海，任惠蘭，段玉蘭，等．杜仲葉多糖提取工藝研究[J]．食品科學，2007，28（7）：264267
關鍵詞 煙草；煙桿；纖維素酶；協同降解作用
中圖分類號 Q93 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2016）11-0225-03
Abstract In order to reuse the waste tobacco stalk，several microbial strains can use waste tobacco rod high-temperature aerobic composting were screened，preliminary detection of several decomposed strains was conducted，and the further testing for strains synergistic effect of the combination and proportion was carried out.The results showed that three groups of degradation of tobacco stalk cellulose strains can grow in the culture medium which with tobacco stems as the sole source of nutrition，and has strong cellulose degradation ability，number of strains were H2568，B1，M1.Synergistic test indicated when biomass ratios of H2568，B1，M1 with 1.0∶1.0∶1.5，combination with the strongest degradation of the cigarette rod ability，the degradation rate of cellulose，hemicellulose degradation rate，lignin degradation rate reached 56%，70%，33%，the highest fiber prime enzyme activity reached 625.44 U/mL.
Key words tobacco；tobacco stalk；cellulase；synergistic degradation
煙草不僅是一種極具經濟價值的作物，而且也是具有科研價值的一年生模式植物[1]。我國的煙草種植量和生產量穩居世界首位，在煙草采收和運輸的過程中，大量的煙桿會被放棄或焚燒，即污染環境又造成資源浪費[2-3]。如何再充分利用這些廢棄煙桿，成為目前迫切需要研究解決的課題。楊政明[4]、詹其厚[5]、張從軍[6]等利用煙桿中含有大量的氮、磷、鉀及微量元素的特性，利用廢棄煙草生產有機復合肥分別在核桃、夏玉米、水稻上施用取得了較好的肥效，并使農作物產量顯著增加。但是又因煙桿中含有77.4%纖維素和半纖維素、18.63%木質素[7]，顯著高于禾本科作物秸稈中木質素含量，因此其難以被充分利用[8]。張楠[8]、周熠[9]對煙桿中纖維素進行了降解并取得了不錯的效果，但纖維素的降解率不到40%，理論上還有一定的提升空間。因此，本研究通過組合高效的好氧纖維素、半纖維素、木質素降解組合菌群，考察其對煙桿的降解效果并優化其組合比例，以便開發能夠利用廢棄煙桿制作高溫好氧堆肥的高效微生物菌劑[10]。
1 材料與方法
1.1 試驗材料
本試驗所有煙桿由中南煙草試驗站提供。培養基：細菌培養基為0.5% NaCl，0.5%牛肉膏，1%蛋白胨，蒸餾水100 mL，pH=7；真菌培養基為綜合PDA瓊脂培養基（20%馬鈴薯提取液，2%葡萄糖，0.3% KH2PO4，0.15% MgSO4?7H2O，0.02%維生素B1，蒸餾水100 mL，pH=7）。煙桿選擇培養基為10%煙桿，蒸餾水100 mL，瓊脂粉2.0%，調pH值至7。煙桿液體發酵培養基為10%煙桿，蒸餾水100 mL，調pH值至7。
1.2 試驗方法
1.2.1 菌種初步篩選。從土壤、腐熟的煙桿、剛屠宰的牛的胃部以及實驗室現有的纖維素降解菌中篩選能降解煙桿的菌種。將各菌株分別接種1環到2種種子液培養基擴大培養，培養溫度分別為25、37 ℃，搖床轉速為180 r/min，發酵24 h后，各取種子液0.1 mL涂布在煙桿選擇培養基上，分別在25、37 ℃培養，3 d后觀察菌種生長情況。選擇能在煙桿選擇培養基上生長的菌種進行下一步煙桿液體發酵試驗。
1.2.2 不同菌株煙桿液體發酵試驗。將各菌株種子液以10%的接種量接種到煙桿液體發酵培養基培養，發酵10 d后以4 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL適量稀釋，用DNS法測定還原糖，選取還原糖含量較高的菌株進行下一步試驗。
1.2.3 各菌拮抗性試驗。將活力較高的菌株進行兩兩拮抗性試驗，利用抑菌圈法在蛋白胨、牛肉膏培養基（37 ℃）和PDA培養基（25 ℃）上培養24 h后，觀察菌株相互拮抗的情況。
1.2.4 不同組合菌煙桿液態發酵試驗。將無明顯拮抗性作用的菌株做三菌種組合和四菌種組合發酵試驗，把混合種子液于37 ℃、180 r/min擴大培養24 h，按接種量10%的煙桿液體發酵15 d，測定發酵液中纖維素、半纖維素、木質素降解率，選出降解效率較高的4組菌種進行下一步試驗。
1.2.5 組合菌酶活力與發酵時間的關系。將選取的最佳組合菌在37 ℃、180 r/min條件下進行煙桿液體發酵15 d，間隔測定發酵過程中的纖維素酶活力。
1.2.6 組合菌酶活力與發酵溫度的關系。將選取的最佳組合菌分別在40、50、60 ℃及其他條件不變的條件下發酵11 d，測定纖維素酶活力，判斷所選組合菌是否具有耐高溫性。
1.3 分析方法
1.3.1 纖維素、半纖維素、木質素定量分析方法。通過測定還原糖的增加量可以初步挑選出更能高效降解煙桿的菌種，但是為了更詳細地了解煙桿中主要成分的降解情況[11]，下一步試驗以纖維素、半纖維素、木質素的降解率為主要試驗指標[12]。圖1為纖維素、半纖維素、木質素定量分析方法。
1.3.2 纖維素酶活性測定方法。取10 mL發酵液用離心機4 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL稀釋25倍制成待測酶液。取4支25 mL刻度具塞試管（2支平行管、1支空白管）。分別向所有管中加入CMC-Na溶液2.00 mL，再加入稀釋好的待測酶液0.50 mL（空白管不加），用漩渦混勻器混勻，蓋塞。（50.0+0.1）℃水浴30 min后，加入DNS試劑3.0 mL，于空白管中加入待測酶液0.50 mL，搖勻。沸水浴10 min后，迅速冷卻至室溫，用水定容至25 mL，以空白管調儀器零點，在分光光度計波長540 nm下，用10 mm比色杯分別測量樣品管中樣液的吸光度，取平均值。通過用線性回歸方程求出纖維素酶活[13]。
2 結果與分析
2.1 煙桿化學組成分析
首先對提供的樣品進行了部分化學組成的檢測，尤其是對于纖維素類的物質成分進行了定量分析。在提供的煙桿樣品中，總纖維素含量達到77.44%，木素含量大約為18.63%，果膠含量為3.89%，苯-醇溶出物含量為3.21%，另外還有5%左右的灰分。可見，煙桿中含有豐富的纖維素類物質資源，如果能夠對這些纖維素降解后加以利用，完全可以提高煙桿廢棄物的利用價值。
2.2 纖維素菌的篩選
在篩選出來的微生物中有11組菌種能利用煙桿生長，將其分別編號為H2568、H1249、H1348、H1764、H4479、B1、M1、N1、Y1、Y2、Y3。進行下一步煙桿液體發酵試驗以確定所需纖維素菌。
2.3 纖維素菌的確定
初步篩選的11組菌株在降解煙桿多糖生成還原糖的能力上差異較為顯著。從圖2可以看出，這些微生物生成還原糖的量從高到低的順序依次為B1、M1、H2568、N1、H1249、H1348、Y3、H1764、H4479、Y2、Y1。選取其中降解能力最強的5株菌H1249、H2568、B1、M1、N1，作為下一步菌種協同降解作用的基礎進行拮抗試驗。
2.4 不同菌種拮抗結果
有很多試驗研究表明，復合菌群較單一菌的降解能力強，特別是針對纖維素、木質素等需多種酶協同降解的物質，不同菌種組合起來可以起到補充和加強分解的作用。但在同一生長環境下，不同菌株之間產生拮抗性作用會抑制其自身生長和產酶活力。利用菌株之間不相容性，進行拮抗性試驗，從表1可以看出：H1249與B1拮抗，選取相對降解能力更強的B1。得到所需的4株無明顯拮抗性的菌株H2568、B1、M1、N1，可用于下一步菌種組合研究。
2.5 半纖維素、木質素和纖維素的降解情況
在多菌株協同降解試驗中發現H2568、B1和M1這3種菌種以等量進行組合時能夠取得較好的降解效果（圖3），纖維素、半纖維素、木質素的降解率分別達到了47%、63%、26%。因此，對煙桿纖維素降解效果最為理想的協同菌群組合確定為H2568+B1+M1。
2.6 組合菌酶活力與發酵時間的關系
將上述試驗中確定的最佳組合菌H2568-B1-M1煙桿液體發酵15 d[14]，觀察其發酵過程中酶活力的變化情況（圖4），發酵第11天時，發酵體系中纖維素酶的活力最高，達到625.44 U/mL，隨后酶活力開始逐步降低。
2.7 組合菌酶活力與發酵溫度的關系
高溫對菌株的生長與產酶不利，但由于現階段煙桿大多處理方式為堆肥，那么固態發酵所需升溫過程不能避免，因此需要篩選出的組合菌能夠耐高溫來適應固態堆肥。從圖5可以看出，在發酵11 d后，H2568-B1-M1的纖維素酶活不可避免的受到高溫影響，但是即使在60 ℃下仍能達到250.47 U/mL。組合菌耐高溫試驗證明了H2568-B1-M1能長期保持較高的纖維素酶活力且耐高溫。
2.8 菌量比例對協同降解作用的影響
確定H2568、B1與M1為最佳的菌種組合后，對其接種時的比例進行優化試驗。從圖6可以看出，H2568、B1與M1以1.0∶1.0∶1.5的比例組成煙桿發酵種子液時，取得了最佳效果。其纖維素降解率、半纖維素降解率、木質素降解率分別達到56%、70%、33%，較1.0∶1.0∶1.0配比時的降解能力顯著提升。
3 結論與討論
煙葉產量的增加同時產生了大量的廢棄煙桿。由于煙桿不易腐爛也不能直接用于肥田，因而絕大部分都是作為廢棄物被丟棄或焚燒，這不僅不同程度地污染了當地的生活生產環境，也造成了資源的浪費。經試驗證明通過微生物發酵將煙桿中的大分子物質降解，將纖維素、半纖維素、木質素降解為小分子的單糖，使卷煙制造產生的廢棄物轉化為農業生產中急需的有機肥，具備廣闊的生產應用前景。而煙桿中有機質的降解依賴于微生物是否產生多種酶系和產各種酶系活力的強弱。基于纖維素酶的復雜性，大量試驗證明，復合菌液體發酵產纖維素酶活力高于單菌株，在同一生長環境下，相互依賴，共同生長，達到良好的協調作用。因此，篩選出無明顯拮抗、耐高溫、長時間具備高酶活且能高效降解煙桿的組合菌是試驗的基礎。在自然環境中常見的纖維素分解細菌大多為食纖維菌屬、生孢食纖維菌屬、多囊菌屬、鐮狀纖維菌屬與纖維弧菌屬。具有很強的纖維素分解能力的真菌主要有木霉、鐮刀霉、青霉、曲霉、毛霉、葡萄孢霉等屬的菌種。本試驗前期篩選了多種能降解纖維素的細菌、真菌用于進一步測試它們對煙桿的降解能力。因此，確定最佳的降解煙桿組合菌是為下一步研究提供了根本的基礎。本試驗中纖維素酶活力和還原糖的生成量能說明菌種自身降解能力的強弱，從另一角度總纖維素、半纖維素、木質素的變化情況反映了組合菌的降解效率。H2568-B1-M1以1.0∶1.0∶1.5的比例進行煙桿液體發酵，11 d后其纖維素降解率、半纖維素降解率、木質素降解率分別達到56%、70%、33%，說明經H2568-B1-M1產生多種酶系，促進了有機質的降解，對煙桿的降解取得了較顯著效果，進一步提高纖維素酶活力，增加還原糖的生成量，提高纖維素、半纖維素、木質素的降解率，為進一步進行煙桿固體發酵奠定基礎。
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關鍵詞：艾比湖；纖維素降解菌；酶活；Bacillus aquimaris菌株
中圖分類號：S182
文獻標識碼：A 文章編號：16749944（2017）10011304
1 引言
新疆艾比湖濕地國家級自然保護區是中國內陸荒漠物種最為豐富的區域之一，由于其特殊的地理位置，使得該地形成了沼澤、灘涂、鹽湖、沙漠、石漠、礫漠、鹽漠等多種土壤類型。依此而生的土壤微生物資源經歷了長期的進化演變，成為我國干旱區重要的種質基因庫，具有典型性和較高的保護價值[1]。纖維素是地球上最豐富的碳質資源之一，由于難以被大量分解利用，而被人們大量堆積或燃燒，從而對環境造成極大的污染和資源浪費。如果能通過纖維素水解酶轉化利用，必將產生很好的經濟和社會效益[2]。纖維素酶是由一系列酶系組成，濾紙是純纖維素材料，其聚合度和結晶度都比較適中，降解濾紙的濾紙酶（FPase）活性所代表的是纖維素酶的總活力，體現了纖維素酶系內的協同能力。濾紙酶活力的測定主要依據纖維素酶水解濾紙產生還原糖的數量[3]。研究中試圖通過分離和篩選具有較高纖維素酶活性的菌株，為開發具有應用前景的工業菌種做出貢獻。
2 材料與方法
2.1 供試土壤
試驗土壤采自新疆北部艾比湖濕地國家級自然保護區內的蘆葦地和紅柳地。采取距表層0～20 cm土壤約200 g，去除土壤中可見的動植物殘體和石子，用自封袋封裝帶回實驗室，過2 mm篩，立即進行篩菌測酶活。
2.2 實驗方法
2.2.1 纖維素降解菌篩選
稱取1.0 g 土樣到10 mL離心管中，加入無菌水9.0 mL 和幾粒無菌鋼珠，經高速振蕩混勻后靜置，取上清液1 mL稀釋至10-3、10-4、10-5、10-6、10-7五個濃度梯度。取100 μL涂布于培養基上，30℃ 恒溫倒置培養24 h后，用牙簽挑取形態有差異的單菌落，接種到固體平板培養基上，用于純化后測序鑒定。
另取上清液1 mL加入液體培養基中，恒溫搖床120轉/min，30℃富集三代后，劃線接種在固體培養基上，24 h后，用牙簽挑取形態有差異的單菌落（產外切葡聚糖酶和內切葡聚糖酶的菌落有透明水解圈，產β-葡萄糖苷酶的菌落周圍有黑圈），接種到固體平板培養基上，用于純化后測序鑒定。
注意：液體培養基不加顯色劑和瓊脂。
2.2.2 纖維素酶活測定
（1）濾紙酶（FPase）。取100±0.5 mg濾紙與1 mL菌液于10 mL比色管中，加入pH值為4.8，0.1 mol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖液l mL，50℃水浴酶解反應1 h后取出，迅速冷卻至室溫。
（2）內切β-1.4-葡聚糖酶（CMCase）。取2 mL CMC-Na溶液與1 mL菌液于10 mL比色管中，50 ℃水浴酶解反應1 h后取出，迅速冷卻至室溫。
（3）外切β-1.4-葡聚糖酶（Avicelase）。取2 mL微晶纖維素溶液與1 mL菌液于10 mL比色管中，50 ℃水浴酶解反應1 h后取出，迅速冷卻至室溫。
（4）β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）。取2 mL水楊苷溶液與1 mL菌液于10 mL比色管中，50 ℃水浴酶解反應1 h后取出，迅速冷卻至室溫[4]。
酶促反應結束之后，立即加入0.8 mL DNS 試劑，沸水浴5 min之后取出，迅速冷卻至室溫，用水定容10 mL。在530 nm波長處測定吸光度OD 值，對照葡萄糖標準曲線計算葡萄糖量P。以高溫滅活的粗酶液為對照組。
葡萄糖標準曲線繪制：取10 mL比色管6支，加入1.0 mg/mL的葡萄糖標準溶液0.0、0.16、0.32、0.48、0.64、0.8 mL，加蒸餾水0.8、0.64、0.48、0.32、0.16、0.0 mL，加DNS試劑0.8 mL，混勻后煮沸5 min，取出立即用冷水冷卻，用水定容至10 mL，搖勻，530 nm測吸光度OD值，以OD值為縱坐標，葡萄糖的含量為橫坐標，繪制標準曲線。
酶活定義：底物在一定反應條件（pH值為4.8，50℃，恒溫l h）下，與1 mL粗酶液反應1 min生成1 μg葡萄糖為1個酶活單位（U/mL）。
計算：酶活力（U/mL）=P×K×1000/時間*體積，其中K為稀釋倍數。
2.3 稻荽理
利用Excel 2003，Origin 8.0和SPSS 17.0對數據進行統計、分析及繪圖。重復性實驗結果用平均值±標準誤表示。
3 結果與分析
3.1 菌株的篩選結果
采用3種培養基和常規的分離技術對土樣中的纖維素降解菌進行初步篩選，分離。然后對分離的細菌進行16S rRNA測序，獲得序列后，在NCBI進行Blast比對，經過比對的結果如表1。
經過初篩分離純化后，共得到74株菌，屬26個種。篩到的厚壁菌門Firmicutes 芽孢桿菌屬Bacillus 細菌最多有14個種。Bacillus是一類好氧或兼性厭氧、能產生抗逆性孢子的桿狀細菌。多數為腐生菌，主要分布于土壤、動植物體表及水體中。由于芽孢桿菌屬的細菌可以產生多種有用代謝產物，芽孢又是菌體度過不良環境的休眠體，因此，在工、農業生產上有較高的應用價值[5]。例如枯草芽孢桿菌是工業上生產淀粉酶、蛋白酶的主要菌種，蘇云金芽孢桿菌用于生產生物農藥，巨大芽孢桿菌能提高土壤有效磷的含量等。Bacillus aquimaris能利用羧甲基纖維素鈉，水解淀粉，耐鹽[6]。Bacillus aryabhattai可以利用纖維二糖，促進植物生長，具有溶磷作用、產植物激素。Bacillus litoralis采自海水淤泥，利用纖維二糖和醋酸纖維素，水解淀粉。Bacillus oceanisediminis具有硝酸鹽還原作用，還能利用纖維二糖、醋酸纖維素。Bacillus firmus能富集鉻、砷，或用于生物修復[7]。Bacillus vietnamensis中等耐鹽、產氧化酶，抗溶菌酶（區別于B.firmus）。可在pH值為4.5和9.0的環境生長，不同于B.aquimaris。Altererythrobacter xinjiangensis能水解酪蛋白和纖維素，可利用葡聚糖。Arthrobacter nicotianae降解尼古丁，脫硫，聚磷。Planococcus rifietoensis產纖維素酶、脫氨酶，促進植物生長（固氮，溶磷作用，產吲哚乙酸）[8]。Microbacterium amylolyticum有一定聚乙烯降解作用。Streptomyces coelicoflavus能降解纖維素，還原硝酸鹽[9]。
3.2 纖維素酶酶活測定
選取其中水解圈較大的8株菌進行纖維素酶活測定（表2）。分別測定了濾紙酶（FPase）、內切葡聚糖酶（CMCase）、外切葡聚糖酶（Avicelase）和β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）的酶活。
由圖1可知，菌株13C12、03C5、05B2的濾紙酶活顯著高于其它，其中13C12的酶活最高達21.4 U/mL。菌株MZ2、03C9、13C3的酶活次之，約為3.2 U/mL。菌株132和13A4的濾紙酶活最低。
4 結論與討論
（1）經過初篩分離純化后，共得纖維素降解菌到74株菌，屬26個種。篩到的厚壁菌門Firmicutes 芽孢桿菌屬Bacillus 細菌最多，有14個種。
（2）菌株13C12的纖維素酶活最高。濾紙酶（FPase）活為21.4 U/mL，內切葡聚糖酶酶活達37.4 U/mL，外切葡聚糖酶（Avicelase）為19.2 U/mL，β-葡萄糖苷酶酶活為24.6 U/mL。
（3）接種量的多少會影響產纖維素酶菌株在發酵液中的生長、代謝和繁殖速度。選擇較大的接種量可以縮短發酵液內菌體密度達到高峰的時間，有利于產物的形成以及培養基質的利用，并減小被雜菌污染的概率。然而接種量過大則會導致發酵液中溶氧不足，限制a物的合成，菌體易老化；接種量過小則會延長發酵周期，影響產率。
（4）由于許多土壤細菌生活力較差，樣本采集回來后應盡快篩菌，否則，擱置時間過長會嚴重影響篩菌的效率和成功率。此外，土壤細菌大多數不可培養，通過傳統篩菌方法篩到的菌落有限，所以探尋新的實驗方法具有重要意義。
致謝：中國科學院微生物研究所真菌學國家重點實驗室周杰民博士對本實驗方案設計過程中的支持；感謝新疆生產建設兵團第五師農科所的工作人員在采樣過程中的幫助。
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關鍵詞：纖維素乙醇；木質纖維素；產業化；生物精煉；乙醇聯產
Abstrct：With the energy crisis and environmental problems? becoming increasingly prominent， world energy development is entering a new period .That is， the world is experiencing the revolution that the energy? is being restructured from fossil energy consumption to focusing mainly on the renewable energy revolution. Cellulose ethanol is been the best alternative liquid fuel and industrial biotechnology research focuses on ecological benefits. In this paper， the authors summarize the status of cellulose ethanol at home and abroad， and analyz the impact? factors? affecting cellulose ethanol industry development and the development trend of the cellulose ethanol industry .
Key words：Cellulose ethanol ;lignocellulose; industrialization ;bio-refining ;co-production of ethanol
0引 言
能源問題是當今世界各國都面臨的關系國家安全和經濟社會可持續發展的中心議題，已經成為全球關注的焦點。因此，人們開始把目光轉移到有利于社會可持續發展的可再生能源體系。專家認為，生物質資源轉化體系是引領第三次世界能源革命的技術平臺。在此背景下，燃料乙醇已經被視為替代和節約汽油的最佳燃料，其高效的轉換技術和潔凈利用日益受到全世界的重視，已經被廣泛認為是21世紀發展循環經濟的有效途徑。
在中國，燃料乙醇的主要原料是玉米和小麥。隨著燃料乙醇的快速發展，原料問題日益突出，成為制約燃料乙醇發展的瓶頸；另外，以糧食作物為原料的燃料乙醇產業發展還有可能引發國家糧食安全問題。因此，中國政府提出生物乙醇堅持非糧之路，即“不與人爭糧，不與糧爭地”。經濟分析顯示，中國發展纖維素乙醇有更大的優勢。木質纖維素是地球上最豐富的可再生資源，也是當前利用率最低的資源，是各國新資源戰略的重點。中國可利用的木質纖維素每年在7億噸左右，這些豐富而廉價的自然資源主要來源于農林業廢棄物、工業廢棄物和城市廢棄物。所以，纖維素乙醇是未來發展的必然方向。
1木質纖維素原料組成及性質
木質纖維素是由纖維素、半纖維素、木質素和少量的可溶性固形物組成。纖維素大分子是由葡萄糖脫水，通過β-1，4葡萄糖苷鍵連接而成的直鏈聚合體。在常溫下不發生水解，高溫下水解也很緩慢。只有在催化劑的作用下，纖維素的水解反應才顯著進行。常用的催化劑是無機酸或纖維素酶，由此分別形成了酸水解和酶水解工藝。半纖維素是由不同的多聚糖構成的混合物，這些多聚糖由不同單糖聚合而成，有直鏈也有支鏈，上面連接有不同數量的乙酰基和甲基。半纖維素的水解產物主要有己糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、戊糖和阿拉伯糖等幾種不同的糖。半纖維素的聚合度較低，相對比較容易降解成單糖。二者的水解機理可以用下列方程式簡單地表示：
(C6H10O5)n + nH2OnC6H10O6
(C5H804) n + nH2OnC5H10O5
2國外纖維素乙醇的研究與應用現狀
隨著現代工業的迅速發展，大規模開發利用作為清潔能源的可再生資源顯得日益重要。許多國家都制定了相應的開發研究計劃，例如：美國的“能源農場”、巴西的“酒精能源計劃”、印度的“綠色能源工程”和日本的“陽光計劃”等發展規劃。其它諸如丹麥、荷蘭、德國等國，多年來一直在進行各自的研究與開發，并形成了各具特色的生物質能源研究與開發體系，擁有各自的技術優勢。
自1973年世界石油危機后，巴西就實施了“國家乙醇生產計劃”，主要依靠本國豐富的甘蔗資源，積極發展燃料乙醇產業，目前已經發展320多家燃料乙醇生產企業，1400萬噸/年的乙醇生產規模。大部分企業實行燃料乙醇和糖聯產。美國在燃料乙醇的生產上仍然是世界乙醇生產的領頭羊，在將纖維素轉化為燃料酒精的研究、生產和應用方面也走在世界的前列。美國加州大學Berkeley分校采用的流程是纖維素水解與發酵同步進行，該工藝以粉碎的玉米芯為原料，再用稀酸水解，將半纖維素水解成木糖等產物。該流程的酸水解是連續進行的，反應器中的纖維原料含量為5%，玉米芯水解率達40%，水解液中糖為2.6%，然后采用多效蒸發器濃縮至糖濃度為11%再進行發酵。美國維吉尼亞州立大學利用80%的濃磷酸循環使用進行木質纖維素“溶解性分離”的研究，然后經纖維素酶水解，得到較純的葡萄糖，其得率達到35%。瑞典隆德大學Karin Ohgren等研究了將蒸汽爆破預處理后的玉米秸稈進行同步糖化與發酵的工藝研究，試驗結果表明，發酵結束后乙醇達到25g/L。
近年，隨著纖維乙醇技術的快速發展，一些大公司開始計劃建造較大規模的試驗性工廠。美國的Gulfoil Chemical公司建成了可處理1t/d纖維廢料的中試車間，年產純乙醇2億升，乙醇產率為27.7%。加拿大的Iogen生物技術公司，在渥太華開設了以麥秸為原料的3.2萬加侖/年纖維素乙醇廠，采用稀酸結合蒸汽氣爆預處理半纖維素，隨后用纖維素酶水解，分離后的液體進行木糖和葡萄糖聯合發酵。經評估，其生產成本比谷物乙醇高出30%～50%。
3國內纖維素乙醇研究與應用現狀
我國在纖維素乙醇技術開發上也取得了一些重要進展。浙江大學主持的“利用農業纖維廢棄物代替糧食生產酒精”的項目已在河北完成中試生產，以玉米芯為原料，乙醇產率為22.2%（W/W）。南京林業大學建立了玉米秸稈間歇蒸汽爆破預處理、纖維素酶水解和戊糖己糖同步發酵技術制取纖維乙醇的中試裝置。水解得率為71.3%，還原糖利用率和乙醇得率分別為87.17%和0.43%。華東理工大學于2005年已建成了纖維乙醇600噸/年的示范性工廠，以廢木屑為原料，以稀鹽酸水解和氯化亞鐵為催化劑的水解工藝以及葡萄糖與木糖的發酵，轉化率達到了70%。河南農業大學利用黃胞原毛平革菌和雜色云芝的復合預處理，對選擇性降解木質素的能力和規律進行了試驗研究。生物降解后原料水解率達到了36.67%。山東大學微生物技術國家重點實驗室主要開展“纖維素原料轉化乙醇關鍵技術”研究。對纖維素酶高產菌的篩選和誘變育種、用基因手段提高產酶量或改進酶系組成、纖維素酶生產技術等研究。吉林輕工業設計研究院“玉米秸稈濕氧化預處理生產乙醇”在實驗室規模為10L發酵罐條件下，經濕氧化預處理和酶水解后酶解率86.4 %；糖轉化為乙醇產率48.2 %。
近年來，以河南天冠集團和中糧集團為代表的幾家大型燃料乙醇生產企業，與高校聯合進行纖維素乙醇的工業化技術的探索性研發。目前，河南天冠集團將建成300噸/年的乙醇中試生產線，原料轉化率超過了16%。中糧集團于2006年在黑龍江肇東啟動建設500噸/年纖維素乙醇實驗裝置。吉林九新實業集團建立了3000噸/年的玉米秸稈生產纖維乙醇示范性工廠。
迄今為止，全世界已經建有幾十套纖維質原料經纖維素酶水解成單糖的中試生產線或小試生產線。纖維燃料乙醇在國內外研究正步入一個新的時代，在一些關鍵技術上取得了重要的進展，并建立了多個示范性工廠。但整體上，由于在纖維素酶生產技術、戊糖己糖發酵菌株構建等方面還沒有取得根本性的突破，所以距離纖維素乙醇的產業化還有一定的距離。
4影響纖維乙醇產業化的主要因素
近年來，國內外對利用木質纖維轉化乙醇進行了大量的研究， 工藝路線已經打通，但當前要想實現工業化生產，在原料收集、預處理、糖化、發酵和精餾各工藝過程中還存在著制約纖維素乙醇生產的問題，主要表現為以下四個方面
（1）木質纖維素原料分散，季節性強，尤其是農作物秸稈。
（2）木質纖維素預處理技術有待進一步優化和提高。由于天然纖維素原料的結構復雜的特性，使得其纖維素、半纖維素和木質素三者不能有效分離；另外伴隨產生一些中間副產物，實驗表明，這些物質抑制酵母的生長和代謝，最終影響乙醇產率。
（3）缺乏高效的纖維酶菌株，現有的纖維素酶制劑效果較低，使得酶解糖化經濟成本較高，當前生產一噸纖維乙醇需要酶制劑成本在2200～2600元。
（4）缺乏能夠同時高效利用戊糖和己糖的發酵菌株。在木質纖維水解中，其中有相當比重的木糖（葡萄糖/木糖約為2）。因此，戊糖的利用是影響纖維乙醇綜合成本的關鍵一項。
5未來纖維素乙醇產業化發展趨勢
目前，國外纖維素乙醇產業化的研究已經成為了熱潮，正步入一個關鍵時期，中國在這方面也有良好的基礎。為了使纖維素乙醇盡早地實現產業化，除了以上幾項關鍵技術進一步解決好外，還應當借鑒石油化工的經驗，堅持走生物精煉和乙醇聯產的模式，盡可能地最大提升和拓展底物的各組分的經濟價值，也許是促使纖維素乙醇產業化的重要途徑。
盡管木質纖維素原料本身非常廉價，但是將其轉化成乙醇的工藝過程非常復雜，需要大量的能耗。這主要是由木質纖維素自身的結構特性決定的，而得到的目標產物是經濟附加值并不很高的乙醇，致使單位乙醇的經濟效益并不具備較強的市場優勢。而生物精煉和乙醇聯產模式就打破了原來由生物質生產單一產品的觀念，實現原料充分利用和產品價值最大化，就是所謂的“吃干榨凈”，正如目前的利用糧食生產乙醇一樣。例如，利用玉米同時生產燃料乙醇、玉米油、蛋白粉、高果糖漿、蛋白飼料和其他系列產品，這樣提升了整個工藝產品的經濟附加值，同時取得良好的經濟效益和社會效益。同樣利用木質纖維素的三大類組分也可以衍生出多種產品。例如：目前，大多的木糖醇廠主要是利用玉米芯中的半纖維素生產木糖醇，結果剩下大量的木糖渣（主要是纖維素和木質素），如果進行聯產模式，將剩下的纖維素與木質素進行組分分離，分別生產纖維乙醇和優質燃料或木素磺酸鹽，就有可能進一步提升產品的綜合效益。
綜上所述，中國應該利用纖維素乙醇作為主要的生物能源，加快以纖維素乙醇為核心的綜合技術開發，盡早實現其產業化發展的目標。相信經過“十一五”計劃的實施，中國在利用纖維素廢棄物制取燃料乙醇方面，必將取得更大的進展，為緩解液體燃料短缺、促進環境保護和社會可持續發展等方面發揮重要作用。
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