時間：2023-05-30 09:26:50
開篇：寫作不僅是一種記錄，更是一種創造，它讓我們能夠捕捉那些稍縱即逝的靈感，將它們永久地定格在紙上。下面是小編精心整理的12篇基因編輯，希望這些內容能成為您創作過程中的良師益友，陪伴您不斷探索和進步。
很多人擔憂，基因編輯技術的過快發展會讓人類社會陷入倫理難題。不過，估計很少有人料到，它竟然登上了“大規模殺傷性與擴散性武器”威脅清單。 被列為大規模殺傷性武器
在近期的美國情報界年度全球威脅評估報告中，基因編輯被列為潛在的大規模殺傷性武器之一。該報告稱：“這種有雙向用途的技術分布廣泛、成本較低、發展迅速，任何蓄意或無意地誤用，都可能引發國家安全問題或嚴重的經濟問題。”
美方情報人員產生這種擔憂的主要原因是，生物技術屬于一種“雙向用途”技術，可以作為正常的科學發展也可以作為武器使用。該報告還指出了一些新的發現――“在經濟全球化的背景下，找到具有相關專業知識和技術的人員也變得更加容易。” 存在危害人類的可能性
所謂基因編輯，就是將苷酸序列進行刪除和插入等操作，使人們可以依照自己的意愿改寫遺傳密碼。例如，可以通過改變人類胚胎的基因，修復其中的致病部分，并使“優質基因”得以遺傳。這樣，意味著阿爾茨海默綜合征、唐氏綜合征等家族遺傳疾病存在徹底根除的可能。
長期以來，只能通過物理和化學誘變、同源重組等方式來實現基因編輯。 這些方法要么編輯位置隨機，要么需要花費大量人力物力進行操作，但CRISPR/Cas9技術的出現，使得科技人員能夠方便而精確地對DNA和苷酸序列進行編輯，不僅操作更為簡單，成本也極低：應用者只需花60美元便可以在網上買到其中最基本的材料。有科學家擔心基因編輯技術會被用于研發“殺手蚊子”，或者制造可以大面積摧毀主要農作物的瘟疫，甚至研制可以剪斷人體DNA的病毒。
“基因編輯的誕生打破了傳統的、天然的、緩慢的遺傳及變異和進化的過程。因此，適當利用對人類進步和文明有好處，但不當利用確實存在用來制造危害人類的病毒或病菌的可能。”中華醫學會智庫專家、免疫學博士錢勇表示。 目前階段有點“危言聳聽”
雖然如此，把基因編輯技術列入大規模殺傷性武器威脅清單還是令一些科學家大跌眼鏡。
中科院植物研究所植物分子生理學實驗室主任劉春明說：“這是一個正常的過程，新技術出現時人們總會有很多擔心，常常是經過一段時間以后，人們會冷靜下來，真正知道它是否具有潛在的破壞性?！?/p>
清華大學生命科學學院博士生導師郗喬然認為，目前基因編輯技術的使用仍局限于實驗室中?！艾F在把基因編輯列入大規模殺傷性武器威脅清單，就這一技術目前的發展階段來看，我個人認為有點危言聳聽?！彼a充說，盡管不排除未來這種技術發展到一定程度后會出現人們所擔心的情況。（據科技日報、第一財經日報）
農業時代的開啟
“遺傳”，聽起來是個人人都能理解的名詞。中國人說“種瓜得瓜，種豆得豆”，英美人說“like father like son”。這些俗語里反映的生物代際之間的相似性，就是遺傳。先人們大概早就發現，不管是動物還是植物，不管是生物的外形、行為，還是性格，這些性狀都能在一代代的繁衍中頑強地延續和保留下來。
實際上，早在人類文明開始之前，人類就已經充分―盡管也許是下意識―觀察到了遺傳現象的存在，甚至已經開始利用遺傳規律改善自己的生活了。
現代人類的祖先可以追本溯源到數百萬年前的非洲大陸。在兩百多萬年的無盡歲月里，先祖們在非洲大陸上采集植物果實、捕獲動物，過著靠天吃飯、隨遇而安的日子。人類文明的曙光出現在距今十幾二十萬年前。那時，現代人的直系祖先―人屬智人種―出現在非洲大陸，并且很快一批批地走出非洲，在全世界的各個大陸和主要島嶼上開枝散葉，也把采集和狩獵的固有天性帶到了世界各地。在那個時候，還壓根看不出我們這些身材矮小、面相平凡的先祖會在日后成為整個地球的主宰。
然而，就像突然擁有了某種未知的魔力一般，差不多從一萬年前開始，在世界各地快樂采集和狩獵的智人先祖們，幾乎在一眨眼間就改變了賴以生存的生活方式。這些變化開啟了農業時代，也最終催生了今天建立在發電機、汽車、互聯網和生物技術基礎上的全新人類社會。而這一切變化的開端，就是祖先們對于遺傳規律的利用。
在賈雷德?戴蒙德的名著《槍炮、病菌與鋼鐵》中對此有著生動詳盡的討論。就在人類先祖走出非洲的必經之路上，地中海東岸生長著繁茂的野生小麥，它們的種子富含蛋白質和淀粉。不難想象，當生活在中東新月沃地的人類先祖們在偶然間發現這種植物后，一定會如獲至寶地將它們作為日常采集和儲藏的對象。對于先祖們來說，這和他們數百萬年來在非洲大陸的日常采集工作并無分別。
但是如果先祖們想要把這些野生小麥挖出來，為他們提供穩定的食物來源，就會遇到一些棘手的問題。野生小麥的麥穗會在成熟后自動從麥稈上脫落，將種子盡力播撒到周圍的泥土里。這是這些禾本科植物賴以生存繁衍的性狀之一，但這也使得人類先祖想要大規模收獲小麥種子變得非常困難。后來，在某個不知名的具體年代，生活在中東地區的遠古居民們無意間發現了一些遺傳變異小麥。這些小麥的麥穗即便成熟以后，也不會自動脫落。
泛生子的概念
從理性高度思考遺傳本質
很容易想象，如果這些變異小麥出現在野外，我們只有死路一條。因為它們完全無法通過脫落的麥穗散播自己的后代。但這些變異植株對于我們的先祖們來說卻無比珍貴，因為這樣的遺傳突變小麥會大大方便他們在固定時間大批收割麥穗、儲存麥粒！更要緊的是，先祖們一定也在無意間發現了遺傳的秘密―種瓜得瓜，種豆得豆，因此這些仿佛是上天賜予般的神奇的小麥種子，也將會頑強地保留這種對人類先祖而言―而不是對小麥自身，極其有利的性狀。所以我們可以想象，先祖們可能會將這些奇怪的植物小心移植到村莊周圍，用心呵護，直到收獲第一批成熟的種子。這些種子將成為下一年擴大種植的基礎。就這樣，伴隨著一代代人類先祖們的細心發現、栽培和收獲，符合人類需要的優良性狀被保留了下來，一直保留到今天。這些無意間發現的遺傳突變小麥，可能標志著人類農業社會的開端。
最早從理性高度思考遺傳本質的，是同樣生活在地中海邊的古希臘人。在古希臘哲學家德謨克利特和希波克拉底看來，遺傳現象必然有著現實的物質基礎，不需要用虛無縹緲的神來解釋。在他們的想象里，遺傳的本質是一種叫作“泛生子”的微小顆粒。這種肉眼不可見的顆粒，在先輩的體內無處不在，忠實記錄了先輩從形態到性格的各種性狀，并且會在過程中進入后者體內。以泛生子顆粒承載的信息為藍圖，子代得以表現出對先輩們的忠實模仿。
必須承認，泛生子的概念本身，其實并沒有解決任何實際問題。或者刻薄點說，這只是把人們習以為常的遺傳現象用一個聽起來晦澀難懂的名詞概括了出來而已。但是這個從現象到概念絕非毫無用處。至少，借用這個概念，人們可以把許多看起來很不一樣的現象聯系起來。
例如，無性生殖―微小的細菌和酵母能夠一分為二產生兩個后代；有性生殖―雌雄家畜后會產生出一群嗷嗷待哺的小崽兒；甚至還包括果樹的嫁接―為什么果樹嫁接后的果實會帶有接穗和砧木的共同特征，不就是因為泛生子顆粒能夠從砧木毫無障礙地流動到接穗里面去，和接穗的泛生子合二為一嘛。
因此，這個生命力頑強的概念從古希臘時期一直流傳到了近代。甚至在19世紀中期，在達爾文創立進化論，為地球生命和人類的起源找到科學解釋的時候，他仍然借用泛生子的概念作為自然選擇理論的遺傳基礎。
進化論遭到的批評
宗教人士的攻擊與嚴肅的科學批評
在達爾文看來，一個生物個體的所有器官、組織乃至細胞，都磧兇約鶴ㄊ艫姆荷子顆粒。手的泛生子記錄著每個動物的手掌大小、寬窄、掌紋乃至毛發的生長位置，眼睛的泛生子當然少不了記錄眼睛的大小、虹膜的顏色等。在的過程中，來自父母雙方的泛生子融合在一起，共同決定了后代們五花八門的遺傳性狀。
更要緊的是，泛生子攜帶的生命藍圖一旦出錯，就會導致后代遺傳性狀的“突變”，而這些突變，就是達爾文進化論中自然選擇和適者生存的物質基礎。正是因為有突變，一代代生物個體才會具有微小但能夠穩定遺傳的差異，而這些遺傳差異影響著生物個體在環境中生存和繁衍的能力，并最終導致適者生存。
達爾文的進化論在誕生后遭到了猛烈攻擊，特別是在宗教界人士和虔誠的信徒們看來，達爾文的學說褻瀆了人類萬物之靈的神圣性，也把傳說中按照自己的模樣造人的上帝置于可有可無的尷尬地位。但很少有人知道的是，進化論同樣遭遇了嚴肅的科學批評。熱力學創始人之一、物理學家開爾文勛爵當時估算出地球的年齡至多不會超過一億年，而這點時間遠遠不夠積累出達爾文進化所需要的五花八門的遺傳突變（當然，后來人們意識到地球的年齡遠大于此）。
古生物學家們對此發出了詰難，按照進化論，地球上必然存在許許多多物種之間的中間形態，但是它們的化石又在哪里呢？有一個批評可能是最致命的，因為它聲稱發現了進化論和遺傳融合理論的深刻矛盾，換句話說就是，達爾文辛辛苦苦為進化論找到的遺傳基礎，可能根本不支持進化論的聲明！這一批評來自蘇格蘭工程師、愛丁堡大學教授亨利?弗萊明?詹金。他評論說，按照達爾文的進化論，生物的遺傳物質需要經歷漫長、微小的突變過程，才能產生足夠顯著的形狀變化，最終造就地球上千萬種五花八門的物種。
新書速遞
冷暴力
作者：[法國]瑪麗-弗朗斯?伊里戈揚
出版社：后浪丨北京聯合出版公司
出版日期：2017年6月
定價：38.00元
本書首次提出了“精神虐待”這一概念，它廣泛發生在婚姻、家庭和職場中，施虐者通過拒言語歪曲、諷刺、嘲笑、輕蔑、否定人格等常用手段來欺凌、控制受虐者，使這種關系持續下去，讓受虐者無法逃脫。
日本新中產階級
作者：[美國]傅高義
出版社：上海譯文出版社
出版日期：2017年5月
定價：60.00元
傅高義在學術生涯之初被斥為“鄉下人”后，意識到一個社會學家如果從未在另一種文化中生活過，何談理解本國社會？1958年至1960年，他來到東京市郊展開田野研究，描寫日本社會快速變遷之際的“新中產階級”―工薪族和他們的家庭。此書是他的成名作。
外婆的道歉信
作者：[瑞典]弗雷德里克?巴克曼
出版社：天津人民出版社
出版日期：2017年5月
基因剪刀修飾細胞
一歲的蕾拉?理查茲患有復發性急性淋巴細胞白血病，是一種難以治愈的白血病。盡管藥物化療能治愈一些白血病，但化療對于復發性急性淋巴細胞白血病還是束手無策。此前，蕾拉已經接受過化療，但效果不佳，只能用姑息療法維持生命。在走投無路之時，大奧德蒙街醫院向蕾拉的父母提議可以試用新的基因療法，而且，這種療法已經在小鼠身上進行過試驗，效果較好。
為了挽救女兒的生命，蕾拉的父母同意了。蕾拉的父母熱衷于嘗試新療法，蕾拉的媽媽莉莎說：“我們不想接受姑息治療，所以我們要求醫生為我們的女兒嘗試任何治療，哪怕是以前沒有嘗試過的。”而且，治療方案也經過了醫學倫理委員會批準，并且由掌握這一特定基因修飾方式的法國Cellectis生物科技公司提供經過基因修飾的T細胞。
由于蕾拉患復發性急性淋巴細胞白血病，體內正常的免疫T細胞已經很少，因此需要利用他人（供體）捐贈的健康T細胞。在利用之前，要對供體T細胞進行基因修飾，即用一種基因剪刀――轉錄激活因子樣效應物核酸酶（TALEN）向健康的供體T細胞添加新的基因，將它們武裝起來對抗白血病。
TALEN是一種可靶向修飾特異基因序列的酶，它借助于TAL效應子（一種由植物細菌分泌的天然蛋白）來識別特異性DNA堿基對。TAL效應子可被設計來識別和結合所有的目的DNA序列。對TAL效應子附加一個核酸酶就生成了TALEN。TAL效應核酸酶可與DNA結合并在特異位點對DNA鏈進行切割，從而導入新的遺傳物質（基因）。此前，TALEN的特異性切割活性在酵母、擬南芥、水稻、果蠅及斑馬魚等多個動植物體系和體外培養細胞中得到驗證。
利用TALEN對供體T細胞中的特定基因進行切割后會呈現兩種效應。一是治療白血病的藥物不能損傷和殺滅基因修飾的T細胞，二是這種被修飾的T細胞被重新編程，因此，輸入蕾拉的體內只是去殺滅其體內病變的白細胞。這種被修飾的T細胞稱為UCART19細胞。
UCART19細胞由Cellectis公司研發，大奧德蒙街醫院的研究人員通過靜脈注射，用10分鐘的時間把1毫升的UCART19細胞注入了蕾拉的血流中。然后對蕾拉進行隔離，讓她不受感染，因為蕾拉的免疫系統非常虛弱。幾周后，蕾拉體內的白血病細胞就明顯消失。
然而，這并非是治療的結束。輸入的UCART19細胞只是殺滅了蕾拉體內的白血病細胞，下一步還需要接受骨髓移植來重建蕾拉被治療摧毀的整個造血和免疫系統。不過，經檢查，蕾拉的骨髓細胞是健康的，血細胞計數也在恢復正常。未來就是要找到一位配型相同的供者，由其提供健康的骨髓，移植到蕾拉體內以重建蕾拉的造血系統和免疫系統。所以，僅從蕾拉是白血病基因療法世界第一例看，也不過是基因剪刀治療白血病的第一步成功，或成功了一半，即把患者體內的白血病細胞清除掉。
多種基因剪刀治療多種疾病
在利用UCART19細胞治療白血病之前，采用另一種基因剪刀――鋅指核酸酶（ZFN）治療艾滋病也獲得了初步成功。
ZFN又名鋅指蛋白核酸酶，并非自然存在，而是一種人工改造的核酸內切酶，由一個DNA識別區域和一個非特異性核酸內切酶構成，其中DNA識別區域有特異性，在DNA特定位點結合，而非特異性核酸內切酶有剪切功能，兩者結合可在DNA特定位點進行定點切割。
美國加利福尼亞州Sangamo生物科學公司用ZFN對供體T細胞進行基因修飾，對T細胞上一個基因刪除和滅活，這個基因編碼的蛋白就是艾滋病病毒（HIV）進入T細胞的結合靶分子，即T細胞受體CCR5δ32。ZFN修飾CCR5δ32基因可使其縮短，并導致其有名無實，HIV就難以識別這個T細胞的蛋白分子（大門），從而無法入侵T細胞，由此可以治療艾滋病。
2014年，Sangamo公司的費奧多?烏爾諾夫研究小組對12名艾滋病患者試驗，輸入經過基因編輯的健康供者的T細胞，有效地抑制了HIV入侵T細胞，有6名患者停止服用抗HIV的藥物，說明這種基因編輯療法初步體現了效果。由于有了初步結果，現在Sangamo公司正在擴大試驗，對70多名艾滋病患者試驗這種基因編輯療法。
受到這種基因編輯療法治療結果的鼓舞，Sangamo公司還在擴大基因療法的戰場。2015年10月，烏爾諾夫研究小組報告了他們用ZFN對猴子試驗治療血友病的結果。研究人員對15只猴子注射攜帶編碼ZFN基因和凝血IX因子基因的病毒，以治療血友病。白蛋白是肝臟大量合成的血液蛋白，ZFN能切割基因組中編碼白蛋白的基因，并將一個健康的凝血IX因子基因導入基因組中。結果發現，猴子肝臟開始制造更多凝血IX因子，血液中凝血IX因子增加10%。
烏爾諾夫認為，利用ZFN和TALEN基因剪刀可以治療多種疾病。例如，白蛋白基因類似人類基因組的一個USB接口，在這個位置也可利用ZFN或TALEN基因剪刀插入其他基因以治療疾病。
不過，Sangamo公司利用基因剪刀治療血友病還未取得美國食品與藥物管理局（FDA）的許可證。2015年9月美國國立衛生研究院（NIH）一個委員會同意開展基因編輯治療的臨床研究，并可能對凝血IX因子基因治療開綠燈?，F在Sangamo公司已經向FDA提出申請，如果獲得FDA批準，臨床試驗可望在2016年展開。
無論是利用ZFN，還是TALEN基因剪刀治療疾病，目前還只是在對T細胞的某種基因進行編輯、刪除以治療疾病，是一種間接的基因療法。更為直接的用基因剪刀切除致病基因的療法也在試驗之中，這就是名為CRISPRCas的基因剪刀。
CRISPR的全稱是，成簇的規律性間隔短回文重復序列，Cas則是指與CRISPR相關的基因。CRISPRCas技術是繼ZFN、胚胎干細胞（ES）打靶和TALEN等基因編輯技術后用于定點剪切、敲除特定基因的第四種方法，不僅可以用于治療疾病，還可能修改胚胎，創造新的物種，甚至創造“超人”。
現在，CRISPRCas治療疾病的一個試驗是治療β地中海貧血。美國加州大學舊金山分校的簡悅威教授及其同事在2014年8月5日的《基因組研究》發表文章稱，他們嘗試用CRISPRCas治療β地中海貧血獲得初步成功。β地中海貧血是由HBB基因突變引起的，會造成嚴重的血紅蛋白缺乏。全球每10萬人中有1人受到這種疾病的影響，目前還沒有能夠治愈β地中海貧血的辦法。
研究人員先將β地中海貧血患者的皮膚細胞（成纖維細胞）轉變為誘導的多能干細胞（iPSC），然后利用CRISPRCas編輯技術來糾正HBB特殊位點的DNA序列，即切割雙鏈DNA中HBB突變位點。然后，細胞自身會通過同源重組用正確的核苷酸序列修復DNA。經過基因校正HBB突變之后的誘導的多能干細胞沒有檢測到脫靶效應，細胞保持著完全的多能性，核型也很正常。
之后，研究人員把這些誘導的多能干細胞分化為紅細胞，結果紅細胞的HBB表達恢復正常。不過，要將CRISPRCas編輯技術真正用于臨床治療β地中海貧血，還有較長的路要走。
一、CRISPR的發展歷程
1985年，日本大阪大學學者發表堿性磷酸酶基因的研究性篇論文，該發現涉及編碼基因附近存在的小的DN段.之后有三個獨立的生物信息學團隊作出報告，他們的研究均暗示CRISPR在微生物免疫中有可能發揮了作用，他們在報告中指出了間隔區DNA與噬菌體的基因序列通常高度匹配.2007年，科學家通過研究發現，添加或刪除和噬菌體DNA相匹配的間隔區DNA會改變嗜熱鏈球菌對噬菌體攻擊的抵抗力，這是對間隔區DNA功能的巨大突破.2011年科研工作者開始嘗試解析各種與CRISPR相關的蛋白質的功能，最終分離出了Cas9蛋白質的CRISPR系統，這一發現為研究間隔區DNA如何在細菌的免疫防御中發揮了關鍵作用.2013年初，《Science》雜志公布了兩項最新研究成果，首次證明了Cas9 核酸酶可以對小鼠和人類細胞進行有效的編輯，是更為安全的哺乳動物細胞基因組編輯的新方法.如今，科研工作者能夠通過設計gRNA，靶向包括果蠅、斑馬魚、小鼠、大鼠和人類等在內的許多物種的基因組中的幾乎任何堿基序列，實現真正的基因工程的遺傳編輯.
CRISPR系統從初發現到2013年的系統建立實現了在多個物種中的應用，并將在更多的物種中得到應用.
二、CRISPR的工作原理
雖然科學家到目前為止還沒有完成弄清楚CRISPR-Cas/Cas9 系統的詳細作用機制， 但已基本明確了該系統的作用過程.目前大家比較公認的該系統的作用機制大體可分為以下3個不同的階段，如圖2.
噬菌體侵入宿主時，首先產生編碼蛋白，這個過程由Cas/Cas9基因完成.編碼蛋白產生后靶向調節間隔序列.此后，基因組中被靶向的間隔序列被剪切，整合到宿主基因組的5′端.短的參入間隔序列被轉錄為crRNAs.最后，在CAS蛋白復合物的參與下，靶向干擾噬菌體的基因組序列.
三、Cas9的應用優勢
雖然CRISPR/Cas9被發現的歷史并不長，但其在工業和學術領域方面的應用已經非常的廣泛.
首先，CRISPR/Cas9的特性被用于不同菌株分類.由于Cas9蛋白的來源是細菌來源，所以要使得Cas9蛋白在不同動物細胞核內高效轉運，需要在蛋白上添加真核細胞的核定位序列.科學家通過改造Cas9使得多系統都能夠進行CRISPR/Cas9應用.
此外，相比于遺傳學中常用的ZFN和TALEN兩種人工核酸酶，CRISPR/Cas9憑借其可以造成特異性的單鏈切口，激活細胞的同源重組機制的特點因而具有極大的優勢.同時，對CRISPR/Cas9進行多個位點修飾方法，實現大片段缺失的突變改造機制.這就為困擾人類多年的遺傳疾病的治療帶來了一線曙光.通過科學家的努力，CRISPR/Cas9系統已經能夠精確編輯小鼠和大鼠基因組特定的基因位點，目前已經成功應用于大小鼠基因的敲除和過表達的模型制備.Cas9在科研工作中的突破性貢獻，為無數科學工作者提供了敲除的平臺以便更好的研究.
教科書上已經對1997年體細胞克隆多利羊的報道做出了“突破性進展”的評述.然而轉基因動植物由于技術和輿論壓力仍然不為所有人接受.而如果充分利用CRISPR/Cas9介導的基因組編輯技術，則有可能使這一局面得到改觀.比如有科研小組利用CRISPR/Cas9系統定點修飾豬等家畜的基因組，通過CRISPR/Cas9修飾影響家畜生產的基因單核苷酸多態性，從而可以提高豬肉瘦肉率、綿羊肌肉含量等.此外，CRISPR/Cas9在干細胞研究中也有著應用.
四、Cas9獲得的榮譽
新技術CRISPR/Cas9，被稱為“DNA 剪刀”或“基因剪刀”.這項科研的重要意義在于可以為人類的健康謀福祉.自 2012年6月首度亮相之后，獲得了許多科學家的認可，在數個國際會議上備受推崇，為基因治療和遺傳疾病的研究拓展了思路，提供了全新的治療策略.眾所周知，人類有許多疾病，例如鐮刀型細胞貧血癥、糖尿病、愛滋病、抑郁癥等，都與基因有關.人們廣泛利用 Cas9技術，從基因的源頭上探究這些疾病發病的根源，嘗試找出新的標靶藥物，達到治愈疾病的目的.新技術CRISPR/Cas9甚至還可以應用于改造酵母菌，讓其來生產生物燃料，從而緩解人類的能源危機；應用于改造小麥，使其能抵抗害蟲和干旱天氣，緩解人類的糧食危機.美國著名教授 Jonathan Weissman 稱：“ CRISPR/Cas9技術徹底改變游戲規則，現在我們可隨意啟動或關閉遺傳因子.”
關鍵詞：反義RNA；RNA干擾；ZFN；TALEN；CRISPR-Cas系統
中圖分類號：Q78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）08-1405-08
DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2017.08.002
Research Progress on Loss of Gene Function Technologies
NING Hui-yua，b，LIU Caia，b，ZOU Hua-wena，b
（a.College of Agriculture；b.Hubei Collaborative Innovation Center for Grain Industry，Yangtze University，Jingzhou 434025，Hubei，China）
Abstract： Loss of gene function technology is one of the most important and efficient methods to study gene function at present. Now main widely used loss of gene function technologies are anti-sense RNA， RNA interference，ZFN，TALEN，CRISPR-Cas nucleases technology and so on. Those technologies aim to inhibiting or turning off the expression of the target gene， researching the change of the biological phenotype， and thus their related functions were speculated. In the practical studies， loss of gene function is always along with gene overexpression， providing the most direct evidence for gene function research， which was widely used in biology， medicine， agriculture and other fields. This paper systematically introduces the developing history， technological principles and application of some common loss of gene function technologies， and the protest of their future research and application is introduced.
Key words： anti-sense RNA； RNA interference； ZFN； TALEN； CRISPR-Cas nucleases
20世o50年代DNA雙螺旋結構的發現，標志著人們對生命科學的研究進入了分子生物學時代。隨著后基因組時代的到來，基因組學的研究重心從揭示生命的所有遺傳信息結構、組成等轉移到對功能的研究上。除了傳統的轉基因（基因過量表達）外，定向抑制或完全消除特定基因的表達也是目前研究基因生物學功能的重要手段。因此，出現了反義RNA、RNA干擾等技術。隨著研究技術手段的發展，近年來又興起了ZFN技術、TALEN技術、CRISPR-Cas系統等基因功能修飾技術。這些技術不斷被發現及應用，極大地促進了生物學研究的發展。本研究主要對基因功能缺失技術發展歷程、技術原理及應用等方面進行概述。
1 反義RNA技術
反義RNA是指與靶RNA（多為mRNA）具有互補序列的RNA分子，它通過與靶RNA進行堿基互補配對的結合方式影響mRNA的后續翻譯過程。反義RNA最早在原核生物E.coli的產腸桿菌素的Col E1質粒中發現[1]。隨后發現在真核生物中也存在天然的反義RNA，特別是發現了人工構建的反義寡核苷酸在真核生物中具有生物學效應以來，反義RNA技術已成為一種直接有效的人為控制基因表達的方法，并且倍受生物學界關注。
1.1 反義RNA作用機理
反義RNA主要通過與靶RNA以堿基互補配對的方式結合，參與基因表達調控。其作用機理為：①在DNA復制水平上。反義RNA通過與DNA復制時的起始引物RNA結合，阻止RNA引物與模板DNA的結合，抑制DNA的復制。②在轉錄水平上。反義RNA可以直接與mRNA5′端互補，阻止轉錄。③在翻譯水平上。反義RNA通過與mRNA上的特定序列互補配對而結合。結合位置包括起始密碼子AUG、靶mRNA的非編碼區、原核生物的SD序列以及真核生物的mRNA5′端，從而直接或間接地抑制mRNA的翻譯[2]。
1.2 反義RNA技術的應用
目前，反義RNA技術作為一種重要的基因調控手段，在植物、病毒、細菌中得到廣泛應用。在植物中最顯著的應用是果實成熟的控制?？茖W家通過控制乙烯合成途徑中的關鍵酶來限制乙烯的合成，從而達到控制果實成熟的目的[3]。Oeller等[4]利用反義RNA技術抑制ACC合成酶的活性，使果實內的乙烯含量被抑制了99.5%。這為果實的貯藏、加工、運輸等提供了新方法。
反義RNA技術在植物抗病方面也得到了很好的應用。植物病毒是影響植物生長的重要因素之一。由于DNA病毒和RNA病毒在復制和表達的過程中都要經歷RNA生物合成階段，這為利用反義RNA技術進行抗病毒研究提供了理論依據。Nelson等[5]利用TMV 5′端的基因片段作為目的基因，成功構建了反義基因并獲得了表達反義基因的轉基因煙草植株。試驗結果表明，病毒RNA和后代病毒的合成被抑制了25～50倍，病毒侵染癥狀大量減少甚至消失，并且該抗病毒性狀可穩定遺傳。
由于抗生素的濫用，細菌的耐藥性越來越強。為了能夠快速、簡便獲得新的抗菌藥物，反義RNA技術被應用到藥物篩選模型上。2006年科學家在金黃色葡萄球菌體內誘導表達出了針對單功能脂肪酸合成酶FabF的反義RNA，并構建了反義工程菌。研究發現，構建的反義工程菌對FabF（Fatty acidbiosynthesis geneF）的特異性抑制劑非常敏感，通過藥物篩選獲得了能夠有效抑制MRSA（Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus）和VRE（Vancomycin-Resistant Enterococci）的新型抗生素平板霉素[6]。因此，可利用反義RNA技術尋找新型抗生素解決細菌耐藥性的問題。
1.3 反義RNA技術的優缺點
隨著研究的不斷深入，人們對反義RNA技術也有了比較成熟的認識。與傳統的基因敲除技術相比，反義RNA技術具有許多的優越性。①反義RNA技術操作較簡單，適用范圍廣泛。通過靶mRNA的序列就可以合成所需的反義RNA，可用多個反義RNA同時阻斷多個基因的表達。②特異性強[7]。反義RNA技術可以有選擇性的迅速抑制目的基因的表達。該技術不會對蛋白質產生完全抑制，從而能避免致死突變，對細胞的正常生長影響較小。③安全性高[8]。導入細胞的反義RNA不能被翻譯產生蛋白質，因此該技術在基因工程上的應用具有很大的安全性。
眾多的因素限制了反義RNA的發展。主要包括：①成本較高。②靶基因定位困難。由于高等生物的基因組復雜，對特殊基因的靶向定位很困難。③使用效率問題。反義RNA的堿基序列、含量、靶序列結合部位和濃度等都會影響其使用效率[9]。
2 RNA干擾技術
RNA干擾（RNA interference，RNAi）是指與靶mRNA存在同源互補序列的雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）在細胞內特異性地降解靶mRNA的一種基因轉錄后沉默現象[10]。這一現象在自然界中廣泛存在，是生物體在進化過程中形成的一種進化上保守的用來抵御外來基因或外來病毒侵犯的防御機制。
1990年Napoli等[11]將查爾酮合成酶CHS基因轉入到牽?；ㄖ校噲D獲得開出深紫色花朵的牽?；ǎY果卻得到了白色和斑片狀花朵，即轉入的CHS基因和與該基因同源的色素基因的表達均受到抑制，將這種現象稱為轉錄后基因沉默 （Post-transcriptional gene silencing）或者共抑制（Co-suppression）。1994年Cogoni等[12]分別將外源基因albino-1和albino-3轉入粗糙脈孢菌（Neurospora）中，也出現了與植物共抑制相同的轉錄后基因沉默現象，將其稱為基因壓制（Gene quelling）現象。1995年Guo等[13]發現將秀麗新小桿線蟲（Caenorhabditis elegans）par-1基因的正義鏈RNA和反義鏈RNA分別注射到線蟲體內均會抑制par-1基因的表達，但當時的理論無法解釋這一現象。直到1998年Fire等[10]才解釋了這一現象，即RNAi是由于dsRNA引起的轉錄后序列特異性基因沉默，并將其命名為基因沉默（Gene silencing）。
2.1 RNA干_作用機理
RNA干擾作用機理可分為3個過程：siRNA的形成、靶mRNA的降解、RNAi的形成。①siRNA的形成[14]。細胞質中的內源性或外源性的長dsRNA首先與Dicer酶結合，形成Dicer-dsRNA復合物，在Dicer酶的RNase的作用下，長dsRNA被特異性地裂解為21～23 nt siRNA。其5′端為磷酸基，3′端為羥基且含有2個突出的黏性末端。②靶mRNA的降解。siRNA在解旋酶的作用下解鏈，形成正義鏈和反義鏈，其中的反義鏈可指導形成RNA誘導的沉默復合體（RISC）[15]。在siRNA的引導下，RISC通過堿基互補配對的方式識別具有同源序列的靶mRNA并進行剪切，其剪切位點為與siRNA反義鏈互補的第1個核苷酸下游的11或12個核苷酸處，然后降解靶mRNA。③RNAi的形成。在RNA依賴性RNA聚合酶（RdRP）的作用下，以靶mRNA為模板，siRNA為引物，合成dsRNA。合成的dsRNA在Diser酶的作用下，又產生新的siRNA，如此循環多次，可以使RNAi的作用進一步放大。因此，少量的siRNA可以產生高效的基因沉默效應[16]。研究還發現siRNA除了能導致轉錄后基因沉默，還可指導DNA甲基化酶與DNA的特定部位結合，引發該特定部位DNA中的胞嘧啶甲基化，導致轉錄水平的基因沉默[17]。
2.2 RNA干擾技術的應用
雖然人們對RNA干擾的研究只有短短的十幾年時間，但發展卻極為迅速，在生物醫學等領域得到廣泛應用。①疾病治療上的應用。RNA干擾作為一種基因敲除技術，在腫瘤、病毒感染、遺傳病治療方面得到了廣泛應用。An等[18]利用RNA干擾技術構建了卵巢癌OVCAR3細胞IGF-IR基因的siRNA表達質粒，通過脂質體法轉染到人的卵巢癌OVCAR3細胞中，研究發現IGF-IR基因的siRNA能顯著抑制其mRNA及蛋白質的表達，并且還能抑制OVCAR3細胞的增殖。RNA干擾技術為疾病在基因領域的治療提供了新方法。②作為基因研究的新工具。由于RNA干擾能特異性的抑制目的基因的表達，根據其表型等的改變可以分析基因的功能，因此是研究基因功能的一種有效的手段[19]。Yu等[20]通過構建cyclin D1基因的siRNA表達質粒，研究cyclin D1基因對疤痕疙瘩成纖維細胞的細胞增殖和細胞周期的變化。③RNA干擾技術還被廣泛應用于信號傳導通路的研究。通過和傳統的缺失突變技術結合，RNA干擾技術可以很容易確定復雜信號傳導途徑中不同基因的上下游關系[21]。Jin等[22]利用RNAi技術發現argonaute-1在FMRP參與神經元發育和突觸生長過程中起重要作用，證明FMRP能調節信號通路。④藥物的開發與應用。RNA干擾可作為尋找和鑒定新藥物靶標的工具。利用RNA干擾技術可以明顯縮短從鑒定到認識藥物靶基因功能的時間，有助于藥物開發過程中對已知靶基因功能的高通量分析[23]。Duff等[24]利用RNA干擾技術能降低蛋白轉移酶9（PCSK9）的表達量，研究發現PCSK9表達量的降低能明顯降低小鼠血清膽固醇水平，說明沉默PCSK9可成為治療高膽固醇的藥物靶點。
2.3 RNA干擾技術的優缺點
RNA干擾技術具有以下特點：①高效性。RNAi存在級聯放大效應。siRNA在Diser酶的作用下，以靶mRNA為模板可以產生新的siRNA，如此循環多次，可以使RNA干擾的作用進一步放大。因此，少量的siRNA可以產生高效的基因沉默效應。②特異性。siRNA與靶mRNA通過堿基互補配對原則進行結合，只特異性的誘導靶mRNA的降解。研究表明，即使是一個堿基的錯配，也會影響靶mRNA沉默效率[25]。對mRNA前體幾乎沒有影響，以內含子或啟動子構成的dsRNA也不產生RNA干擾現象。③可傳播和可遺傳性。RNA干擾效應可以在不同細胞間進行傳遞，并且可以傳遞到下一代。Fire等[10]通過將dsRNA注射到線蟲體內，發現dsRNA可以擴散到其他細胞中，并且在下一代也表現出了RNA干擾現象。
目前，對RNA干擾的研究仍處于初級階段，還有許多問題亟待解決。主要包括：①存在脫靶現象。siRNA可以引起一些非靶基因的非特異性沉默或表達上調，抑制細胞的正常生長。②穩定性差。siRNA導入受體細胞后RNA干擾效應持續數天后便會消失。③載體的安全性問題。在臨床應用上，載體作為外來抗原可激活機體的免疫應答，使載體失活，甚至可能對機體造成嚴重的不良后果[26]。
3 鋅指核酸酶（ZFN）技術
1983年，鋅指蛋白（Zinc finger protein，ZFP）首次在非洲蛙蟾轉錄因子IIIA中被發現。隨著研究的不斷深入，人們對ZFP有了進一步的了解。1996年Kim等[27]將鋅指結構域與IIs型限制性核酸內切酶FokⅠ的切割結構域融合，獲得了具有識別特性的人工合成的核酸內切酶。隨后，Bibikova等[28]利用ZFN技術對爪蟾的卵母細胞開展外源DNA修復試驗，并取得成功。Bibikova等[29]又利用ZFN技術成功敲除了果蠅的一個內源基因。ZFN技術的應用實現了對基因的高效定點修飾，對研究基因的功能具有重要意義。
3.1 ZFN的結構及作用機理
ZFN是由鋅指蛋白（ZFP）結構域和核酸內切酶（FokⅠ）的切割結構域兩部分組成[27]。ZFP結構域主要負責識別并特異結合靶DNA序列。FokⅠ的切割結構域主要負責切割靶DNA。
ZFP結構域一般是由3～6個Cys2-His2型的鋅指結構域串聯組成，多個鋅指結構的串聯不僅可識別較長的靶DNA序列，還可以增加其修飾的特異性。每個鋅指折疊成α-β-β（C端-N端）型的二級結構[30]，其中的α螺旋可插入到DNA雙螺旋的大溝，α螺旋中的-1～+6位的7個氨基酸殘基（+4位通常為亮氨酸殘基）決定了對靶DNA識別的特異性[31]。每個鋅指蛋白可識別并結合一個三聯體密碼（圖1a）[32]。
FokⅠ是海床黃桿菌（Flavobacterium okeanokoites）表達的一種限制性內切酶，通過與ZFP的C端融合形成ZFN單體。FokⅠ的切割結構域必須形成二聚體才能發揮內切酶活性[33]。因此，在切割靶位點時，2個ZFN單體按照一定的距離和方向同各自的靶DNA鏈特異結合，2個FokⅠ切割結構域恰好可形成有活性的二聚體，在2個結合位點的間隔區（Spacer，通常為5～7 bp）切割DNA產生DSB切口。細胞再通過非同源性末端接合（NHEJ）或同源重組（HR）等方式對基因進行修復，改變靶DNA序列，從而達到基因敲除的目的[34]（圖1b）。構建能特異性識別靶DNA的ZFP結構域是ZFN技術的關鍵。因此，只需根據目的基因設計出鋅指結構域，再與FokⅠ融合形成ZFNs。然后將融合的ZFNs通^電穿孔、轉染及病毒運輸等方式導入細胞核中完成對靶基因敲除。
3.2 ZFN技術的應用
ZFN作為一種靶向修飾技術，可以精確地修飾基因及其周圍調控元件，在生物體基因組改造與基因功能研究等方面得到廣泛應用。ZFN已經成功應用于線蟲、大鼠、小鼠、中國倉鼠、果蠅、海膽、斑馬魚、家蠶、植物、豬及人類iPS細胞和ES細胞中[35]。主要包括以下兩方面：①對動植物基因組的靶向修飾。Bibikova等[29]利用ZFN技術對果蠅X性染色體的yellow基因進行定點修飾，結果發現50%的雄性果蠅發生顏色的改變。Zhang等[36]設計了針對敲除擬南芥ADH1和TT4基因的ZFN，通過雌激素誘導啟動子表達，研究發現T1代分別有7%和16%的植物含有體細胞突變，并且能穩定遺傳給后代。②疾病的治療。Li等[37]利用ZFN技術治愈了血友病B型小鼠，這為以后利用ZFN技術治療基因疾病提供了新的有效手段。
3.3 ZFN技術的優缺點
ZFN作為第一代人工核酸內切酶技術，打破了只能通過同源重組的方式對基因組進行改造的觀念。ZFN技術的優點包括：①與傳統的方法相比較，ZFN技術提高了基因組的編輯效率，操作簡單，可以快速敲除目的基因。②能夠廣泛地應用于各種生物，并誘導靶位點進行定點突變。
ZFN技術也存在著許多的局限性：①存在脫靶現象。由于ZFN對靶位點進行切割時容易脫靶，導致細胞代謝紊亂，從而對細胞產生毒副作用。②存在上下文依賴效應[38]。ZFN在識別靶DNA位點時，識別靶DNA的重復氨基酸之間會相互作用，導致識別的特異性發生改變，即識別靶DNA的特異性不高，影響基因打靶的效果。③成本高。由于ZFN的特異性不高，很難設計出高特異性的鋅指組合，目前該技術一直被生物公司壟斷。
4 轉錄激活子樣效應物核酸酶（TALEN）技術
1989年一類可以使植物患病的轉錄激活子樣效應蛋白TALE（Transcription activator-like effector）在黃單胞桿菌（Xanthomonas）中分離得到[39]。2007年Kay等[40]發現一種TALE蛋白（AvrBs3）可以被黃單胞桿菌注入到宿主細胞內，然后進入宿主細胞核，與宿主upa20基因的啟動子結合，激活宿主upa20基因的表達。2009年Moscou等[41]發現了TALE蛋白特異結合宿主基因啟動子的機制。隨著對TALE蛋白的深入了解，科學家發現TALE蛋白可以補足第一代人工合成的核酸內切酶（ZFN）技術的許多缺陷。2010年Christian等[42]首次報道了人工構建的TALEN技術。2011年Li等[43]用AvrXa7和PthXo1中天然存在的TALE重復序列進行了類似的試驗，發現FokⅠ結構域連接到TALE結構域的C端的切割效果好于連接到N端。2012年Deng等[44]通過解析TALE蛋白的晶體結構，清晰揭示了TALE蛋白結合DNA的作用機制，為以后更好改造和應用TALEN打下了基礎。
4.1 TALEN的結構及作用機理
TALEN是由TALE結構域和核酸內切酶（FokⅠ）的切割結構域兩部分組成[45]。與ZFN技術原理類似，TALE結構域主要負責識別并特異結合靶DNA序列，FokⅠ的切割結構域主要負責切割靶DNA。
TALE蛋白是由N端的具有分泌信號功能的易位結構域（Translocation domain，TD）、中部DNA特異識別結合域、C端核定位信號（Nuclear localization signal，NLS）和轉錄激活結構域（Activation domain，AD）4部分構成。其中，中部DNA特異識別結合域是由一系列數目不定的串聯重復單元組成。每個重復單元通常由34個氨基酸組成[46]，其中32個氨基酸是高度保守的，只有12位和13位上的氨基酸是可變化的，這2個氨基酸又被稱為重復可變雙殘基（Repeat variable diresidue，RVD）。每個重復單元只識別1個核苷酸，其識別的特異性由RVD決定，并且RVD可與4種堿基有特定的配對關系，即NI特異識別A，HD特異識別C，NG特異識別T，NH特異識別G，NN對應G或A[41，46]。研究發現，第12位氨基酸主要起穩定RVD環的功能，第13位氨基酸是真正識別特異堿基的氨基酸，決定識別的特異性[44，47]（圖2a）。
FokⅠ與TALE的C端融合形成TALEN。對靶DNA進行切割時，FokⅠ也需要形成二聚體發揮切割作用，當兩個TALEN分別結合到各自的靶DNA序列上時，2個FokⅠ會在靶DNA序列的間隔區（Spacer，14～18 bp）處形成二聚體[48]，并對靶DNA進行切割，形成DSB切口，進而引發細胞內的NHEJ和HR修復機制，導致基因沉默（圖2b）?？傊?，通過構建不同的TALE就可實現對不同靶DNA的切割。
4.2 TALEN技術的應用
TALEN技術的發明使得基因組編輯效率明顯提高，因此，在人、小鼠、大鼠、斑馬魚、水稻、擬南芥等物種中得到廣泛應用。①遺傳病治療方面的應用。科研人員利用TALEN技術對來源β-地中海貧血病人的非整合型iPSCs進行珠蛋白基因HBB修復，研究發現細胞在修復過程中沒有產生TALEN引發的脫靶突變并且這些修復好的iPSCs具有多能性及正常核型，表明這種方法可作為一種治療地中海貧血疾病的有效途徑[50]。②生物模型的構建。2014年中國科學家利用TALEN技術成功的敲除了食蟹猴基因。首次用該技術成功構建了非人類靈長類動物模型[51]。③新品種的培育。Li等[52]利用TALEN技術剔除掉了水稻基因組中對水稻白葉枯病敏感基因Os11N3，獲得了穩定遺傳的抗病水稻新品種。這也顯示出了TALEN技術介導的基因定點修飾在作物遺傳育種中具有廣闊的應用前景。
4.3 TALEN技術的優缺點
作為第二代人工合成的核酸內切酶技術，與ZFN技術相比，TALEN技術具有明顯的優勢。①與ZFN技術相比，TALEN篩選更為簡便，它不需要復雜的篩選過程，只需要簡單的分子克隆技術就可以獲得高效的TALEN。②脫靶現象減少，降低了對細胞的毒性。③切割位點的特異性強。
TALEN技術雖然有很多優點，但也存在許多不足。主要包括：①TALE蛋白較大，并且序列重復性很強，構建表達載體較為復雜[53]。一般由生物公司合成，r格較貴。②仍然存在脫靶現象。③一對TALEN只能對一個靶基因進行修飾。當對多個基因同時進行編輯時，需要共轉染多個TALEN載體，這樣會導致轉染效率下降，很難獲得所需的陽性細胞[54]。
5 CRISPR-Cas核酸酶（CRISPR-Cas RGNs）技術
1987年Ishino等[55]首先在大腸桿菌的堿性磷酸酶基因下游發現了成簇的短間隔重復序列，但該序列當時沒有引起人們的足夠重視。隨著研究的不斷深入，發現大約40%的細菌和90%的古生菌都存在這種成簇的短間隔重復序列。2002年這種成簇的短間隔重復序列被命名為串聯間隔短回文重復序列[56，57]（Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，CRISPR）。此外，在CRISPR位點附近還存在著多個與CRISPR相關的Cas（CRISPR-associated genes）基因。隨后的研究又發現，CRISPR中的間隔序列與質?；蚴删w等外源DNA序列高度同源。當病毒入侵宿主細胞時，細菌和古細菌中的CRISPR序列就能夠引導CRISPR相關（CRISPR-associated，Cas）蛋白使外源DNA降解，從而起到免疫保護的作用[58]。
5.1 CRISPR-Cas系統的結構及作用機理
CRISPR-Cas系統主要是由CRISPR序列元件和Cas基因家族蛋白組成[59]。目前，CRISPR-Cas系統一般被分為3種類型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。Ⅰ型和Ⅲ型系統在介導靶DNA雙鏈降解時需要多種Cas蛋白的參與，而Ⅱ型CRISPR-Cas系統只需要Cas9就可完成對靶DNA雙鏈的切割[60]。通過比較，Ⅱ型CRISPR-Cas系統更為簡便，更適合應用于基因編輯。目前，CRISPR-Cas技術主要是Cas9系統的應用，本研究將對CRISPR-Cas9系統進行闡述。
CRISPR序列元件主要是由一個前導序列（Leader）、多個重復序列（Repeats）及多個間隔序列（Spacers）組成，其中重復序列和間隔序列以相互交替的方式連接（圖3）。前導序列是一段富含AT，長度為550 bp的不保守序列，位于CRISPR的上游，可啟動CRISPR序列轉錄；重復序列是一組長度為23～50 bp，平均長度為31 bp的高度保守的短小序列；間隔序列為來源于噬菌體、質粒等的平均長度為36 bp的外源基因片段即原間隔序列（Protospacers）[61]。Cas9是一個多結構域蛋白，主要由α-螺旋組成的識別區（REC）、位于蛋白中間位置的HNH核酸酶結構域、 位于氨基末端的RuvC-like結構域以及位于C端的PAM結合區組成[62]。
CRISPR-Cas9系統[63]的作用機理可分為3個階段：①可變間隔序列的獲得[64]。CRISPR-Cas9系統能夠識別外源核酸中的特殊片段，該特殊片段中存在原型間隔序列毗鄰基序（Protospacer-associated motif，PAM），并將PAM旁的原型間隔序列加工整合入自身基因組中的CRISPR序列中。②crRNA（CRISPR-derived RNA）的形成[60]。在前導序列的啟動下CRISPR轉錄產生前體CRISPR RNA（pre-CRISPR RNA，pre-crRNA），隨后CRISPR轉錄產生的tracrRNA（trans- activating crRNA）與pre-crRNA形成RNA異二聚體，在Cas蛋白的作用下，pre-crRNA被加工成crRNA。③對外源DNA的切割[64]。成熟的crRNA、tracrRNA及Cas9結合形成一個三元的沉默復合物。而后在crRNA的引導下由Cas9蛋白對目的基因進行切割。在切割時Cas9蛋白的HNH能夠特異性識別與crRNA互補配對的模板鏈并對其切割，切割位點位于PAM上游3 nt處；RuvC-1ike參與另一條鏈特定位點的切割，切割位點位于PAM上游3～8 nt處（NGG位點）[65]。Cas9蛋白對外源DNA進行切割后也會產生DSB切口，并通過NHEJ和HR的方式進行修復[66]（圖4）。因此，通過設計不同的crRNA可以使CRISPR-Cas9剪切不同的DNA序列。Jinek等[67]將成熟的crRNA和tracrRNA這兩種RNA構建成一個向導RNA（single-guide RNA，sgRNA）與Cas9融合，發現由sgRNA和Cas9蛋白構成的新CRISPR-Cas系統仍可對目的基因進行切割。所以，可將CRISPR-Cas9系統簡化成Cas9蛋白與sgRNA。
5.2 CRISPR-Cas系統的應用
目前，CRISPR-Cas系統的應用仍處在初級階段，但在基因功能的研究、模式生物的構建、遺傳育種等方面得到廣泛應用。①在基因功能研究中的應用。與傳統的基因敲除技術相比，CRISPR-Cas系統能夠對多種細胞及生物體的目的基因進行高效快速的敲除，是研究基因功能的重要工具。Shalem等[68]構建了一個含有65 000種sgRNA的文庫，這些sgRNA可以靶向人類基因組中18 080種基因，幾乎涵蓋了每個已知的基因。并將編碼這些sgRNA的基因和編碼Cas9蛋白的基因一起轉運到人類細胞中，從而篩選出具有特定功能的基因。②動物模型的構建。2013年Wang等[69]在小鼠的胚胎干細胞中使用CRISPR-Cas9系統，對Tet1、Tet2、Tet3、Sry和Uty-8這5個基因進行同時編輯，產生了基因敲除新個體。這為研究基因家族成員的功能相關性提供新方法。③新品種的改良與培育方面的應用。Shan等[70]利用CRISPR-Cas9技術去掉了一個小麥基因，得到了耐白粉病的小麥新品種。還利用CRISPR-Cas9技術定點突變了水稻和小麥兩種作物的OsPDS和TaMLO基因，發現原生質體中基因突變效率為14.5%～38.0%，水稻轉基因植物中突變效率4.0%～9.4%，并且在T0代獲得了水稻純合PDS突變體，呈現預期的白化和矮小表型。
5.3 CRISPR-Cas系統的優缺點
作為第三代人工合成的核酸酶，與ZFN技術和TALEN技術相比具有明顯的優勢。主要表現在：①CRISPR-Cas系統的切割能力更強。CRISPR-Cas系統可以切割一些ZFN和TALEN不能接近的位點[71]。②操作更為簡便，試驗周期更短，成本更低。突變不同的靶位點只需設計與靶位點互補的sgRNA，然后將sgRNA克隆到表達質粒上即可。③CRISPR-Cas系統可以同時對多個靶基因進行定點修飾，因此大大提高了修飾效率。
CRISPR-Cas系統的應用仍處于初級階段，存在許多不足：①5′-GN19NGG-3′的結構有時會出現限制性，會對靶位點以外的序列進行編輯，產生多余的DNA突變[72]。②CRISPR-Cas系統識別靶序列的長度較短，不能根據需求進行調節。③仍存在脫靶現象。
6 展望
基因功能缺失技術已經在生物學各個領域得到廣泛應用，成為了研究基因的主要方法。隨著基因功能缺失技術的不斷更新，已從反義RNA技術發展到了CRISPR-Cas技術，并且其應用范圍越來越廣泛，對目的基因的編輯效率越來越高，操作越來越簡便。目前基因功能缺失技g仍存在許多不足，限制了其發展。隨著研究的不斷深入與發展，基因功能缺失技術必將得到不斷改進和完善，也一定會對基因功能方面的研究做出更大的貢獻。
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一個國際研究小組在了解酶如何“編輯”基因方面取得了重要進展：觀察到了一類被稱為CRISPR的酶綁定并改變DNA（脫氧核糖核酸）結構的過程。這項發表于5月美國《國家科學院學報》上的研究成果有望為糾正人類的遺傳疾病鋪平道路。
CRISPR意即“成簇的規律間隔的短回文重復”，在20世紀80年代才首次為人們所認知。到目前為止，已發現40%已測序細菌和90%已測序古細菌的基因組存在這種重復序列，而且細菌已開發出一套可以探測和切斷外來DNA的免疫策略。其機理大致如此：CRISPR序列與很多病毒、噬菌體或者質粒的DNA序列同源，受到攻擊的細菌會以相匹配的DNA為目標進行自然防御。它們所采用的手段，就是利用一種名為Cas9的內切酶，裂解外來DNA。
基因工程師們意識到，如果將細菌的CRISPR-Cas9系統插入其它生物體細胞，它們也能夠對目標DNA進行切割。就在去年，這一革命性的基因編輯技術收獲了一系列成果：多個研究團隊已經成功對人體、小鼠、斑馬魚、大米、小麥等細胞中的基因進行刪除、添加、激活或抑制等操作，從而證明該技術的廣泛適用性。
不過，人類基因組有30億個堿基對，要準確鎖定某個目標DNA，工作量大致相當于從一套23卷的《百科全書》中找出一個拼錯的單詞。因此，研究人員為Cas9這把“基因剪刀”找了一個與目標基因匹配的RNA（核糖核酸）作為“導航儀”。在這個靶向過程中，Cas9拉開DNA鏈，并插入RNA，使之形成了一個被稱為R環的特定序列結構。
在最新研究中，英國布里斯托爾大學和立陶宛生物技術研究所的科學家使用經過特別改裝的顯微鏡對R環模型進行了檢測。顯微鏡下的單個DNA分子被磁場拉伸著，通過改變DNA受到的扭力，他們能夠直接觀測由單個CRISPR酶介導R環形成的過程。這使得這個過程中以前不為人知的一些步驟畢現無疑，也讓研究人員能夠探討DNA堿基對序列對R環形成的影響。
布里斯托爾大學生物化學系教授馬克?斯茲克澤爾昆說：“我們進行的單分子實驗加深了有關DNA序列對R環形成的影響的認識。這將有助于未來合理地重新設計CRISPR酶，以提高其精確度，將脫靶效應（即在不需要的地方引起基因變異）降至最低。這對我們最終利用這些工具來糾正患者的遺傳疾病至關重要。”
在西方神話中，諾亞建造了一艘方舟，帶著各種牲畜、鳥類等，躲避了大洪水，安然渡過“世界末日”。
一粒種子、一個細胞、一管血液、一口唾沫、一段脫氧核糖核酸、一條數據……這些不起眼的“現在”可能是構建未來生物科技和產業的磚石。在現實世界中，美國、歐盟和日本都擁有世界級基因庫，由此掌握生命經濟時代的戰略性資源。
如今，在深圳開始運營的國家基因庫帶著“留存現在、締造未來”的使命誕生。中國將擁有這樣一艘“諾亞方舟”，承載人類及其他生物的遺傳樣本和密碼。
國家基因庫里有什么？
在基因時代，這樣的未來可期：到醫院看病，只需自己的基因作為“身份證”和病歷；想“返老還童”，保存完好的干細胞就能輕松搞定；憨態可掬的大熊貓不再稀奇，就在你家庭院里懶洋洋地打盹；遠古的恐龍、猛犸象不只活在特效里，它們在博物館奇妙之夜真實復活……
通向這樣的未來，需要一些堅實的“磚石”――生物樣本和數據。這正是我國唯一一座國家基因庫的定位：有效保護、開發、利用遺傳資源，提高我國生命科學研究和生物產業發展水平，維護國家生物信息安全，助力全球生命科學發展。
2011年，國家發改委等4部委批復同意深圳依托華大基因研究院組建國家基因庫。
國家基因庫位于深圳市大鵬新區觀音山腳下，一期占地面積4.75萬平方米。這里幾乎與外界隔離，恍若世外桃源。走進建在層層梯田之上、室內綠意盎然的建筑，從一層上三層，依次會看到龐大的高通量基因測序房、超級計算房以及冷凍資源房。
“三庫兩平臺”，是國家基因庫主任梅永紅描述基因庫內容時使用頻次最高的一個概念。
據梅永紅介紹，與美國、歐盟、日本其他三大世界級的基因庫不同，中國國家基因庫不僅僅是數據庫，而是國際上現有的各類生物樣本庫、數據庫、生物多樣性庫、疾病庫等的綜合升級版。除了“干庫”（即基因、蛋白、分子、影像等多組生物信息數據庫）、“濕庫”（多樣性生物樣本和物種遺傳資源庫）之外，國家基因庫還引入了“活庫”，即生物活體庫，包括動物資源、植物資源、微生物資源和海洋資源等。
不妨把它想象成這樣一個載體：它是人類博物館、植物園、動物園、海洋館、微生物館的集合，這里存儲的將不僅是一個個標本原型和實物，還有一粒種子、一個細胞、一管血液、一口唾沫、一段脫氧核糖核酸、一條數據……
“兩平臺”指的是數字化平臺和合成與編輯平臺?！叭龓靸善脚_”的建設，最終為的是解決生命數據的“存、讀、懂、寫、用”5個作用。
“通俗地說，就是我們要把全球的生物資源都收集起來，用測序儀讀取萬物的遺傳數據，用超級計算機算出結果，用合成與編輯平臺寫出生命代碼，最后用來為人類服務?！泵酚兰t說。
目前，國家基因庫已存儲多種生物資源樣本1000萬份；初步建立基因信息數據和生物樣本采集、存儲、管理相關標準和技術規范，深圳市地方標準5項，申請國際、國內標準10項，申請國內外專利46項，出版基因資源專著8本。目前已開展國際/國家重點科研項目20余項，合作項目共140余篇，其中在《自然》《科學》《細胞》等知名科研雜志上30余篇。
國家基因庫像“生命銀行”
“高大上”的國家基因庫看似很遙遠，但其實跟每個人都息息相關。華大基因董事長汪建說，每個人一生中所有關鍵階段的標本都應該永久保存起來：從出生時的干細胞，到20歲時的免疫細胞，到30歲時的生殖細胞……而國家基因庫，就是儲存這些樣本和數據的地方，像我們的“生命銀行”。
“這類似于在人生的不同階段給自己拍照片，如果我們不拍，那就永遠拍不到了?！蓖艚ㄕf，“老照片只能拿來做留念，但是我們在不同階段存進‘生命銀行’的年輕樣本，卻是在我們越老的時候越有用，甚至可能在關鍵時刻救命?！?/p>
存儲這些數據到底有什么作用？從數年前開始，汪建就開始有意識地存儲自己的健康數據。這樣做的結果是，他對自己身體變化狀況了如指掌，并且根據這些數據設計自己的飲食、運動和生活節奏，“對抗”衰老。他說，隨著國家基因庫存儲容量的增加，未來將會有更多人可以儲存和掌握自己的健康數據，過上更健康的生活。
除了對個人，國家基因庫對保護生物多樣性也有重要意義。目前，保護人類生存環境，保護物種的多樣性已刻不容緩。汪建說，對瀕危的生命物種，我們需要盡快地將這些資源存儲起來，向子孫后代做一個交代。
生命的“國庫”，開放的平臺
人類越來越認識到基因資源以及保護地球生物多樣性的重要。國際上，挪威斯瓦爾巴全球種子庫、美國自然歷史博物館、英國生物樣本庫等應運而生，尤其是美國、歐洲、日本先后建立了大型基因數據庫，這三大庫里的生物信息數據幾乎涵蓋所有已知的脫氧核糖核酸、核糖核酸和蛋白質數據。
國家基因庫執行主任徐訊說：“中國亟須這樣一個平臺，從國家層面對具有中國特色的生物樣本和基因數據進行有效保存、管理和合理利用。”
“基因庫是生命科學的‘國庫’，比銀行的金庫還要寶貴。”梅永紅說，農耕時代的核心資源是耕地，工業時代是能源，而生命科學時代則是基因。基因資源目前已成為重要的國家戰略資源，如精準醫學很大程度上依賴對基因解讀的結果。“未來精準醫學方面的發展和競爭，一定程度上是基因資源的獲得與解析”。
國家基因庫將保持開放姿態。目前，國家基因庫已與聯合國糧食及農業組織、國際農業研究磋商小組、國際生物及環境樣本庫協會、挪威斯瓦爾巴全球種子庫、美國自然歷史博物館等100多個組織和科研機構建立戰略合作關系，在人類健康、生物多樣性、生物進化機制等方面開展合作研究。
“在保護種子多樣性方面，我們需要在全球范圍內互相依靠，攜手共進?！迸餐雇郀柊腿蚍N子庫相關負責人表示，期待未來和中國國家基因庫進一步合作，從而在環境變化和人口劇增等國際性挑戰下保護種子多樣性，“我們所有人都有職責來保護這些養活我們的種子”。
楊柏，資深記者、編輯，綜合開發研究院（中國?深圳）客座研究員。香港經濟導報執行總編輯，曾任中國青年報貴州記者站站長、深圳報業集團深圳商報《經濟望》周刊主編、理論部主任。著有《走進大山》、《迎接挑戰》、《橫向布局中國》等十余部專著。
貴州大學退休，在深圳養老的錢蔭瑜教授，幾天前，不辭辛勞，凌晨發來了一個“560億大數據引爆騰飛”為標題的電子郵件，使我差不多持續了一周，一有空就瀏覽這方面的信息。畢竟這是近年來貴州發展繼兩高（高速鐵路和高速公路）開建、兩股管道天然氣在貴陽交匯之后的又一重大事件。這消息造就出的美麗意象，真的像一首貴州山歌唱的那樣――“你像天邊飛來的彩云”。
對我供職的媒體而言，醞釀制作《大數據中國序幕》專題已是去年的6月初。當時，在北京寬溝一個國際會議的間隙，從中關村請來的北京締元信公司CEO秦雯給我們進行關于什么是大數據的掃盲。而有趣的是這個時候宏觀經濟的背景是：中國經濟鐵定進入了一位數的弱增長，廣義貨幣供應量卻在200%于GDP總量時出現了“錢荒”；中美經濟進入第五輪戰略對話；斯諾登私奔香港，后獲準進入了莫斯科，至今還 “生活在別處”，在異國他鄉演繹“生命不能承受之輕”的尷尬。
2012年，以全球第一個上市的大數據公司美國Splunk，在納斯達克上市，以及Bloomreach公司和大數據服務公司Hortonworks9相繼獲得2500萬與7000萬美元的風險投資為標志，大數據沿襲新經濟的路數從概念進入了激烈的產業創新界面。它對世界的影響也隨之超越書本上“千萬個‘路人甲’的價值邏輯”，引發了落后國家與地區的追趕，改變了人們一度對互聯網經濟已走到了歷史最高點逐步進入平緩或衰減區間的看法，重燃起了產業投資與競爭的熱情。盡管人們對10多年前新經濟泡沫破裂記憶猶新。
秦雯說，從搜集和分析數據，即目前開發者們正在做的工作而言，大數據并不是新的技術。但互聯網包括移動互聯網的發展，使過去的數年內制造的數據超過了人類歷史上的數據總量。更重要的是，隨著全息攝影技術、傳感技術、以及“拓展現實”的谷歌眼鏡（同樣在2012年問世）這樣的新技術的誕生，收集數據的能力變得空前強大。爆炸性增長的數據為更全面和精確地分析數據提供了可能性。從找到工具采集搜集天量數據，到大數據計算應用與價值開發，宣告了一個新時代的來臨，也提出了大數據產業基礎設施建構的問題。大數據中心的建設成了國家與地區層面的一個競爭焦點。
我明白這個道理是被吸收參與華大基因發展戰略規劃課題調研時獲得的。參加20世紀人類最偉大的三大科技突破之一，繪制人類第一個基因圖譜的中國生物科學家們，在完成項目1%的任務后，成功轉型成為創新企業家，創辦了華大基因研究院與科技公司。在迅速取得全球第一基因測序能力基礎上，又配套建設了領先的云計算能力，從而搶位成功，成為排名全球第一的提供動植物基因測序科學服務的大團隊公司，建成了國家基因庫，在人類知識創新前沿走上了一條產學研大貫穿的發展道路。有人做出比方說，一個人的基因數據，用傳統紙張打印，壘起來有地王大廈那么高。僅此一域的一例，即說明信息數據的天量。由此也可見支撐大數據應用，建設基礎設施平臺，為海量的數據存儲、處理和分析提供穩定而高效的資源保障是多么重要的事情。
貴州媒體傳播出的關于大數據中心落戶貴州的論述，已經從各種角度說明白了大數據落戶貴州的合理性，也描述出了貴州大數據產業園區，或一個集成創新的“大數據谷”產業聚集和產業鏈延伸的內容與前景。如果要“錦上添花”，我只想重提一個20世紀80年代郭凡生的“反梯度理論”觀點：落后的西部要發展，決不能簡單、消極、被動接受沿海發達地區的產業轉移，而是要有勇氣建構同時代世界一流水平的發展能力。否則，就永遠甩不掉落后的帽子。盡管這樣做，挑戰甚至大于機遇。
山歌“你像天邊飛來的彩云”，后一句是“你是一把登山的云梯”。曾幾何時，彩云在天，美在夢里，而“登山云梯”說明產生這首歌的年代，生產力與科技水平遠非是我們這個擁有登月工具的時代。也或許我們還要提一嘴斯諾登，他揭示了擁有占據數據比較優勢的國家和個人，有濫用數據侵犯別國他人的可能。數據安全成了國家安全的一個核心部件?；蛟S，這是大數據嵌入貴州隱含著深層戰略涵義的另一個要點。（責任編輯/吳文仙）
雖然個體化用藥是未來的趨勢，但它還處于普及階段，行業對其認知以及法規、標準都不完善。
個體化用藥，顧名思義就是根據每個人的基因不同，使用不同的藥物和不同的劑量。由于個體間基因的差異，使得個體間的藥物反應存在著不同程度的差異。因此在臨床中，時常會出現某一藥物使用在某些患者身上療效很好，而使用在另外一些患者身上卻并無療效的現象。
事實上，現代醫學已經意識到，基因是我們人體健康的決定性因素，每個人的基因結構不一樣，受環境因素影響表達水平也不一樣。因此，可以通過基因診斷對每個人實施個體化的診斷和治療。例如比較樂觀的應用場景是，根據基因診斷預測個體未來可能患上的疾病。但由于人類的基因和疾病的關系現在還在逐漸深入研究階段，這樣的場景事實上有些超前，很難做到準確判斷并實現民用化。而現階段比較成熟的應用場景是――個體化用藥的基因診斷，這也是美國藥品食品監督管理局（FDA）、各種專業協會、醫院醫師都普遍接受的概念。
個體化用藥的基因診斷，是指通過基因檢測，能夠知道某一藥物到底該不該用，到底該用多少劑量，從而減少毒副作用、提高療效。例如在心血管疾病方面，華法林的效果很好，但它的不良反應卻一直是棘手的問題?；颊呓邮艽笥谒麄兡褪艿膭┝繒r就有危機生命的出血風險，劑量過低則有血栓風險，基因檢測則可以幫助確定華法林個性化用藥的適宜劑量。FDA曾經幾次要求廠家更改藥品使用說明書，要求注明哪種類型的基因應該用多大劑量。可以說，個體化用藥是未來的趨勢。
然而，個體化用藥從科研成果走向醫療市場，還需要企業開發出面向醫療市場的產品。但作為國內第一家拿到個體化用藥診斷試劑批文的企業，我們觀察到的現象是，個體化用藥還處于普及階段，行業對它的認知以及法規、標準都不完善。作為企業，我們所能做的事情，是不斷教育市場、教育醫生。我們從國內外收集大量的資料，編輯成冊，原始論文都發給醫生，讓大家認識到個體化用藥這一概念，我們也在呼吁相關部門加強監管。
事實上，歐美十分熱衷于個體化用藥的概念。FDA已經將“個體化用藥”的研究成果轉化為臨床實踐，一些個體化用藥檢測項目被列為入院病人的常規項目，費用由醫療保險進行承擔。我認為，在中國還是需要國家政策的支持，讓行業健康有序發展。
In fact， the concept is very popular in the west. FDA had put personalized medicine into practice， and some of the tests have been listed as regular in hospitals and covered by medical insurance. And I think we need more governmental support in China to encourage the healthy development of this industry.
我對個體化用藥基因診斷在2014年的發展有以下兩點判斷：
第一，基因診斷企業從“打混戰”轉為“正規軍”。今年年初，食藥監總局、國家衛計委聯合發出通知，叫停基因測序臨床應用?！锻ㄖ分赋?，基因測序診斷產品（包括基因測序儀及相關診斷試劑和軟件）應作為醫療器械管理，并應按照《醫療器械監督管理條例》及相關產品注冊的規定申請產品注冊；未獲準注冊的醫療器械產品，不得生產、進口、銷售和使用。
這事實上反應出，此前基因診斷企業處于“混戰”局面，大家爭相上馬基因測序臨床應用產品，而并沒有經過國家的監管和審批。2014年，很多企業將會回過頭來納入國家監管，事實上這將有利于行業的發展。未來拿到批文的企業會越來越多，2014年是基因診斷市場規范之年。
第二，隨著基因診斷、個體化用藥的前景越來越被認可，將會有越來越多的企業加入到行業中，行業競爭將會加劇，產品種類會越來越多。我擔心的是企業之間會打價格戰，忽視產品的質量和創新，這對行業發展十分不利。
>> 案例教學法在《生物信息學》本科教學中的應用 師范院校生物信息學教學的現狀分析 醫學院校生物信息學教學的探究 面向醫科院校生物信息學專業的Java教學實踐 面向生物信息學本科專業的《遺傳學》教學要點及模式探索 離散數學在生物信息學專業本科教學的開展研究 生物信息學中的機器學習 癌癥研究的生物信息學資源 生物信息學中的序列比對算法 師范院校生物信息學本科教學改革與實踐 生物信息學數據庫及運用分析 生物信息學專業MySQL數據庫課程教學方法探討 生物信息學在生物學研究領域的應用 醫學院校生物技術專業生物信息學教學探索 生物背景學生的《生物信息學》課程教學思考與探索 師范院校研究生生物信息學教學改革思考 農業院校生物信息學教學模式探索 探討醫學院校生物信息學創新實踐能力培養 中醫大數據下生物信息學的發展及教育模式淺析 大數據背景下的生物信息學教學探索 常見問題解答 當前所在位置：l）。此外，還有細菌、真菌、植物等分支數據庫。該數據庫也有搜索引擎，其內容詳細的數據記錄了DNA、轉錄產物、蛋白質和基因突變等信息，使用方便，記錄系統、完整，是了解基因結構和功能比較理想的數據庫[2]。
2.3 miRBase數據庫 microRNA是近年來發現的非編碼內源性小RNA分子，其功能主要是調節靶基因的轉錄后水平的表達，是近年來研究的熱點領域。miRBase數據庫更新快，包含miRNA序列數據、功能注釋、靶基因預測等多各方面，是存儲miRNA信息最主要的公共數據庫之一（http：///）。目前，新版本（Ver.21）收錄了223個物種28645個前體miRNA和35 828個成熟miRNA產物，所有數據均可以通過web界面檢索，而且通過與TargetScan鏈接，可以查閱miRNA的潛在的靶基因。
2.4 生物分子信號通路數據庫 信號通路一詞在高中生物就接觸到，到本科階段的《細胞生物學》課程中得以深入學習。據調查，對于本科生而言，他們對信號通路想理解和認識有限，掌握的信號通路都是不完整的。學生在學習時，可借助信號通路數據庫檢索的方式，搜索某基因所參與的信號通路，并且可以直觀的看到該基因在整個信號通路中的地位和作用。信號通路數據庫目前比較常用的是WikiPathways數據庫（http：//）。該數據庫集成了主要的基因、蛋白質，允許整個研究者更廣泛參與[3]。該數據最大的特點是將基因之間的關系以圖形方式顯示，使學生直觀了解所感興趣的基因是如何參與到信號通路或生化代謝過程的。
3 常用生物信息學軟件及在線分析工具
3.1 DNA序列分析軟件 在生物科學本科教學過程中，很多課程如《生物化學》《分子生物學》《遺傳學》等，都涉及到DNA序列結構、基因突變等知識點，而且學生掌握到的更多都是一種朦朦朧朧，是懂非懂的知識點。因此，在《生物信息學》課堂上，當講到采用生物信息學軟件進行DNA序列分析時，學生產生了濃厚的興趣。DNA序列分析的軟件有很多，如：BioEdit，DNASIS，DNAStar，DNAClub，DNAMan等，相比較可知，就序列分析而言，我們認為DNAStar軟件最常用，且操作簡單，可視化功能強大，是地方本科院校學生的最佳選擇。
DNASTAR是基因組學、結構生物學和分子生物學領域中的一款綜合性序列分析工具軟件，包含可視化和序列編輯（SeqBuilder），序列組裝（SeqMan）、序列比對（MegAlign）、引物設計（PrimerSelect）、蛋白質結構分析（Protean）、基因查找（GeneQuest）和序列編輯（EditSeq）7個模塊，可用作DNA和蛋白質序列分析、序列重疊群拼接和基因工程管理等方面，目前，該軟件已被90多個國家的制藥，生物技術，學術和臨床研究人員使用。
3.2 RNA結構分析軟件 RNA包含tRNA，mRNA，rRNA和sRNA等多種類型，在蛋白質生物合成過程中起著非常重要的作用。他們的二級結構或高級結構會影響蛋白質合成的效率。因此，對于本科生而言，直觀的了解RNA的二級結構，對于掌握理論知識具有重要意義。RNA結構分析的軟件有如Mfold、RNAdraw和RNAstructure等多個軟件[4-5]。通過比較這些軟件獲得難易度、優缺點和使用復雜程度，我們發現Mfold已完成多次修訂，且實現了網上在線免費試用（http：//unafold.rna.albany.edu/？q=mfold），輸出結果靈活多樣，結果直觀，是本科生用于RNA結構分析的最佳選擇。
3.3 序列比對軟件（在線工具） 序列比對也稱序列比較，通過該操作，可以將兩個或多個基因（或蛋白質）序列按照一定的規律排列，使學生直觀的觀察到序列的變異，從而確定序列之間的相似性或同源性。根據序列多少，可分為雙序列比對和多序列比對。序列比對的軟件或在線工具也有很多，其中多序列比對軟件有Clustal（ClustalX和ClustalW）、GCG、BioEdit、DNAMAN和DNAStar件包中的MegAlign等。在這里，適合本科生教學的軟件我們推薦MegAlign和DNAMAN。而兩序列比最常用的則是BLAST在線工具（http：//ncbi.nlm.nih.gov/blast），它是NCBI開發的可免費非注冊使用的在線工具，可與NCBI的蛋白質數據庫和基因數據庫鏈接，也可用于蛋白質和基因序列的同源檢索，是本科教學中必須要用到的在線工具。
3.4 系統發育樹構建軟件 在生物進化過程中，細胞內的生物大分子（蛋白質、核酸）的一級結構的變化會出現變異（進化），而生物大分子進化速率相對恒定，我們可以根據生物大分子的序列信息構建系統發育樹，推斷生物進化歷史。系統發育樹構建的軟件有MEGA，PHYLIP，DNAMAN等。在分子進化相關的科學研究中，最常用的是MEGA（即Molecular Evolutionary Genetics Analysis），該軟件更新快（目前的最新版本為MEGA7.0 http：///），運行速度快，操作簡單，結果直觀。因此，在本科教學中，我們推薦MEGA軟件作為系統發育樹構建的軟件。
3.5 Expasy工具 ExPASy，即Expert Protein Analysis System，由瑞士生物信息學研究所維護的蛋白組學相關的在線實用分析平臺，整合了很多蛋白質數據資源和分析工具（http：///），涉及蛋白分類、蛋白質翻譯、結構預測、相似檢索、序列比對等。該在線工具可免費試用，是本科教學過程中值得推薦的分析工具。但是，該工具包數據量大，鑒于本科教學學時的限制，在教學過程中不宜細講，可以引入，讓感興趣的同學自學。
4 結語
隨著分子生物學和生物信息學的迅猛發展，生物信息學數據庫不斷完善，生物分析軟件越來越多，且各具特色。考慮到地方本科院校實際情況，我們介紹了以上的生物信息學數據庫和分析軟件（在線工具），并簡單總結了它們適合于地方性高校本科教學的優點，給出了合理選擇的參考建議，以期為地方本科院校《生物信息學》教學提供參考。
參考文獻
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[4]徐思敏.RNA生物信息相關軟件概述[J].科技信息：科學教研，2008（14）：398-399.
在美國，轉基因作物最早問世于1996年，隨后迅速被廣泛接受。2013年，從種植面積來看，美國至少95%的甜菜，93%的大豆，90%的棉花和玉米均為轉基因品種，這一數據來自美國農業部國家農業統計局。
2015年11月19日，經過全面的科學論證，美國食品與藥品監督管理局（FDA）批準了世界上第一種食用轉基因動物――AquAdvantage 轉基因大西洋鮭魚（Atlantic salmon），俗稱三文魚。這種轉基因三文魚生長速度約為普通三文魚的兩倍，可節省75%的飼料成本。這是一個標志性的事件，因為這是第一個被批準上市的轉基因動物食品，今后可能會有更多的轉基因蝦、轉基因豬、轉基因雞鴨、轉基因牛羊……人類的食譜將又一次發生變革。
是福還是禍
也許轉基因這個現代工業文明的奇葩會帶給人類更多的利益和福祉。三文魚是魚油含量豐富的魚種之一，更廉價的轉基因三文魚將促使人們的食用量增加，這種“白肉”一般認為有益健康;同時豬牛羊肉的消費會減少，而“紅肉”新近被世界衛生組織貼上一類“致癌物”的標簽。食用轉基因三文魚，據說還可以減少野生三文魚的捕撈，保護很多瀕臨滅絕的魚種。
不過社會上也流傳著另一種聲音。在美國，30多家機構上書美國政府，反對批準轉基因三文魚，理由之一是這種魚將帶給世界巨大的生態災難，不僅不能保護野生的三文魚，還會加速其滅絕。對中國，已經有人說轉基因三文魚卵的最大市場是這里，中國將成為世界上最大的轉基因三文魚養殖基地。一些“有識之士”指出，這是美國佬的又一個陰謀，通過轉基因食品，加速人體的衰老，讓人不育，造成免疫系統功能紊亂，最終滅絕中華民族。
人吃了這種三文魚是否安全，是中外消費者最為關心的問題。中國消費者更多關注的是吃這種魚會不會中毒？能不能致癌？影不影響生寶寶？這一點FDA給出的評判最為肯定：安全，放心吃就是。美國人對此卻不那么放心，批評FDA目光短淺，只看短期食用、只局限于三文魚一種食品的影響，而這還不足以做出安全的結論，敦促國會賦予FDA更大的權利、提供更多的資源，進行全面的評價。就目前FDA的科學評價內容來看，包含不同動物長時間食用、短時間超大劑量、繁殖傳代、模擬細胞癌變等多種試驗，結果當然是沒有不良反應和損害才敢評判為安全。另一方面，也包括轉基因三文魚與野生三文魚體內各種成分的分析和比較，如蛋白質和脂肪酸等營養成分、各種毒素和過敏原的檢測，對比的結果是沒有差別。
福兮禍之所倚
這樣評判出的安全被一些人認為僅僅是狹義的安全，更廣義的安全應該關注由此帶來人類食物來源改變的影響。當人們大幅度減少牛排的食用量，改吃三文魚排，是否一定有益健康？目前尚沒有足夠的證據。不過的確超出了目前科學家力所能及的范圍。
區別于消費高度關注的人體安全問題，業內的科學家們更關注的是生態安全。自然界的長期演變，形成了各種生物之間的穩定秩序，大魚吃小魚、小魚吃蝦米……如果這種秩序被破壞，人類會不會大魚、小魚、蝦米都吃不到，只有轉基因三文魚可吃？還有更離奇的想象，轉基因三文魚與野生的什么魚雜交出什么超級怪魚，不僅不給人吃，還吃人?？茖W家們對這種猜測不屑一顧，認為這只是科幻，毫無根據。但是對生態安全的擔心，使FDA一拖再拖，遲遲5年之后才最終確認了評價結論。
禍兮福之所伏
細心揣摩FDA的評價用語，沒有證據證明這種魚不安全，所以轉基因三文魚可以安全食用。為什么不說有充分證據說明人類食用轉基因三文魚安全，沒有任何風險？前一種說法是科學用語，因為任何科學判斷，不可能給出百分百確定的結論，消費者零風險的期待永遠與現實有差距。而現實是，盡管世界上每天都有致死的交通事故發生，但是我們仍舊上街、不斷穿越馬路。與美國人相比，中國式過馬路曾被媒體廣為詬病，但是面對轉基因食品，中國的消費者應該更為幸運，2015年10月1日實施的新版《食品安全法》有了轉基因食品標識的明文規定。美國沒有這樣的法律規定，若想區別市場上的三文魚是否為轉基因產品，消費者只能根據商家標識的“野生”來判別，而野生的三文魚比養殖的非轉基因三文魚要貴。相對比，一旦有一天轉基因三文魚進入中國，我們可以摸著口袋根據明確的標識做出選擇。（據《健康報》《財新網》） 編輯/吳雨
美國科學家克萊格?文特爾8月20日宣布成功制造出人造細胞“辛西婭”之后，引起全世界的震動。文特爾這個極具爭議性的人物也再次來到媒體的聚光燈前。有評論說，如果能夠引領一個領域的科學家是大?；蛘呔夼５脑?，他絕對是牛魔王級別的怪獸。
人造生命“辛西婭”問世后，有些科學家認為這種方法并沒有前途，因為設計新的有機生物要花費很多年時間。加利福尼亞州拉霍亞市斯克里普斯研究所的生物學家杰拉爾德?喬伊斯說：“這項研究的功能非常強大，能夠發行并控制一個基因組的每個基因。字符’，因為這意味著你可以植入不同的基因。”
《人工生命》雜志編輯、美國里德大學哲學家馬克?比道說，“辛西婭”的出現在生物學和生物技術的發展是上具有決定性意義。
美國賓西法尼亞大學生物倫理學教授阿瑟?卡普蘭對英國《自然――醫學》月刊記者說，文特爾及其團隊的成就“違反了一個生命本質的基本理念”。
在這一領域工作的一些科學家說，他們擔心的是，一旦這些新奇的有機體進入現實世界，人類還缺乏手段來制衡它們可能帶來的風險?！鞍凑斩x說，它們非常前沿，我們可能無法簡單地將它們同某些已知的危險細菌和病菌相提并論?！?/p>
在印度海得拉巴成立了細胞和分子生物中心的著名遺傳學家P?M?巴爾加瓦也直截了當地表示，雖然文特爾是一名杰出的科學家，但這次他卻夸大了自己成就的重要性。巴爾加瓦說：“文特爾的團隊從一個細胞中提取出DNA，然后用大量其他物質取而代之。這充其量只能算是多位點基因工程?！?/p>
南丹麥大學的斯蒂恩?拉斯馬森的看法和巴爾加瓦不謀而合。他在一份公開的聲明中說：“在人們了解生命之時，在一個現代細胞中制造一個臺成基因組目前具有里程碑式的意義。然而，文特爾團隊的這種徹底的基因工程我看來并不能稱為合成細胞?！?/p>
美國環境組織“地球之友”批評說，合成基因組是一項危險的新技術，“在有效的規章出臺之前，文特爾先生應該立即停止進一步的研究。”部分非政府組織認為，即使是用在環境方面(比如人們希望細菌能夠用來中和溫室氣體)，合成細胞的作用也被夸大了。
(據《揚子晚報》)
