時間：2023-05-30 09:12:31
開篇：寫作不僅是一種記錄，更是一種創造，它讓我們能夠捕捉那些稍縱即逝的靈感，將它們永久地定格在紙上。下面是小編精心整理的12篇凝膠色譜法，希望這些內容能成為您創作過程中的良師益友，陪伴您不斷探索和進步。
中圖分類號：TH23 文獻標識碼：A 文章編號：1009-914X（2015）10-0332-01
頭孢美唑鈉是一種半合成抗生素，其屬于第三代頭孢菌素，在臨床治療中有著廣泛的應用，在臨床應用中發現，這一藥物的抗菌性比較強，而且有著良好的藥效。通過測定實驗發現，為了提高頭孢美唑鈉的藥效，必須控制好其生產的質量，控制高分子雜質的產生，這樣可以防止患者的服用這一藥物時出現過敏反應，還可以降低藥物的毒性，防止藥品醫療事故的發生。本文通過建立凝膠色譜法測定頭孢美唑鈉中聚合物的方法，提高了藥品質量檢測結果的可靠性，對藥品生產安全也有著保障作用。
一、儀器與試藥
1、儀器
KGF-02型高分子聚合物測定儀（上海金達生化儀器廠）；WHSOO}JSB伍豪色譜土作站（上海伍豪信息科技有限公司）；色譜柱（40一120 μm葡聚糖凝膠G 10為填料）；玻璃柱（內徑1.3一1. 6 cm，柱高30一40 cm） ； BP211 D型分析天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]。
2、藥品與試劑
頭孢美唑鈉對照品（批號：MZW S0901，質量分數：91.7%）；注射用頭孢美唑鈉（批號：090101，090102，090103深圳立健藥業股份有限公司）；Naz HPOQ ， NaHz PO、均為分析純；純化水為公司自制；葡聚糖凝膠（Sephadex） G-0、藍色葡聚糖2000（Amersham Bioscience公司）。
二、方法與結果
1、溶液的制備
1.1對照溶液的制備
實驗人員首先需要稱取適量頭孢美唑鈉原料，然后加入純化水進行溶解，將其制備為1mL溶液含0.2mg頭孢美唑的對照溶液。這一過程主要是定量稀釋，對精確度有著較高的要求。
1.2供試品溶液的制備
采用精密的儀器，稱取0.2g注射用頭孢美唑鈉，然后將其置于10mL的容量瓶中，再加入一定量的純化水進行稀釋，達到規定的刻度后做搖勻處理。這一過程要求研究人員必須規范操作。
2、色譜條件
色譜柱為葡聚糖凝膠G-10柱（40一120μm，柱內徑1.3一1. 6 cm，柱高30一40 cm）；流動相A為pH7. 0的0. 02 mol/L磷酸鹽緩沖液[0. 02 mol/LNaz HPOQ -0. 02 mol / L NaH2 PO4（體積比61： 39 ） ]，流動相B為純化水；流速為1.5 mL/min；檢測波長為254 nm；進樣量為200μL。
3、系統適用性試驗
精密稱取藍色葡聚糖2000適量，加純化水定量稀釋成質量濃度為0. 1 mg/mL的溶液，精密量取200 μL，注入液相色譜儀，分別以流動相A，B進行測定，記錄色譜圖。按藍色葡聚糖2000峰計算理論塔板數應不低于700，拖尾因子應小于2. 0。在2種流動相系統中藍色葡聚糖2000的保留時間的比值應在0. 93一1. 07之間，對照溶液主峰、供試品溶液中聚合物峰與相應色譜系統中藍色葡聚糖2000峰的保留時間的比值均應在0. 93一1. 07之間。稱取注射用頭孢美唑鈉約0. 2 g，置10 mL容量瓶中，用1 mg/mL的藍色葡聚糖2000溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取200μL注入液相色譜儀，用流動相A進行測定，記錄色譜圖。聚合物峰高與單體間，及聚合物之間的谷高比（分離度R）應大于2.0。另以流動相B為流動相，精密量取對照溶液200μL，連續測定5次，峰面積RSD值應不大于5. 0% 。見圖1、表1（其中A表示藍色葡聚糖2000在流動相A中，B表示藍色葡聚糖2000在流動相B中，C表示對照溶液在流動相B中，D表示供試品溶液在流動相A中）。
4、注射用頭孢美唑鈉中聚合物的測定
取注射用頭孢美唑鈉約0. 2 g，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，加純化水溶解并稀釋至刻度，搖勻。立即精密量取200 μL注入液相色譜儀，以流動相A為流動相進行測定，記錄色譜圖。另精密量取對照溶液200 μL注入液相色譜儀，以流動相B為流動相進行測定，記錄色譜圖。
5、定量限的測定
分別取頭孢美唑鈉對照品適量，精密稱定，加水稀釋制成系列質量濃度的對照溶液。分別精密量取上述溶液200 μL注入液相色譜儀，以流動相B為流動相依法進行測定，以信噪比10： 1為指標，測得定量限為0.034μg/mL。
6、穩定性試驗
取同一批注射用頭孢美唑鈉（批號：090101）約0. 2 g，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。分別于0，1，2，4 h精密吸取200 μL注入液相色譜儀，以流動相A為流動相進行測定，結果聚合物峰面積的RSD值為15. 62%，表明供試品溶液中聚合物的峰面積隨放置時一間的延長而增大，因此應在供試品溶液配制后立即進樣測定。
三、討論
在不同的酸堿條件下，頭孢菌素發生聚合反應的難易程度不同，一般在強堿與強酸條件下，注射用頭孢美唑鈉較易發生聚合反應，會生成一定量聚合物，本文采用凝膠色譜法對這一聚合物進行了測定，通過分析注射用頭孢美唑鈉的高分子聚合物含量，可以為頭孢美唑鈉的質量檢驗提供依據。由于頭孢菌素在堿性以及酸性條件下會發生聚合反應，所以，在測定的過程中，選用了pH值為7的磷酸鹽緩沖液作為流動相。
分子排阻色譜法是一種有效的藥物檢測方法，其對頭孢高分子雜質有著較好的檢測效果。在本次實驗中，由于頭孢美唑鈉高分子聚合物對照品不宜獲取，而且實驗樣品中高聚物的數量也比較少，為了提高實驗的準確性，需要在配制檢測分離度時，加入一定量的葡萄糖，這可以增加聚合物峰值面積，加入量的具體數值可依實際情況穩定，要保證聚合物峰面積達到規定值的2倍左右。通過實驗證明，頭孢美唑鈉聚合物的分離度、拖尾因子以及保留時間符合藥品適用性的要求。本次實驗采用了封閉式凝膠柱，流相的流速達到了1.5mL/min，在洗脫處理后，聚合物既滿足分離的質量要求，也提高了分離的效率，縮短了分析時間。
注射用頭孢美唑鈉聚合物的形成具有動態性，聚合物樣品中高分子雜質的數量與溶液放置的時間有著較大關系，一般放置的時間越長，聚合物的質量分數越大，所以，為了保證測定的準確性，研究人員需要掌握好時間，這樣才能提高測定結果的可靠性。當供試品溶液配制中得到聚合物后，一定要及時測定。另外，在測定的過程中，測定方法的選用需要參考《中國藥典》的 相關檢測要求，一定要考慮高分子雜質的影響。本次試驗與研究表明：凝膠色譜法測定注射用頭孢美唑鈉聚合物，具有操作簡單、靈敏度高、可控性強等優點，可以有效提高頭孢美唑鈉聚合物的質量控制水平。
參考文獻
[1] 邊原，何林，夏祺悅. 反相高效液相色譜法測定注射用頭孢美唑鈉的含量[J]. 中國藥業. 2010（05）
[2] 蔡尾玉，黃凱文. 高效液相色譜法測定注射用頭孢美唑鈉中頭孢美唑含量[J]. 中國民族民間醫藥. 2012（04）
■ 一、 實驗原理及分析
提取和分離蛋白質的原理：利用蛋白質的各種理化特性（如形狀、大小、電荷性質和多少、溶解度、吸附性質、親和力等）的差異，由此提取和分離各種蛋白質。
1. 凝膠色譜法（分配色譜法）
（1） 原理：根據相對分子量的大小分離蛋白質的一種有效方法（分子量大的分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動快；分子量小的分子穿過多孔凝膠顆粒內部，路程長，流動慢）。
（2） 凝膠材料：大多數是由多糖化合物（如葡聚糖、瓊脂糖等）構成的微小多孔球體，如下圖所示。
（3） 作用：分離蛋白質，測定生物大分子分子量等。
2. 緩沖溶液
（1） 原理：由弱酸和相應的強堿弱酸鹽組成（如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等），調節緩沖劑的比例可以制成在不同pH范圍內使用的緩沖液。
（2） 緩沖液作用：在一定范圍內，緩沖溶液能夠抵制外界的酸和堿對溶液pH的影響，保持溶液的pH基本不變。
3. 凝膠電泳
（1） 原理：在電泳過程中，決定帶電分子遷移方向的是帶電分子帶電性質的差異，決定帶電分子遷移快慢的是帶電分子形狀、大小和電量的不同。
（2） 分離方法：瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。
（3） 分離過程：在一定的pH下，許多生物大分子上可解離的基團就會帶上正電或負電。加入帶負電荷多的SDS，形成“蛋白質－SDS復合物”，使蛋白質遷移速率僅取決于分子大小。
4. 實驗操作
（1） 樣品處理：
① 紅細胞的洗滌。
洗滌的目的是除去血漿中的雜蛋白，以利于后續步驟的分離純化。為防止血液凝固，應預先加入檸檬酸鈉；采集的血樣要及時采用低速短時間離心分離紅細胞，然后用膠頭吸管吸出上層透明的黃色血漿，將下層暗紅色的紅細胞液體倒入燒杯。
所用洗滌液是五倍于紅細胞液的生理鹽水；洗滌中用玻璃棒緩慢攪拌，用離心機低速短時離心；洗滌干凈的標準是上清液沒有黃色。
② 血紅蛋白的釋放。
釋放的目的是將血紅蛋白從紅細胞中釋放出來。在紅細胞液中加入等體積的蒸餾水和40％體積的甲苯，置于磁力攪拌器上充分攪拌。紅細胞破裂釋放出血紅蛋白。加入甲苯的目的是溶解細胞膜，有利于血紅蛋白的釋放和分離。
（2） 粗分離：
① 分離血紅蛋白溶液。
目的是從紅細胞破碎混合液中分離出血紅蛋白溶液。將紅細胞破碎混合液進行高速離心處理后，離心管中的溶液分為4層。從上到下依次是：無色透明的甲苯層、白色固體的脂溶性沉淀層、紅色透明的血紅蛋白溶液層和暗紅色的破碎物沉淀層。用濾紙過濾以除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置后分離出血紅蛋白溶液。
② 透析。
目的是除去血紅蛋白溶液中的無機鹽離子和有機小分子等分子量較小的雜質。將血紅蛋白溶液裝入透析袋中，放入磷酸緩沖液中透析12 h。
5. 凝膠色譜操作（分離純化）
① 凝膠色譜柱的制作。
② 凝膠色譜柱的裝填：
實驗所用凝膠是交聯葡聚糖凝膠（G－75），其中G表示交聯程度、膨脹程度和分離范圍；75表示凝膠得水值，即每克凝膠膨脹時吸水7.5 g。
將凝膠用蒸餾水充分溶脹后，配成凝膠懸浮液，一次性緩慢倒入色譜柱內，使凝膠裝填均勻并不能有氣泡存在。然后用磷酸緩沖液充分洗滌平衡12 h，使凝膠裝填緊密。
③ 樣品的加入和洗脫：
調節緩沖液面：打開色譜柱下端的流出口，使柱內凝膠面上的緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關閉出口。
加入蛋白質樣品：用吸管將透析后的樣品沿管壁環繞移動加到色譜柱的頂端。加樣后，打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內，等樣品完全滲入凝膠層后，關閉出口。
調節緩沖液面：加入20 mmol/L的磷酸緩沖液到適當高度。
洗脫：連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口，進行洗脫。
收集分裝蛋白質：待紅色的蛋白質接近色譜柱底端時，用試管收集。
④ 純度鑒定――SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。
■ 二、 解題指導及思路點撥
1. 題型探究：凝膠色譜法分離蛋白質
考生特別要注意對緩沖溶液的組成、作用機理、配制方法等方面的理解。
■ 例1 凝膠色譜法分離蛋白質的原理是（ ）
A. 根據蛋白質分子的形狀
B. 根據蛋白質相對分子質量的大小
C. 根據蛋白質所帶電荷的多少
D. 根據蛋白質溶解度的大小
■ 思路點撥 凝膠色譜法所用的凝膠是一種微小的多孔球體，在小球內部有許多貫穿的通道，相對分子質量較小的蛋白質容易進入凝膠內部的通道，路程較長。移動速度較慢，相對分子質量較大的蛋白質只能在凝膠外部移動，路程較短，移動速度較快。相對分子質量不同的蛋白質分子因此得以分離。
■ 答案 B
■ 例2 將經處理破裂后的紅細胞混合液以2 000 r/min的速度離心10 min后，離心管中的溶液分為四層，從上到下的順序依次是（ ）
A. 血紅蛋白、甲苯層、脂類物質層、沉淀層
B. 甲苯層、沉淀層、血紅蛋白、脂類物質層
C. 脂類物質層、血紅蛋白、甲苯層、沉淀層
D. 甲苯層、脂類物質層、血紅蛋白、沉淀層
思路點撥 混合液經離心后，按密度大小排列，在離心管中從上到下的順序依次是：第一層為無色透明的甲苯層；第二層為白色薄層固體，是脂溶性物質沉淀層；第三層為紅色透明液體，這是血紅蛋白的水溶液；第四層為暗紅色沉淀物，主要是紅細胞破碎物沉淀。
■ 答案 D
■ 例3 凝膠色譜技術是一種快速而又簡單的分離技術，由于設備簡單、操作方便，不需要有機溶劑，對高分子物質有很好的分離效果，目前已經被生物化學、分子生物學、生物工程學、分子免疫學以及醫學等有關領域廣泛應用，不但應用于科學實驗研究，而且，已經大規模地用于工業生產。據右圖回答問題：
（1） a、b均為蛋白質分子，其中先從層析柱中洗脫出來的是_______________，原因是____________________________________。
（2） 自己制作凝膠色譜柱時，在色譜柱底部d位置相當于多孔板的結構可由_______替代。
（3） 裝填凝膠色譜柱時，色譜柱內不能有氣泡存在，原因是_________。
（4） 洗脫用的液體應盡量與浸泡凝膠所用的液體_________（填“相同”或“不同”），洗脫時，對洗脫液的流速要求是_________。
■ 思路點撥 用凝膠色譜技術分離各種大分子物質時，大分子物質先洗脫出來，然后是小分子物質。大分子物質由于直徑較大，不易進入凝膠顆粒的微孔，而只能分布于顆粒之間，所以向下移動的速度較快。小分子物質除了可在凝膠顆粒間隙中擴散外，還可以進入凝膠顆粒的微孔，即進入凝膠內，在向下移動的過程中，從一個凝膠顆粒內擴散到顆粒間隙后再進入另一凝膠顆粒，如此不斷地進入和擴散，小分子物質的下移速度落后于大分子物質從而落后于大分子物質洗脫出來。在色譜柱中裝填凝膠的時候要盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙：一是在裝填凝膠柱時，不得有氣泡存在，因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質的洗脫次序，降低分離效果；二是凝膠色譜操作過程中，不能發生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現象。一旦發生上述兩種情況，凝膠色譜柱需要重新裝填。
■ 答案 （1） a a分子量大，不易進入凝膠顆粒的微孔而通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動快
（2） 尼龍網和尼龍紗
（3） 氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質的洗脫次序，降低分離效果。
（4） 相同 保持穩定
2. 題型探究二、與其他真核細胞相比，紅細胞的特點及這一特點對進行蛋白質分離的意義
哺乳動物及人的成熟的紅細胞是雙面凹圓餅狀，沒有細胞核和細胞器。其含有的血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時可以通過觀察顏色來判斷什么時候應該收集脫液。這使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡化了實驗操作。
■ 例4 關于血紅蛋白分子組成的敘述正確的是（ ）
A. 兩個α-肽鏈、兩個β-肽鏈、一個亞鐵血紅素基團
B. 一個α-肽鏈、三個β-肽鏈、四個亞鐵血紅素基團
C. 兩個α-肽鏈、兩個β-肽鏈、四個亞鐵血紅素基團
D. 兩個α-肽鏈、兩個β-肽鏈、兩個亞鐵血紅素基團
■ 思路點撥 血紅蛋白又稱血色素，是紅細胞的主要組成成分。血紅蛋白由四個肽鏈組成，它包括2個α-肽鏈、2個β-肽鏈。其中每條肽鏈環繞一個亞鐵血紅素基團，因此共有四個亞鐵血紅素基團。
■ 答案 C
3. 題型探究三、探討電泳的原理
電泳是指帶電粒子在電場的作用下發生遷移的過程。許多重要的生物大分子，如氨基酸、多肽、蛋白質、核苷酸、核酸等都具有可解離基團，它們在某個特定的pH下會帶上正電或負電；在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極方向移動。電泳技術就是在電場的作用下，利用待分離樣品中各種分子帶電性質以及分子本身大小、形狀等性質的差異，使帶電分子產生不同的遷移速度，從而達到對樣品進行分離、鑒定或提純的目的。
■ 例5 蛋白質分子中，氨基酸的α-氨基和α-羧基雖然大部分結合成為肽鍵，但是蛋白質分子內仍含有各種酸性基團和堿性基團，如肽鏈末端的α-氨基和α-羧基、天冬氨酸和谷氨酸殘基中的羧基、賴氨酸和組氨酸殘基中的各種堿性基團，所以蛋白質是兩性電解質。在酸性溶液中，堿性基團的解離增大，使蛋白質帶正電荷；在堿性溶液中酸性基團的解離加強，使蛋白質帶負電荷。當溶液到達某一pH時，蛋白質可因內部酸性和堿性基團的解離相等而呈等電狀態，這時的溶液pH叫做蛋白質的等電點。不處于等電點狀態的蛋白質分子的正、負電荷量是不相同的。試回答下列問題：
（1） 多數蛋白質的等電點近于5，一般含堿性基團較多的蛋白質的等電點_________（“偏高”還是“偏低”）。
（2） 根據等電點的不同，你能用_______方法將不同種類的蛋白質分子分開。
（3） 簡述根據等電點分離不同種類的蛋白質分子的原理________________________
_____________________________________。
■ 思路點撥 含堿性基團較多的蛋白質溶液，在pH近于5時解離程度較大，蛋白質帶正電荷。要使蛋白質內部酸性和堿性基團解離相等呈等電狀態，必須提高溶液的pH，使酸性基團解離增加，故蛋白質的等電點提高。根據等電點不同，可以利用電泳法將特定的蛋白質分離出來。
■ 答案 （1） 偏高
（2） 電泳
（3） 不處于等電點狀態的蛋白質分子的正、負電荷量是不相同，在電泳過程中，決定蛋白質遷移方向的是蛋白質帶電性質的差異，決定蛋白質遷移快慢的是蛋白質分子形狀、大小和電量的不同。
■ 鞏固訓練
1. 用凝膠色譜法分離蛋白質時，分子量大的蛋白質（ ）
A. 路程較長，移動速度較慢
B. 路程較長，移動速度較快
C. 路程較短，移動速度較慢
D. 路程較短，移動速度較快
2. 人們用雞的紅細胞提取DNA，用人的紅細胞提取血紅蛋白的原因是（ ）
A. 雞的紅細胞無血紅蛋白，人的紅細胞有血紅蛋白
B. 雞的紅細胞有線粒體，人的紅細胞無線粒體
C. 雞的紅細胞有細胞核，人的紅細胞無細胞核
D. 雞的紅細胞進行有氧呼吸，人的紅細胞進行無氧呼吸
3. 蛋白質提取和分離的步驟包括（ ）
A. 樣品處理、凝膠色譜操作、SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳
B. 樣品處理、凝膠色譜操作、純化
C. 樣品處理、粗分離、純化、純度鑒定
D. 樣品處理、純化、粗分離、純度鑒定
4. 在血紅蛋白的整個提取過程中，不斷用磷酸緩沖液處理的目的是（ ）
A. 防止血紅蛋白被O2氧化
B. 血紅蛋白是一種兩性物質，需要酸中和
C. 磷酸緩沖液會加速血紅蛋白的提取過程
D. 讓血紅蛋白處在穩定的pH范圍內，維持其結構和功能
5. （多選）人體血液中的緩沖物質都是由一種弱酸和相應的強堿鹽組成，下列緩沖對正確的是（ ）
A. Na2CO3/NaHCO3
B. Na3PO4/NaH2PO4
C. NaH2PO4/Na2HPO4
D. H2CO3/NaHCO3
6. 某同學在實驗課前從學校附近的屠宰場取新鮮的豬血，并在采血容器中預先加入了抗凝血劑檸檬酸鈉，取血回來馬上進行實驗，請回答有關紅細胞洗滌的有關問題：
（1） 洗滌紅細胞的目的是___________。
（2） 你如何知道紅細胞已洗滌干凈：__________________________________。
（3） 分離紅細胞時的離心速度及離心時間分別是___________________________。
（4） 如若離心速度過高和時間過長，則結果會怎樣___________________________。
7. 紅細胞含有大量血紅蛋白，紅細胞的機能主要是由血紅蛋白完成，血紅蛋白的主要功能是攜帶O2或CO2，我們可以選用豬、牛、羊或其他脊椎動物的血液進行實驗，來提取和分離血紅蛋白，請回答下列有關問題：
（1） 實驗前取新鮮的血液，要切記在采血容器中預先加入檸檬酸鈉，取血回來，馬上進行離心，收集血紅蛋白溶液。
① 加入檸檬酸鈉的目的是__________。
② 以上所述的過程即樣品處理，它包括________________、________________、收集血紅蛋白溶液。
（2） 收集的血紅蛋白溶液在透析袋中經過透析，這就是樣品的粗分離。
① 透析的目的是_________________。
② 透析的原理是___________________
____________________________________。
（3） 通過凝膠色譜法將樣品進一步純化，最后經SDS一聚丙烯酰胺凝膠電泳進行純度鑒定。
① 樣品純化的目的是_______________
_____________________________________。
② 血紅蛋白的特點是_______________
_____________________________________。
這一特點對進行蛋白質的分離有什么意義____________________________________
_____________________________________。
■ 答案
1. D
2. C
3. C
4. D
5. CD
6. （1） 去除血漿蛋白
（2） 離心后的上清液沒有黃色
（3） 低速（如500 r/min）短時間（如2 min）
（4） 離心速度過高和時間過長會使白細胞和淋巴細胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細胞，影響后續血紅蛋白的提取純度
7. （1） ① 防止血液的凝固
② 紅細胞的洗滌 血紅蛋白的釋放
（2） ① 去除相對分子質量較小的雜質
② 透析袋能使小分子自由進出，而大分子則保留在袋內
(1.上海市浦東新區疾病預防控制中心，上海 200136；2.上海杰諾質量檢測技術有限公司，上海 200136)
多環芳烴(PAHs)中包括苯并(a)芘等十幾種致癌物質。國家食品衛生標準中規定各類食用油中苯并(a)芘的限值為10μg/kg。國家標準GB5009.27-2003《食品中苯并(a)芘的測定》[1]規定了兩種檢測方法，分別是熒光分光光度法和目視比色法。我們研究了利用凝膠凈化技術進行前處理，用液相色譜法測定橄欖油中苯并(a)芘等5種PAHs的含量[2~4]。該法自動化程度高，有機溶劑使用量少，回收率高，滿足相關標準的要求。
1 材料與方法
1.1 儀器
液相色譜儀(HP1100型，熒光檢測器，美國安捷倫公司)；液相色譜柱(HPLC-Cartridge 250-3 LiChrospher® PHA 5μ，MERCK公司)；全自動凝膠凈化系統GPC(VARIO，德國LCTech公司)；GPC凈化柱(填充Bio-Beads S-X3 200～400目)；全自動定量濃縮儀(EVA III，德國LCTech公司)。
1.2 試劑
環己烷，色譜鑒定無干擾雜峰；乙酸乙酯，色譜鑒定無干擾雜峰；乙腈，色譜鑒定無干擾雜峰。標準品：5種PAHs單標[SUPELCO公司，苯并(a)芘，苯并(a)蒽，苯并(b)熒蒽，苯并(g，h，i)北和茚苯(1，2，3-cd)芘]，各化合物濃度均為200 μg/mL。GPC洗脫液：環己烷∶乙酸乙酯=1∶1 。
1.3 測定方法
1.3.1 GPC方法 流速5 mL/min，洗脫共計4 000s，收集時間段為2 100s～3 300s 。
1.3.2 液相色譜條件 流速為0.6 mL/min，柱溫為25 ℃，進樣量為20 μL。以乙腈和水梯度洗脫(表1)，不同特征波長檢測(表2)。
1.3.3 標準曲線的繪制 用乙腈稀釋配制混合標準系列，濃度系列為0、5、10、25、50、100 ng/mL；分別取1.0 μL注入液相色譜儀測定，每個濃度重復6次，以保留時間定性，以峰面積的均值分別對各毒物的含量繪制標準曲線。
1.3.4 樣品前處理 準確稱取5 g橄欖油，以環己烷溶解定容至10 mL。取5 mL直接通過GPC凈化洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮、氮吹至凈干，乙腈定容至0.20 mL待測。
1.3.5 樣品測定 在標準曲線測定的相同條件下，分別取1.0 μL樣品提取液和試劑空白對照注入液相色譜儀測定。以保留時間定性，測得樣品峰面積值后由標準曲線查得各毒物的含量。
計算：C=c×v×n / m
式中C為樣品中PAHs的濃度(μg/kg)，c為由標準曲線查得提取液中PAHs的含量(ng/mL)，v 為提取液定容體積(mL)，n為稀釋倍數，m為取樣質量(g)。
2 結果與討論
2.1 GPC條件
根據分段收集實驗測定，PAHs分布于2 100s～3 300s的時間段。
2.2 色譜柱選擇
選擇PAHs專用分析色譜柱HPLC-Cartridge 250-3 LiChrospher® PHA 5μ，該柱能從常見十多種PAHs中較好地分離出苯并(a)芘，苯并(a)蒽，苯并(b)熒蒽，苯并(g，h，i)北和茚苯(1，2，3-cd)芘)，見圖1。
2.3 標準曲線
按照本方法選定的條件，苯并(a)芘、苯并(a)蒽、苯并(b)熒蒽、苯并(g，h，i)北和茚苯(1，2，3-cd)芘)的線性相關系數均大于0.999(表3)。
2.4 精密度試驗
對某質控樣分別測定6次，5種PAHs的測定值均在允許范圍內，相對標準偏差(RSD) 均
2.5 加標回收試驗
對12份樣品(每份稱取5g)分別進行高、低濃度加標回收測試，5種PAHs的平均回收率為81%～95%(表5)。
2.6 試劑本底干擾
試驗中發現，GPC洗脫液環己烷和乙酸乙酯的本底雜質會對待測物產生干擾。因此，使用農殘級或提純處理的試劑是保證檢測結果準確的關鍵步驟之一。
采用直接溶解樣品，應用GPC凝膠凈化技術處理，以液相色譜法測定橄欖油中苯并(a)芘等5種PAHs的含量。該方法操作簡便，線性范圍、精密度等各項技術指標滿足痕量分析的要求。
3 參考文獻
[1]GB/T 5009.27-2003，食品中苯并(a)芘的測定[S].
[2]楊紅梅，王浩，劉艷琴，等.高效液相色譜法測定肉類食品中苯并芘殘留的研究[J].食品研究與開發，2006，27(10)：124-126.
[3]李偉紅，戴延燦，周瑤敏，等.高效液相色譜法測定熟肉制品中的苯并(a)芘[J].江西農業學報，2008，20(1)：86-88.
在這里，我們是用過離子交換柱和凝膠柱來達到純化多糖樣品的目的。采用的離子交換柱為CM-纖維素柱，凝膠柱則為SephadexG-100。我們采用的是先過離子柱洗脫再過凝膠柱洗脫。1.材料1.1儀 器 玻璃柱(規格為Ф2×30cm),玻璃柱(規格為Ф2×100cm），LC-10ATSHIMADZU液相泵2臺(一作主泵A,一作副泵B)，BSZ-100自動分布收集儀，收集管,756MC紫外分光計1.2試劑
5mM的NaAC溶液（PH=4.5,0.4g/L），1N的NaCL（溶于5mM的NaAC溶液中），0.1NNaCL溶液，水為經過脫氣過濾處理的去離子水。0.1g蒽酮與50ml濃硫酸混合成的蒽酮－硫酸液，均為分析純。1.3其它材料CM－纖維素填料SephadexG-100凝膠填料兩者均為進口。2.實驗方法2.1 過CM－纖維素離子交換柱
先將CM－纖維素填料裝入玻璃柱（規格為Ф2×23cm）中，以5mM的NaAC洗脫液將兩個液相泵(A泵和B泵)與柱聯接成一真空系統，以0.5ml/min的流速平衡一天，之后即可上樣，采用梯度洗脫，母液為5mM的NaAC溶液，梯度液為1N的NaCL溶液（從0.2N～0.8N），上樣量為5ml（濃度0.1g/ml），流速0.5ml/min，隔15min收集一管，從第20管開始進行梯度洗脫。每隔兩管用蒽酮－硫酸法監測[以管號為橫坐標，620nm處紫外吸收值（OD值）為縱坐標作圖]，分別按相關峰位收集并凍干。之后取主要產物過SephadexG-100柱進行進一步的分離。2.2過SephadexG-100凝膠柱將SephadexG-100凝膠填料裝柱（規格為Ф2×85cm），再通過0.1NNaCL洗脫液把A泵與柱連接起來，以0.3ml/min流速平衡一天，之后即可上樣，上樣量為5ml（濃度0.1g/ml），用0.1NNaCL緩沖溶液以0.3ml/min流速洗脫，隔15min收集一管。以蒽酮－硫酸法監測，分別按相關峰位收集并凍干。（二）結果與分析1.過CM－纖維素離子交換柱結果山楂葉粗品多糖KS經過CM－纖維素柱梯度洗脫，分別按相關峰位收集并凍干之后，得到四個組分：KS1、KS2、KS3、KS4（如圖2）。其中，KS1占14，KS2占25，KS3占52，KS4占9，均為白色絮狀物。這里，KS3是主要組分。2.過SephadexG－100凝膠柱洗脫結果當KS3經過SephadexG-100柱洗脫，按相關峰位收集并凍干之后，可分成兩個組分KS3′、KS3″（如圖3）。KS3′占28，KS3″占72。這里，根據含量比例大小的比較，KS3″為主要產物。圖2山楂葉多糖粗品（KS）過CM-纖維素柱洗脫曲線Fig2ElutionpatternsofCrataeguspinnatifidaleaves’crudepolysaccharide（KS）extractonCM-cellulosecolumn圖3山楂葉多糖（KS3）過SephadexG-100凝膠柱洗脫曲線Fig3ElutionpatternsofCrataeguspinnatifidaleaves’crudepolysaccharide（KS3）extractonSephadexG-100column二、純度測定這里，純度的測定方法我們是采用了醋酸纖維薄膜電泳法、SephadexG-200凝膠過柱法和高效液相凝膠色譜法（HPGPC）；分子量的測定則是采用了高效液相凝膠色譜法（HPGPC）。（一）材料與方法1. 儀 器DYY—Ⅲ型水平電泳槽（北京六一儀器廠產）、美國產BIO-RAD電泳儀、冰箱，Waters液相色譜儀、RID-6A示差檢測器，柱為MACROSEPHEREGPC（250mm×4.6mm），LC-10ATSHIMADZU液相泵、756MC紫外分光計，Waters510液相泵，5ul微量進樣器。2. 試 劑2.1測純度所需試劑2.1.1醋酸纖維素薄膜電泳所需試劑
硼酸鹽溶液：0.2N硼酸溶液及KCL溶液各125ML，0.2N氫氧化鈉溶液219.5ML混合后加水稀釋至1L。氧 化 液：1.2g高碘酸溶于30ml水中，加入15ml0.2N醋酸
鈉溶液及100ml乙醇，置暗處，可使用數日。還 原 液：5gKI 5gNa2SO3溶于100ml水，加入150ml乙醇
及2.5ml2NHCL，隨加隨攪動，現用現配。染 色 液：2g堿性品紅溶于400ml沸水中，冷至50℃過濾，
通入二氧化硫氣體至褪色，密封后置暗冷處保存，
如溶液變紅，則不能使用。
沖 洗 液：1ml濃鹽酸加0.4g偏重亞硫酸鉀溶于100ml水中。2.1.2HPGPC和過SephadexG-200柱所需試劑去離子水（經過脫氣過濾處理），0.1NNaCL溶液。2.2測分子量所需試劑去離子水（經過脫氣過濾處理）,已知分子量的葡聚糖系列BluG（藍色葡聚糖）、Wt66,900、Wt37,500、Wt20,000、Wt9,900、Glc(葡萄糖)、樣品。這里，Wt后的數字為該標品的分子量。另外，所有標品和樣品均用去離子水配成0.2濃度。標品為德國進口純。3.其它材料SephadexG-200凝膠填料——進口 醋酸纖維素薄膜——國產4.檢測多糖純度4.1醋酸纖維素薄膜電泳
取8×12cm長度的醋酸纖維薄膜，在PH10.0硼酸鹽溶液中浸透后，將其夾于兩張干凈濾紙中間吸干，再于無光澤面點樣，然后將其架于電泳槽上，盡量平直，然后用微量注射器吸取2~4μL的1的樣品溶液（溶于緩沖液中），在薄膜的無光澤面上距一端2cm處呈線狀點樣，注意使點樣線寬度不超過1mm且兩端距薄膜邊緣不少于4mm。點樣面向下，以濾紙搭橋，取電壓220V，在0℃下電泳20min，然后取出膜條置95乙醇溶液中固定，再置于氧化液中氧化6min，取出用70乙醇浸洗，之后再浸入還原液中還原8min，取出用70乙醇浸洗，然后浸入染色液中染色，至色帶出現為止，再用沖洗液沖洗，則有糖區顯紫紅色，無糖區無色。這里，共做三個樣品的電泳圖譜：混合標樣（Wt9,900、Wt66,000、Wt37,500、Wt20,000，比例相同）、單一標樣Wt20,000的標樣、KS3″。4.2高效液相凝膠色譜法（HPGPC）將樣品用緩沖液配成0.2濃度，每次進樣量為20ul，流速為0.3ml/min，溫度25～30℃。4.3過SephadexG-200柱
將SephadexG-200凝膠填料裝柱（規格為Ф2×85cm），再通過0.1NNaCL洗脫液把A泵與柱連接起來以0.3ml/min流速平衡一天，之后即可上樣，上樣量為5ml（濃度0.1g/ml），用0.1NNaCL緩沖溶液以0.3ml/min流速洗脫，隔15min收集一管。以蒽酮－硫酸法監測，分別按相關峰位收集并凍干。5.測定分子量這里，采用高效液相凝膠色譜法（HPGPC）測定多糖精品的分子量?；静僮鳁l件與前面的4.2HPGPC純度測定相同，不同的是這里是依次將各個標準樣品多糖洗脫，記下出峰時間tR。再將多糖樣品液洗脫，記下出峰時間，然后根據公式算出對應樣品的分子量。（二）結果與討論1.純度鑒定方面1.1醋酸纖維素薄膜電泳實驗結果顯示，電泳方向為由正極向負極移動。KS3″ 電泳圖譜為單一色帶，單一標品亦為單一色帶，而標品混合樣為一色斑（如圖4）。1.2過高效液相色譜檢測
KS3″經過HPGPC檢測為單一組分（如圖5）1.3 結 論
關鍵詞：GC-FID；烘焙堅果食品；BHA；BHT
中圖分類號：R917 文獻識別碼：A 文章編號：1001-828X（2016）006-000-02
引言
食用油脂和含有食用油脂的食品在不適當的保存條件下或者超過保質期就會發生酸敗現象。為了避免酸敗現象或者延緩其發生時間，通常會加入BHA、BHT或者其他的抗氧化劑和防腐劑，然而資料表明，BHA有潛在的致癌性，BHT危險小一些，不過動物實驗也發現它能致癌。因此，研究食品中的BHA、BHT的檢測方法就十分重要。目前檢測BHA、BHT等抗氧化劑的方法有氣相色譜法、氣相色譜-質譜法、高效液相色譜法等。利用這些方法提取烘焙堅果食品中的油脂都需要將樣品中油脂提取出來，然后再通過柱層析或者凝膠色譜方法去除掉脂肪。由于柱層析與凝膠色譜法操作繁瑣、試劑消耗大等。因此，本文用甲醇直接提取油脂中的BHA、BHT，提取液經過冷藏靜置后過濾，減壓濃縮至近干用乙醇定容。待分析。
一、實驗部分
1.材料試劑
石油醚（30℃～60℃）、甲醇、均為分析純；BHA、BHT標樣，純度均高于99%；氮氣，純度99.999%。
2.儀器與設備
GC-2010（日本島津公司）-氫火焰離子化檢測器（FID）、振蕩器、旋轉蒸發儀、離心機、冰箱。
3.色譜條件
色譜柱為DB-WAX石英毛細管柱，長30m、內徑0.25mm、膜厚0.25μm；柱溫：初始溫度為80℃，保持1min，以10℃/min升溫至230 ℃，保持8min；進樣口溫度150℃，不分流進樣，進樣量1μm。檢測器：FID 溫度250℃。載氣流量：氮氣4.38 mL/min、氫氣40mL/min、空氣400mL/min。
4.樣品處理
（1）脂肪的提取
稱取樣品50～100g（視樣品脂肪含量而定），混合均勻，置于250mL具塞錐形瓶中，加入適量石油醚浸泡試樣，震搖10min靜置2-3h后快速濾紙過濾，減壓回收溶劑殘留脂肪備用。
（2）樣品的制備
準確稱取樣品1-2g（精確至0.001g）于15 mL離心管中，用10 mL甲醇分3次萃?。ㄈ伪壤秊?mL、4mL、3mL），震蕩2min/次，靜置10min后吸取甲醇溶液合并于15mL離心管中（如果靜置后乳化較為嚴重，可以3000rmm離心3min），合并好的甲醇溶液置于冰箱-4℃冷凍1h后用快速定性濾紙過濾，再用約3mL甲醇沖洗濾紙上殘渣，合并甲醇溶液，減壓濃縮至近干，用乙醇定容至2.0mL，該溶液為待測溶液。
二、結果與討論
1.色譜條件的優化
本實驗采用DB-WAX毛細管柱，以及梯度升溫的方法測定混合標樣的含量和分離情況，結果如圖1所示。圖1表明，隨著溫度的升高BHA、BHT能夠達到很好的基線分離，且峰形較好。
2.線性關系及檢出限
分別繪制BHA、BHT的標準曲線，再0.02～0.5mg/L范圍內兩種物質的濃度與峰面積的線性關系良好，其線性方程及相關系數見表1。以三倍的信噪比（3S/N）計算檢出限。
3.方法的回收率
取已知不含待測物的樣品，分別添加80ng和160ng的BHA和BHT標準品，每一梯度取3個樣待測，同時定容2mL經0.45μm微孔濾膜過濾后，按照1.3節色譜分析條件平行測定三次，計算回收率。實驗表明，BHA、BHT的平均回收率分別為95.5%、95.2%，見表2。
4.烘烤榛子仁樣品的分析檢測
實驗采用本研究的方法，對3批次實際樣品驚醒測試，結果見表3。監測數據表明，烘烤榛子仁中BHA、BHT的含量均為0。圖2為烘烤榛子仁樣品色譜圖。
三、結論
本文采用冷凍過濾提取烘烤榛子仁中的油脂作為前處理，并用氣象色譜法對烘烤榛子仁樣品中的BHA、BHT進行了檢測。檢測結果顯示，BHA、BHT在80ng-160ng添加濃度范圍內，回收率均大于95%，相對標準偏差均小于0.2%。該方法簡單、高效，而且其準確性和重復性較好，可用于檢測堅果食品中抗氧化劑的限度。
參考文獻：
[1]伍先紹，柳永英，賴麗瓊.液相色譜法同時快速測定植物中TBHQ、BHA/BHT探討[J].糧食與油脂，2012，25（4）：26-29.
關鍵詞：液相色譜法 高效液相色譜法 油氣地質 應用現狀
中圖分類號：TE31
文獻標識碼：A
文章編號：1007-3973（2012）003-052-02
1 液相色譜法、高效液相色譜(HPLC)法簡介
1.1 液相色譜法、高效液相色譜的由來
經典的液相色譜，是歷史最為悠久的色譜技術。60年代后期，氣相色譜塔板理論、高壓輸液泵、高效固定相、高靈敏度檢測器技術被成功地運用于液相色譜技術，使其實現了分析速度快、分離效率高以及操作自動化，發展成為了高效液相色譜技術。
1.2 液相色譜法、高效液相色譜、氣相色譜法的對比
經典液相色譜法使用粗粒多孔固定相，裝填在大口徑、長玻璃柱管內，流動相僅靠重力流經色譜柱，溶質在固定相的傳質、擴散速度緩慢，柱入口壓力低，柱效低，分析時間冗長。
HPLC采用了裝填于口徑小、長度短的不銹鋼柱內的全多孔微粒固定相。流動相在通過高壓輸液泵后，進入高柱壓的色譜柱，從而使溶解在固定相的傳質具有更大的擴散速度，使得整個分析過程具備高柱效和高分離能力。其適合于分析那些用氣相色譜難以分析的物質，如揮發性差、極性強、具有生物活性、熱穩定性差的物質。
1.3 高效液相色譜的分類、特點
據分離機制的不同，HPLC可分為分配色譜、吸附色譜、離子交換色譜、凝膠色譜等。
高效液相色譜具有以下突出的特點：
高壓：高效液相色譜的流動相為被稱為載體的液體，對色譜柱內的載液施加高壓，可確保其克服較大阻力而順利流過。
高速：高效液相色譜采用高壓，其中的載液流速較快。
高效：相對經典液相色譜而言，高效液相色譜具有高效性。據統計，高效液相色譜法的柱效可達3萬塔板/m以上。
高靈敏度：高效液相色譜采用的檢測器，最小檢測量可達0.001ug。
2 高效液相色譜法在油氣地質中的應用現狀
2.1 在油藏地球化學勘探上的應用
地球化學于1933年被列入油氣勘探行業，至今化探方法已有了長足的發展。化探分析要求勘探速度快、勘探成本低、數據采集、處理誤差小。而HPLC則完全具有高速、高效，高靈敏度這些特點。目前，在油氣化探中，不少國內外工作者利用HPLC技術，不經萃取分離而對地質樣品中的微量芳香化合物進行直接測定，并收到了較好效果。
利用液相色譜分析技術，對油頁巖、含油砂巖、現代沉積進行測定，對比其液相色譜圖，可知：極性芳香化合物在油頁巖中含量豐富，在含油砂巖中含量貧瘠。芳烴物質的豐度決定著砂巖的含油性?，F代沉積中的含水砂巖，芳烴物質豐度較低，幾乎不具有含油性。圖為油頁巖、含油砂巖、現代沉積的液相色譜圖。
另外，儲層之上擁有力度較好、封閉性較好的蓋層進行封閉(比如粘土、泥灰巖、頁巖、鹽巖) 是油氣藏形成的必要要素之一。一般情況下，由于芳烴化合物的分子直徑大，好的蓋層能夠對其運移起到良好的阻隔作用。所以，對上覆地層中芳烴化合物進行豐度測定，可以反映出蓋層封閉性能力的高低。從這一角度而言，利用HPLC分析地質樣品中芳香化合物的分子信息，可較好地進一步探討油氣化勘探中常見的一些基本問題，這對油氣勘探工作無疑具有重要意義。
.2 在油氣化學組成分析上的應用
石油中，含有許多熱穩定性差、相對分子質量大、難以揮發而極性不同的生物性標識化合物，如芳香化合物、甾萜烷、卟啉等。生物標識化合物是由C、H和其他元素組成的復雜而特殊結構的有機化合物，其來源于原始生物母質，記錄有特殊分子結構信息。利用高效液相色譜法對該類有機物進行測定分析，可有助于了解油氣的化學組成。
2.3 在油氣源對比上的應用
油氣源對比的實質為運用有機地球化學的基本原理，合理選擇對比參數來研究油氣和源巖的各自特殊性，以分析彼此親緣關系。其中指紋對比法，是常用的方法之一。
指紋對比法，具體是分別把油氣和可能烴源巖相關的輕烴色譜圖、原油飽和烴色譜圖、甾烷和萜烷的色譜圖等，直接進行指紋對比。而高效液相色譜分析技術通過高效液相色譜儀等，可對該類化學指紋進行相關研究。原油的物理性質與化學組成信息和人的指紋一樣具有與生俱來的唯一性，這些獨一無二的特征被稱為“油指紋”。利用高效液相色譜技術，通過高效液相色譜儀等可對不同油種的化學指紋進行相關研究，對鑒別油種具有十分重要的意義。在開發過程中可以快速判斷溢油點，也能為打擊原油走私、偷運提供最直接的證據。
2.4 在烴源巖評價上的應用
烴源巖是控制油氣藏形成與分布的關鍵性因素之一。確定有效烴源巖是含油氣系統的基礎。烴源巖評價主體上包括兩大方面：烴源巖的地球化學特征評價和烴源巖的生烴能力評價。
烴源巖的地球化學特征評價主要是評價有機質的豐度、類型和成熟度。烴源巖的生烴能力評價主要是評價生烴強度、生烴量和排烴強度等。利用高效液相色普法測定氯仿瀝青“A”和總經含量，可反映有機質的豐度。目前測定巖石樣品中微量元素的兩種HPLC技術以前已經開展，表明高效液相色譜法可用以對烴源巖的微量元素等加以分析。有機質成熟度由低到高，其有機物成分將相應發生規律性變化，如隨有機質成熟度增加，CPI、OEP、R29的數值越來越接近于1，并趨于穩定。用高效液相色譜法對不同演化階段的有機質進行色譜分析對比，據其色譜差異，可反映有機質的成熟度或干酪根的類型，據此進一步可對烴源巖的生烴能力進行一定程度上的評價。
3 高效液相色譜法在油氣地質上應用的尚存不足
關鍵詞：硝苯地平;智能水凝膠;質量標準;研究
硝苯地平智能膠的主要成分是硝苯地平，載體材料是高分子材料，制備方法為離子膠凝化法，這種一種智能藥物，其對PH十分敏感。采用高效液相色譜法對于質量標準進行研究，這種方法可以有效的測定該藥物中硝苯地平的含量，但是測定時，需要考慮高分子材料的干擾因素，盡量避免干擾，同時還需要注意避光，否則硝苯地平會逐漸的分解，難以實現質量控制效果[1]。
1 儀器與試藥
1.1 儀器
Agilent 1200型高效液相色譜儀，由美國安捷倫公司生產;ODS-90TS（4.8mm×140mm，5m）色譜柱，G1315B二泵，G2170B色譜工作站和7730進樣閥。HPD-44真空泵，天津市恒奧科技發展有限公司;F7超聲波清洗儀（上海超聲波儀器廠）。吉尼斯系列電子分析天平（德國塞多利斯儀器系統有限公司），78-5磁力加熱攪拌器 （江蘇省金壇市正基儀器有限公司）。
1.2 試藥
苯地平智能水凝膠（哈爾濱醫科大學，批號：20150118，20150119，2015
0120），硝苯地平精致品（自制，純度99.7%），N-琥珀酰殼聚糖（中國研究院化學物理研究所，相對分子質量300000，脫乙酰度65%），海藻酸鈉（浙江化學試劑站分裝廠，批號041207），氯化鈣（天津科密歐化學試劑有限公司，批號20140224）。
2 方法與結果
2.1 硝苯地平智能水凝膠的制備
精密稱取N-琥珀酰殼聚糖和海藻酸鈉適量，加入蒸餾水中，加熱攪拌至完全溶解，得濃度為2%的水溶液。精密稱取硝苯地平適量（藥載比為1：4），加入上述水溶液中，攪拌至硝苯地平完全分散均勻，然后將上述混懸液通過5ml注射器針頭（針頭內徑4.5mm）以1.2ml/min的速度滴加到輕度攪拌的CaCl2～2H2O溶液中交聯30min，滴距5cm，反應完畢后過濾小球，水洗，室溫放置自然干燥，得載藥的N-琥珀酰殼聚糖一海藻酸鈣凝膠小球[4]。
2.2 質量控制
2.2.1 紫外吸收。取含量測定項下的溶液，加等量的無水乙醇稀釋后。照紫外一可見分光光度法測定，在237nm波長處有最大吸收，在320-355nm的波長處有較大的寬幅吸收。
圖1 紫外光譜圖
2.2.2 含量測定
（1）色譜條件：色譜柱：ODS-90TS（4.8mm×140mm，5m）;流動相：l%冰醋酸（三乙胺調pH至3-31）-甲醇（30：70，V/V）;流速：0.8ml/min;檢測波長：237nm;進樣量：20ml;柱溫：35℃;保留時間：5min，分離度1.5。（2）對照品溶液的制備：避光，精密稱取硝苯地平精制品6.94mg，置50m1棕色量瓶中。加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液。（3）供試品溶液的制備：避光，取本品研細的粉末27mg，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入pH7.34的枸櫞酸鹽緩沖液（0.4%吐溫-80）50ml，密塞，稱定質量，超聲處理20min，放冷，再稱定質量，加枸櫞酸鹽緩沖液補足減失的質量，搖勻。轉入分液漏斗中，用氯仿萃取3次（20、20、10m1），合并氯仿提取液，轉移至50ml棕色量瓶中。加氯仿至刻度，搖勻，精密量取5ml氯仿液，蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉移置25ml棕色量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，用0.22m的微孔濾膜濾過，取續濾液，即得[5]。（4）干擾試驗：精密量取對照品溶液、供試品溶液、空白對照溶液各20ml，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。從實驗中可見在與對照色譜相應的位置上，空白對照溶液在與硝苯地平色譜峰的位置上無干擾。（5）線性關系考察：精密吸取硝苯地平對照品貯備液0.2、1、2、3、5、6、8ml置10ml棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成系列濃度溶液，在上述色譜條件下進樣測定。以峰面積（A）為縱坐標y，濃度（c）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程為Y=69.5742505X-12.949778。r=0.9999。結果表明，硝苯地平在2.776-111.04μg/ml濃度范圍內峰面積與濃度均呈良好線性關系。（6）精密度試驗：取同一濃度硝苯地平對照品溶液，分別與1d內和4d內按供試品測定項下操作。測得硝苯地平日內RSD為0.73%（n=6），日間RSD為2.10%（n=6），表明儀器精密度良好。（7）加樣回收率試驗：取已知含量的供試品6份，每份約25mg，精密稱定，按高、中、低劑量分別精密加入硝苯地平精制品，混勻，按供試品測定項下方法操作，測定其峰面積，按外標法計算。結果如表1。
表1 加樣回收率試驗結果
3 討論
主要選擇使用了三種流動相：（1）甲醇與水，比例為60：40;（2）甲醇與1%的冰醋酸，分別為60：40，70：30;3、1%冰醋酸與甲醇，比例為60：40;65：35;70：30，在使用前兩種流動相時，發現其形成的品峰形效果不佳，存在著比較拖尾的現象，最終選擇使用第三種流動相，其比例為70：30，這一比例不僅能夠使陽平形成效果比較好的峰形，而且干擾條件比較少，能夠達到徹底的分離。智能水凝膠的制備載體主要是高分子材料，在對此進行制備時，需要對樣品進行前期處理，而且處理時還需要考慮高分子材料自身對樣品含量會產生相應的影響。另外，高分子材料與樣品中的藥物主要是以氫鍵的形式而存在，必須破壞這種氫鍵，否則藥物難以以要求的形式存在，而影響研究效果。本研究中所使用的枸櫞酸鹽緩沖液，以此來實現復合物的分離的目的。硝苯地平對光敏感，需避光。本文方法所得到的結果準確度高，操作簡單，此外，重現性好，能夠達到預期的回收效果，可以用來控制硝苯地平智能水凝膠的質量。
參考文獻
[1]廖列文，龔濤，周靜，周新華，崔英德.DMAEMA系列智能水凝膠的研究進展[J].化工進展，2011（2）.
[2]陳旭日，陳學剛.新型P（NIPAAm-co-IA）pH敏感智能水凝膠的合成與性能研究[J].化學推進劑與高分子材料，2011（2）.
[3]侯紅瑞，張平泰.智能水凝膠在給藥系統中的應用[J].價值工程，2011（15）.
【摘要】 目的研制康復新凝膠劑的制備工藝與質量控制。方法用卡波姆-980NF作為基質，甘油為潤濕劑，三乙醇胺為中和劑，制成凝膠劑，采用薄層色譜法對5種氨基酸和嘧啶堿進行鑒別，采用紫外分光光度法測定氨基酸（以丙氨酸計）含量，建立質量標準，考察其穩定性。結果凝膠劑制備工藝可行，其組成藥物可采用薄層色譜法鑒別；其pH值為5.0～7.0，平均回收率為98.44%，RSD=1.38%，穩定性好。結論 康復新凝膠制備工藝簡便，質量可控，穩定性好，值得推廣應用。
【關鍵詞】 康復新凝膠； 制備工藝； 質量控制； 穩定性
Abstract：ObjectiveTo study the preparation and quality control of Kangfuxin gel.MethodsCarbopol-980NF was used as the gel matfix，Glycerin as wetting agent and triethanolamine as neutralizer. The Kangfuxin gel was prepared and TLC and UV-spectrometry methods were applied to identify. Its quality criteria was established and the stability were inspected. ResultsThe preparing technology of gels was feasible. Its compositions were identified by TLC and its pH value was 5.0～7.0， the average recovery rate of the technolgy were 98.44%，RSD=1.38%， and its stability determined the contents amino acids and pyrimidine base. ConclusionThe preparation of Kangfuxin gel is simple， stable and controlable.
Key words:Kangfuxin gels； Preparation； Quality control； Stability
康復新凝膠劑是由美洲大蠊單味藥組成的外用制劑，該處方的液體制劑康復新液是較為成熟的一種劑型，具有通利血脈，養陰生肌的作用， 用于金瘡、外傷、潰瘍、瘺管、燒傷、燙傷、褥瘡之創面，療效確切。由于液體制劑不易涂布，易流失，藥效維持時間較短，而凝膠劑是一種新型外用劑型，用于皮膚表面，其涂抹性好，無油膩感，不污染衣物，透皮吸收速度比洗液快，與外用溶劑相比較，凝膠劑皮膚表面停留時間長，是一種使用方便、透皮吸收速度快的優良劑型，本文將該液體制劑的處方研制成凝膠劑，效果良好。現將該凝膠劑的制備工藝與質量評價報告如下。
1 儀器與試藥
TU1901紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)；sartoriusBP211D電子天平（感量0.1 mg；0.01 mg。載量210 g；80g）；水浴鍋（北京中興偉業儀器有限公司）；autoscience超聲波清洗器；PHS25型酸度計（上海雷磁儀器廠），卡波姆980NF（美國諾譽化工有限公司）；十八種氨基酸(套)對照品（624200104供含量測定用 中國藥品生物制品檢定所）；美洲大蠊（購于成都市五塊石市場，符合《湖南省藥材標準》1993年版“美洲大蠊”項下相關規定）。
2 處方及制備
2.1 處方組成
美洲大蠊100 g，卡波姆-980NF10 g，甘油50 g，山梨酸3 g，乳化香精0.2 g，三乙醇胺適量。
2.2 制備方法
取美洲大蠊粉碎成粗粉，用70%乙醇提取3次，合
提取液，濾過，回收乙醇，濃縮至相對密度1.35（70℃）的稠膏，備用；取卡波姆980NF 10 g，撒于適量蒸餾水中，靜置，使充分溶脹；加入甘油、山梨酸、乳化香精攪勻，加入上述稠膏，攪勻；加入三乙醇胺，調pH值至5.0～7.0；加蒸餾水至1000 g，攪勻，分裝，即得。
3 質量控制
3.1 性狀
本品為淡黃色至棕黃色透明狀膠體，氣香。
3.2 pH值
取本品1 g，加水20 ml稀釋后，測定pH值(《中國藥典》2005年版Ⅰ部附錄Ⅶ G) 5.0～7.0，符合有關皮膚給藥的規定。
3.3 穩定性實驗
3.3.1 耐熱實驗
取本品3份，每份10 g，于60℃恒溫箱內保存24 h，取出，放至室溫，均無分層現象。
3.3.2 耐寒實驗
取本品3份，每份10 g，于-10℃條件下冷藏24 h，取出，放至室溫，均無分層現象。
3.3.3 離心實驗
取本品3份，每份10 g，裝于離心管中，離心30 min（3000 r/min），均無分層現象。
3.4 鑒別
3.4.1 氨基酸鑒別
取本品7.5 g，加水100 ml使溶解，加于已處理好的732型陽離子交換樹脂柱（內徑1 cm，床高10cm）上，用水100 ml洗脫，棄去水液，再用氨試液40 ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加70%乙醇1ml使溶解，作為供試品溶液。另取丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸對照品，分別加70%乙醇制成每毫升各含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法《中國藥典》2005年版Ⅰ部（附錄VI B）實驗，吸取上述兩種溶液各2～5 μl，分別點于同一含羧甲基纖維素鈉為粘合劑的硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰乙酸-水（4∶1∶1）為展開劑，展開18 cm，取出，晾干，噴以茚三酮試液，熱風吹至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。
3.4.2 嘧啶堿鑒別
取本品5 g，加水100 ml使溶解，加于已處理好的732型陽離子交換樹脂柱（內徑1.5 cm，床高2 cm）上，收集流出液，用0.1 mol/L鹽酸溶液10ml洗滌，收集洗滌液，與流出液合并，用2 mol/L氫氧化鈉溶液調pH值至2.1～2.5，于沸水浴上濃縮至約5 ml，放冷，作為供試品溶液。另取尿嘧啶對照品，加水制成每毫升含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2005年版Ⅰ部附錄VI B）吸取上述溶液5～10 μl分別點樣于同一硅膠GF254薄層板上，以水飽和正丁醇溶液作展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(254 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同的主斑點。
3.5 含量測定
3.5.1 對照品溶液的制備
精密稱取105℃干燥至恒重的丙氨酸對照品50 mg，置100 ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 ml，置100 ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得(每毫升相當于丙氨酸25 μg)。
3.5.2 供試品溶液的制備
精密稱取樣品2 g，置100 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，劇烈振搖，即得。
3.5.3 測定波長的選擇
將丙氨酸對照品和康復新凝膠樣品，在450～800 nm間掃描，丙氨酸在570 nm 處有最大吸收，康復新凝膠樣品在570 nm有最大吸收，故確定以570 nm為測定波長。
3.5.4 線性關系的考察
精密量取對照品溶液（25.86μg/ml）0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ml分別置10ml具塞試管中，加水至1.0ml，加0.2mol/L枸櫞酸緩沖液（pH5.0）1.0 ml，1%抗壞血酸溶液0.1 ml，茚三酮乙二醇甲醚試液3.0 ml，搖勻，置沸水浴中加熱15 min，取出，放冷，再加80%乙醇3.0 ml，搖勻，照分光光度法(《中國藥典》2005Ⅰ部附錄Ⅴ B)試驗，在570nm波長處測定吸收度，以吸收度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。結果見表1。表1 標準曲線測定數據（略）
3.5.5 測定法
精密量取供試品溶液1 ml置10 ml具塞試管中。照標準曲線的制備方法，自“0.2 mol/L枸櫞酸緩沖液（pH5.0）1.0 ml”起，測定樣品吸光度，從標準曲線譜中求得供試品中氨基氮的含量，計算即得。
3.5.6 精密度實驗
取樣品（批號051001）2 g，按“3.5.2供試品溶液的制備”項下制備供試品溶液，再按“3.5.5測定法”項下重復測定6次，吸收度（A）的相對標準偏差為0.91%。結果見表2。表2 精密度考察結果（略）
3.5.7 穩定性實驗對照品溶液的穩定性考察： 取丙氨酸對照品溶液，于制樣后15，20，25，30，40，60 min測定，結果見表3。表3 丙氨酸對照品溶液的穩定性考察（略）
實驗所得RSD為0.85%，說明丙氨酸對照品溶液在制樣后60 min內測定穩定。
供試品溶液的穩定性考察 ：取樣品（批號051001）2 g，精密稱定，按“3.5.2供試品溶液的制備”項下制備供試品溶液，再按“3.5.5測定法”項下于制樣后15，20，25，30，40，60 min測定，結果見表4。表4 供試品溶液的穩定性考察（略）
實驗所得RSD為1.09%，說明供試品溶液在制樣后60 min內測定穩定。
3.5.8 重復性實驗
取同一批樣品（批號051001），稱取6份，每份2 g，精密稱定，按“3.5.2供試品溶液的制備”項下制備供試品溶液，再按“3.5.5測定法” 項下進行含量測定，結果見表5。表5 重復性實驗（略）
3.5.9 回收率實驗
取已知含量的供試品（051001，含量0.674 mg/ml）2 g，精密稱定，置100 ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，精密量取0.5 ml置10 ml具塞試管中，精密加入對照品（C＝25.86 μg/ml）0.5 ml，按“3.5.5”項下測定法進行含量測定，計算回收率，結果表明回收率的重現性好。結果見表6。表6 回收率測定結果（略）
回收率（%）=實測總氨基酸含量－樣品中總氨基酸含量對照品加入量×100%
4 討論
4.1 本品選用卡波姆-980NF作為水溶性凝膠基質，具有無油膩感、無刺激、易于涂布、皮膚偶合效果好等優點［3］；處方中甘油作為潤濕劑和保濕劑；卡波姆-980NF形成水凝膠在pH﹤3或pH﹥12時黏度降低，故選用三乙醇胺調pH值為5.0～7.0［4～8］。
4.2 本品原劑型有腥味，難以為病人所接受，為調節本品的氣味，選用了乳化香精作為矯嗅劑，用量為0.02%。
4.3 本品曾選擇腺苷為含量測定指標，采用HPLC法對腺苷含量進行測定，以甲醇-0.3%冰醋酸（3∶97）為流動相，結果由于流動相中水相比例很大，色譜柱所需平衡時間較長，柱效下降也較快，測定的值很低，樣品中腺苷含量為1.51～2.72 μg，容易導致檢測數據的波動與誤差；同時對色譜柱損害較大。鑒于上述實驗的結果，使用紫外分光光度法進行的含量測定方法比較合理、科學，而且對產品質量的考核比較實用，故最終仍采用紫外分光光度法對氨基酸含量（以丙氨酸計）進行測定，并對其方法學進行考察。
本研制的康復新凝膠外觀光潔透明，手感細膩，無刺激性，無油膩性，易于清洗，含量測定簡單易行。
【參考文獻】
［1］張兆旺.中藥藥劑學［M］.北京：中國中醫藥出版社，2002：307.
［2］謝秀瓊.中藥新制劑開發與應用，第2版［M］.北京：人民衛生出版社，2000：83.
［3］國家藥典委員會.中國藥典，Ⅱ部［S］.北京：化學工業出版社，2005：897.
［4］曾凡林，萬新祥，楊 芳.克癬靈凝膠劑的研制與質量評價［J］.第一軍醫大學分校學報，2003，26（6）：6.
［5］羅 毅，馬俊玲，黃傳俊，等.柏竹凝膠劑的制備［J］.中國藥師，2005，8（4）：301.
［6］劉 福，吳功柱. 鹽酸蘆氟沙星凝膠劑的研制［J］.中國藥房，2003，14（11）：665.
【關鍵詞】頭孢地嗪鈉;高分子聚合物;分析;驗證
抗生素是臨床用量最大和較易發生不良反應的藥物。其中最常見的一類不良反應就是過敏反應。多年來的研究已證明,在β-內酰胺類抗生素所致的速發型過敏反應中,藥物分子本身只是半抗原,藥物中存在的高分子聚合物才是引發速發型過敏反應的真正過敏原,因此嚴格控制抗生素中高分子聚合物的含量有著重要的意義。
頭孢地嗪是德國赫斯特公司和法國羅塞爾公司共同開發的第三代注射用頭孢菌素類抗生素,同時也是世界上第一個具有免疫增強功能的第三代頭孢菌素,1990年首次在日本上市。與頭孢三嗪、頭孢氨噻肟等頭孢菌素相似,在7位上具有一個含氨基噻唑結構(亞氨甲氧基氨噻唑)的側鏈,這一結構使其不僅保持了對G+菌的抗菌活性,而且對G-菌也有效,并對β-內酰氨酶穩定。此外,在3'位上的巰基噻唑結構,使頭孢地嗪不易被酶降解,在動物和人體中的半衰期明顯延長,由于此基團賦予化合物獨特的性質,使得頭孢地嗪在廣譜抗菌的同時,還具有其他頭孢類藥物所不具備的免疫增強作用,因此具有廣泛的臨床應用前景。
關于高分子聚合物的測定方法,國內外已有許多報道,主要的方法是色譜法。其中,以葡聚糖凝膠Sephadex G-10為基礎的凝膠色譜分析方法在中國藥典2005年版頭孢類聚合物檢查方法中普遍采用。本文參照中國藥典2005年版附錄分子排阻色譜法的相關要求,對頭孢地嗪鈉聚合物的檢查方法進行研究。
1.試驗儀器及試驗材料
1.1儀器
LC-10AT高效液相色譜儀;色譜柱:Sephadex G-10柱,柱內徑1.5cm,柱高度40cm。
1.2供試品、對照品與試劑
頭孢地嗪鈉來源于浙江永寧藥業股份有限公司(批號:S081205);藍色葡聚糖2000來自sigma公司;頭孢地嗪對照品(批號:130520-200501),含量為88.6%,由中國藥品生物制品檢定所提供;其他試劑均為分析純。
2.試驗方法
2.1 流動相選擇
參照中國藥典2005年版頭孢類聚合物檢查方法,以pH7.0的0.3mol/L磷酸鹽緩沖液〔0.3mol/L磷酸氫二鈉溶液-0.3mol/L磷酸二氫鈉溶液(61:39)〕為流動相、檢測波長為254nm對樣品進行測定,見色譜圖1,聚合物峰分裂。因此,將流動相鹽的濃度降低,以pH7.0的0.2mol/L磷酸鹽緩沖液〔0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液-0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液(61:39)〕為流動相對樣品進行測定,見色譜圖2,聚合物峰峰形好。
圖1 0.3mol/L磷酸鹽緩沖液為流動相聚合物峰分裂圖譜
圖20.2mol/L磷酸鹽緩沖液為流動聚合物峰相圖譜
2.2 色譜條件
照分子排阻色譜法(中國藥典2005版二部附錄V H)測定。
用葡聚糖凝膠G-10(40～120μm)為填充劑;柱內徑1.5cm,柱高度40cm。以pH7.0的0.2mol/L磷酸鹽緩沖液〔0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液-0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液(61:39)〕為流動相A,以水為流動相B,流速約為每分鐘1.0ml,檢測波長為254nm。分別以流動相A、B為流動相,取0.1mg/ml藍色葡聚糖2000溶液200μl,注入液相色譜儀,理論板數以藍色葡聚糖2000峰計算均不得低于700。拖尾因子均應小于2.0。在兩種流動相系統中藍色葡聚糖2000峰保留時間的比值應在0.93～1.07之間,對照溶液主峰和供試品溶液中聚合物峰與相應色譜系統中藍色葡聚糖2000峰的保留時間的比值應在0.93～1.07之間。另以流動相B為流動相,精密量取對照溶液200μl,連續進樣5次,峰面積的相對標準偏差應不大于5.0%。
2.3 進樣量及溶劑的選擇
參照中國藥典2005年版頭孢類聚合物檢查時所采用的進樣濃度,取樣品約0.2g,精密稱定,置10ml的量瓶中,加流動相A使溶解并稀釋到刻度,搖勻,立即精密量取200μl注入液相色譜儀,以流動相A為流動相進行測定,見色譜圖2,由圖譜可知,進樣量過高,檢測器過載,為達到進樣的準確性,將取樣量分別更改為0.04g,0.02g,按照上述方法同法測定,見色譜圖3、4,由圖譜可見,當取樣量為0.02g時,聚合物峰峰形好,聚合物峰結束點高度約為5000,聚合物峰高為13485,與主峰分離度約為2.6。另取樣品以水為溶劑制成相同濃度的供試品,同法進行測定,見色譜圖5,與用流動相A溶解的樣品色譜峰相比,聚合物峰的保留時間和峰面積均無明顯差異,因此采用水或是流動相為溶劑不影響測定結果。
圖3進樣量為0.04g時圖譜圖4進樣量為0.02g時圖譜圖5以水為溶劑配制供試品溶液時圖譜
2.4 系統適用性試驗
取頭孢地嗪鈉適量,精密稱定,加水溶解并定量稀釋制成每1ml中約含10μg的溶液,以流動相B為流動相,精密量取200μl,連續進樣5次, 結果見下表。
分別以流動相B、A為流動相,取0.1mg/ml藍色葡聚糖2000溶液200μl,注入液相色譜儀,理論板數以藍色葡聚糖2000峰計算在流動相A中為1140,在流動相B中為1182;拖尾因子在流動相A中為1.497,在流動相B中為1.209,均小于2.0;保留時間在流動相A中為7.940,在流動相B中為7.548,保留時間的比值為0.95。
取樣品約0.02g,精密稱定,分別置10ml量瓶中,加流動相A溶解并定量稀釋至刻度,搖勻,立即精密量取200μl注入液相色譜儀,以流動相A為流動相進行測定,樣品聚合物峰保留時間為8.040。
流動相B中對照溶液主峰與藍色葡聚糖2000峰的保留時間的比值為1.02,流動相A中供試品溶液聚合物峰與藍色葡聚糖2000峰的保留時間的比值均為1.01。
2.5 線性關系考察
考察對照品溶液濃度在規定濃度的20%～200%范圍內的線性關系。取頭孢地嗪鈉對照品適量,精密稱定,加水溶解并定量稀釋制成每1ml中約含20μg的溶液,作為對照品濃溶液,分別精密量取適量,用水定量稀釋制成濃度分別為20μg/ml,10μg/ml,5μg/ml,2μg/ml,1μg/ml的對照品溶液,以流動相B為流動相,精密量取上述對照溶液各200μl,分別注入液相色譜儀,每個濃度分別重復進樣兩次,測定數據見下表。
根據以上測定的數據,以兩次測得峰面積的平均值為縱坐標,濃度為橫坐標作圖
圖10.4.6-23
線性方程為y=508968x+49027 R2=0.9991
結果表明,頭孢地嗪鈉在濃度1～20μg/ml的范圍內線性關系良好。
2.6 重復性試驗
取樣品約0.02g,置10ml量瓶中,加流動相A溶解并定量稀釋至刻度,搖勻,立即精密量取200μl注入液相色譜儀,以流動相A進行測定,同批樣品重復測定6次,另取頭孢地嗪鈉對照品適量,精密稱定,加水溶解并定量稀釋制成每1ml中約含10μg的溶液,精密量取200μl注入液相色譜儀,以流動相B為流動相進行測定,按外標法以峰面積計算聚合物含量,結果見下表。
結果表明,連續測定6次的重復性良好。
2.7 溶液穩定性
取樣品約0. 2g,置100ml量瓶中,加流動相A溶解并定量稀釋至刻度,搖勻,室溫放置,分別于0h,1.5h,3h,4.5h,6h精密量取200μl注入液相色譜儀,以流動相A進行測定,記錄色譜圖, 0～6h聚合物峰面積分別為:569895、676157、1552240、1802178、2121692,由以上數據可知,隨供試品放置時間延長,聚合物峰面積增大,在進行聚合物測定時,供試品溶解后應立即進樣。
2.8 檢測限與定量限
配制不同濃度的頭孢地嗪鈉供試品溶液,測定相應聚合物的峰高,同時測定相同條件下的色譜基線噪音,取基線噪音約10倍值的量作為頭孢地嗪鈉的定量限,求得其定量限為2μg;取基線噪音約3倍值的量作為頭孢地嗪鈉的最低檢測限,求得其最低檢測限為0.8μg。
2.9結論
根據以上分析方法的篩選及方法學驗證數據結果,采用所選擇的檢測方法,專屬性強,能有效檢出頭孢地嗪所產生的聚合物,適合于對頭孢地嗪鈉進行聚合物的定量分析。
參考文獻
[1]《中華人民共和國藥典》二部附錄分子排阻色譜法[S],2005版
關鍵詞 液相色譜技術；農藥殘留；獸藥殘留；安全檢測
中圖分類號 O657.7+2 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2015）08-0290-02
2015年，我國政府進一步加大了對食品安全問題的政策性導向。國務院總理在政府報告中指出，綜合治理農藥獸藥殘留問題，全面提高農產品質量和食品安全水平。為了貫徹中央的精神，農業部近期出臺了相關具體工作精神，目的就是持續狠抓農產品質量安全監管，有效保障“米袋子”“菜籃子”和“肉盤子”的安全。為此，各級農檢中心都在積極協調人員，集中對各類農產品質量安全檢測技術進行專題式培訓。目前，結合自身工作實際，本文就液相色譜檢測技術在農產品中的應用研究進行簡單闡述，目的是使人們進一步認識到液相色譜技術在農產品農藥殘留分析中的重要意義。
1 液相色譜技術
液相色譜法的分離機理是基于混合物中各組分對兩相親和力的差別。根據固定相不同，可分為液固色譜、液液色譜和鍵合相色譜，其中以液固色譜（以硅膠為填料）和鍵合相色譜（以微硅膠為基質）應用最廣。根據固定相形式的不同，液相色譜法可分為柱色譜法、紙色譜法及薄層色譜法。按吸附力可分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜和凝膠滲透色譜。近年來，在液相柱色譜系統中加上高壓液流系統，使流動相在高壓下快速流動，以提高分離效果，因此出現了高效液相色譜法（HPLC）。而超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）借助于HPLC的理論及原理，增加了分析的通量、靈敏度及色譜峰容量。目前，超高效液相色譜儀已經開始逐漸地投入液相試驗中。
2 液相色譜技術在初級農產品檢測中的應用
氣相色譜法由于受技術條件的限制，無法對高沸點物質或熱穩定性差的物質進行分析。而液相色譜法不需要氣化，不受試樣揮發性的限制。對于高沸點、熱穩定性差、相對分子量>400的有機物（占有機物總數的75%～80%），原則上都可應用液相色譜法進行分離、分析。在已知化合物中，能用氣相色譜法、液相色譜法進行分析的分別占約20%、70%～80%。
2.1 液相色譜檢測技術在農藥殘留檢測中的應用
隨著人口的不斷增長，對食物的產量提出了更高的要求，農藥的產量和應用量也就不斷加大，農藥殘留的危害也日益顯著，已經引起全世界的關注。很多科研技術工作者也展開了對農藥殘留的技術分析工作，為政府部門做好技術保障。
田宏哲等[1]為建立同時測定牛奶中6種氨基甲酸酯類農藥殘留量的方法，樣品經乙腈提取，Oasis HLB固相萃取柱凈化后，采用高效液相色譜――離子阱質譜（HPLCESI-MS/MS）進行測定，測定條件為：C18色譜柱分離，甲醇―0.02mol/L醋酸銨溶液梯度洗脫，多反應監測模式檢測。結果表明，6種殺蟲劑的定量限、平均添加回收率、相對標準偏差分別為1.0～10.0 μg/kg、79.21%～91.38%、3.44%～5.71%，表明該測定方法完全可以滿足當前農藥殘留分析的要求。
劉 謙等[2]應用快速溶劑萃取技術（ASE）――固相萃取―高效液相色譜串聯質譜（HPLC/MS/MS）建立蘋果、梨、橙子、橘子、草莓等水果和菜花、蘑菇、蘆筍、豆角、黃瓜等蔬菜中吡蟲啉、多菌靈、5種氨基甲酸酯類農藥殘留的新分析方法。樣品由甲醇提取，固相萃取MCX柱凈化，質譜檢測器檢測。結果證明，在所選的水果和蔬菜中吡蟲啉、多菌靈回收率為78.0%～104.0%，相對標準偏差為3.2%～7.6%；5種氨基甲酸酯類農藥回收為82.0%～108.0%，相對標準偏差在5.4%～9.8%。吡蟲啉、多菌靈和5種氨基甲酸酯類農藥樣品中的最低檢出濃度分別為2.0、2.0、5.0 μg/kg。
彭媛芳等[3]建立了高效液相色譜法測定豬、牛、羊、雞法人肝臟和雞肉組織中的辛硫磷殘留量的檢測方法。樣品經乙酸乙酯提取，經C18固相萃取柱凈化，80%乙腈―水溶液定容，以65%乙腈―水溶液為流動相，經高效液相色譜儀測定，外標法定量。結果表明：辛硫磷標準溶液在50～2 000 μg/L范圍內呈良好的線性關系，R2均為0.999 9，方法檢出限為10 μg/kg，最低定量限為20 μg/kg，在20、50、100 μg/kg添加水平上，辛硫磷的回收率為70%～120%，批內批間RSD均小于20%。該殘留檢測技術具有簡便、靈敏、定性定量準確、可靠的優點，滿足動物性食品安全檢測的要求。
2.2 液相色譜檢測技術在獸藥殘留檢測中的應用
隨著人們生活水平的日益提高，傳統的飲食原料需求正在從植物性食品向動物源食品轉變。然而，動物性食品原料也已經受到了獸藥殘留的影響，慢慢成為全世界關注的另外一個焦點。但由于部分人員對藥物使用出現了偏差，致使濫用獸藥現象日益突出。
高廣慧等[4]建立高效液相色譜法測定牛、羊肉中土霉素、四環素和金霉素殘留量的檢測方法。采用甲醇提取，用甲醇飽和的正己烷去除脂溶性雜質，用5%高氯酸沉淀蛋白。采用C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為0.01 mol/L磷酸二氫鈉（含0.5%磷酸）溶液―乙腈=81∶19（體積比），檢測波長為350 nm。霉素、四環素和金霉素的分離度好，土霉素、四環素和金霉素的提取回收率分別為80.7%、78.6%和80.4%（n=9）。本方法操作簡單，結果準確，可以有效地控制牛、羊肉中土霉素、四環素和金霉素殘留量。
高月明等[5]將水產品樣品中殘留的孔雀石綠用硼氫化鉀還原為其代謝產物隱色孔雀石綠，經前處理試劑盒提取，固相萃取柱凈化、反向色譜柱分離，用液相色譜儀熒光檢測器檢測。方法的回收率在84.5%～92.1%，相對標準偏差4.09%～5.26%，檢出限為0.5 μg/kg。結果表明：該方法檢測孔雀石綠前處理過程簡單，靈敏度高，能快速對大量樣品進行定量分析。
余 曉等[6]建立高效液相色譜法測定魚、蝦和雞肉中的呋喃唑酮殘留量的方法。色譜條件為Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）柱，流動相乙腈―0.1%磷酸水溶液（30∶70，V∶V），流速1.0mL/min，檢測波長365 nm，柱溫25 ℃。結果表明，呋喃唑酮標準溶液在0.2～5.0 ng范圍內與峰面積呈良好的線性關系，檢出限為0.2 μg/kg。樣品平均加標回收率為97.7%～102.9%，RSD為1.1%～1.5%（n=6）。該方法簡單、快速、靈敏度高、重復性好，適用于魚、蝦和雞肉中的呋喃唑酮殘留量的分析。
3 結語
目前，世界各國對輸入本國的農產品的質量要求極為苛刻，藥物殘留已經成為影響我國對外貿易的最大隱患。就我們國家目前的檢測技術力量和裝備而言，液相色譜檢測技術已經成為我國比較普及的一種新型技術，也是當前一種主流的分析方法，該方法的靈敏度好、速度快、范圍廣、效率高，正在農產品質量安全檢測中發揮著難以取代的作用，依然將是我們國家政府部門對藥物殘留監測的重要手段。
4 參考文獻
[1] 田宏哲，趙瑛博，周艷明.高效液相色譜-質譜法測定牛奶中6種氨基甲酸酯農藥殘留[J].食品科學，2011，32（1）：187-190.
[2] 劉謙，顏紅.蔬菜、水果中的吡蟲啉、多菌靈和5種氨基甲酸酯類農藥殘留測定[J].農藥科學與管理，2013，34（2）：24-28.
[3] 彭媛芳，高迎春，陳玲，等.高效液相色譜法測定動物性食品中辛硫磷殘留量的研究[J].中國獸藥雜質，2011，45（7）：26-29.
[4] 高廣慧，李陽，孫曉娟，等.HPLC法測定牛羊肉中土霉素、四環素、金霉素殘留量[J].食品研究與開發，2013，34（16）：94-96.
【關鍵詞】色譜;聯用技術;抗生素;雜質
【Abstract】Objective The effect of the application of Modern Chromatography and combined technology in the analysis of the impurities in antibiotic drugs is analyzed.Method Using high phase liquid chromatography， the four stage of the flight time of the two groups was analyzed by the method of flight time of 9 rods， and the impurities were analyzed. The results showed that 3 impurities were divided into 1 groups： two，， 1 and 6.Result A total of 10 impurities were analyzed， and 3 were polymer impurities， which were divided into two groups of 1， 1 and 6 of the polymer.Conclusion High phase liquid chromatography and four bar flying time mass spectrometry were used to analyze the qualitative analysis of the raw materials， and the more impurity types could be detected， which could be used to provide a reference for controlling the impurity content of the polymer.
【Key words】Chromatography;Combined technology;antibiotic;impurity
羧芐西林鈉是廣譜青霉素類抗生素，羧芐西林鈉主要通過抑制細胞壁合成發揮殺菌作用，具有無臭無味、對熱不穩定和吸濕性強的特點。羧芐西林鈉的過敏作用是的廣大醫學工作者關注的重點，也是世界性醫學難題[1]。多數研究報道羧芐西林鈉產生過敏的主要原因在于高分子聚合物雜質多，β―內酰胺換和原料在生產、存儲和使用環節都可能混入雜質，形成二聚體、三聚體和四聚體等高聚物。因本文采用高相液相色譜―四級桿飛行時間質譜聯用法分析羧芐西林鈉原料藥中的雜質成分，為生產、存儲和使用羧芐西林鈉提供指導，減少不良反應，提高藥物的安全性?，F報告如下：
1.實驗部分
1.1實驗試劑和儀器
實驗試劑包括羧芐西林鈉、乙腈、醋酸銨、水，羧芐西林鈉由石藥集團中諾藥業（石家莊）有限公司生產，批準文號國藥準字H13021987;乙腈及醋酸銨均為HPLC級;水由Millipore Milli-Q Gradient A10純水儀制備。高效液相色譜儀為Agilent 1290型，四級桿飛行時間質譜聯用儀為Agilent 6530型。
1.2實驗條件
（1）HPLC-MS條件 使用色譜柱Agilent Poroshell EC C18柱（2.7μm，3.0mm×150mm），流動相A為5 mmol/L醋酸銨水溶液，流動相B為5 mmol/L醋酸銨乙腈溶液，柱溫為35℃，波長254mm，流速0.3mL/min，進樣量8μL，梯度洗脫時間分為0～21min，具體梯度脫洗時間見表1。電子噴霧離子源，采集模式為正離子模式，干燥氣溫度和氣流速度分為為350℃和8L/min，霧化壓力為45psi，傳輸電壓120V，質子范圍 50～1500m/z。
表1 梯度洗脫時間
1.3試品溶液制備
使用精密儀器稱取適量羧芐西林鈉，加入適量水，將羧芐西林鈉稀釋為1mg/mL溶液作為試品溶液。
2.結果
共分析出10個雜質，3個為聚合物雜質，分為二聚體1個、三聚體1個和6―氨基青霉烷酸與羧芐西林開環物的聚合物1個。
3.結果分析
羧芐西林鈉的分子式為C17H16N2O6SNa2，工業生產中采用6―氨基青霉烷酸（6―APA）和苯丙二酸復合而成[2]。由于實驗研究均認為雜質是導致羧芐西林鈉產生過敏、神經系統反應、高鈉和低鉀血癥、急性代謝性酸中毒、念珠菌二重感染的主要原因[3]，因此許多國家都非常重視分析羧芐西林鈉的雜質成分，為指導生產、存儲和使用羧芐西林鈉過程減少雜質形成提供參考。
目前英國藥典[4]采用HPLC梯度洗脫系統測定羧芐西林鈉的雜質成分，研究結果顯示該檢測方法檢測出8個雜質的結構式，但是未對相對保留時間做出規定，也沒有其它雜質對照品，因而色譜系統無法對雜質峰值進行指認;HPLC梯度洗脫系統測定時間達1h，測試時間長。此外，HPLC梯度洗脫系統無法檢出致敏性高聚物雜質。其它相關研究[5-7]分別將反相高效液相色譜法、離子交換色譜法、凝膠色譜法、反相高效液相色譜―凝膠色譜串聯法、高效毛細管電泳法等多種分析方法用于羧芐西林鈉的雜質成分分析，以上方法均存在不同程度分析效果不佳、分離雜質類型少的缺點。而羧芐西林鈉的雜質屬于高聚物雜質，對分析效果的要求更高[8]。因此，本研究采用高相液相色譜―四級桿飛行時間質譜聯用法分析羧芐西林鈉原料藥。
對羧芐西林鈉的主成分分析發現，主成分液相色譜圖呈兩個色譜峰，兩色譜峰[M+H]+均為379.0956，結合主成分二級質譜圖特點，色譜峰分別為羧芐西林R、S差異構體，既色譜系統可有效分離該兩種立體異構體。同時，羧芐西林鈉6―位側鏈上的手性碳原子相連的氫原子的活性較強，易發生差相異構。但是立體化學異構體對療效的影響作用極小，因而可判定為有效成分。
關鍵詞：HPLC；紅花微乳；羥基紅花黃色素A
中圖分類號：R284.1文獻標識碼：A文章編號：1673-7717(2012)03-0495-02
Determination of Carthamus Tinctorious-containing Microemulsion by HPLC
JI Xinyan1,2，LIU Yaming2，FENG Qianjin2，ZHAO Junyun1，CHANG Ruihua2，FENG Wenquan2，LIANG Hongjuan2
(1.Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China；
2.Shanxi College of Traditional Chinese Medicine，Taiyuan 030024，Shanxi，China)
Abstract:Objective：To establish a method for the determination of hydroxyl safflor yellow A(HSYA) in Carthamus tinctorious-containing microemulsion．Method：The HPLC was used with Diamonsil C18(2) column(50mm×4.6mm，5μm),detection wavelength at 402nm, mobile phase methanol-water(pH3.3) 30∶70, flow rate:0.8mL/min. Results：HSYA has good linear relationship between 0.3128～3.128μg, r=0.9990,the recovery of HSYA was 99.93% and RSD was 1.86%(n=6). Conclusion：The method is simple, sensitive and reliable to carry out to control the assay of Carthamus tinctorious-containing microemulsion transdermal delivery system.
Key words:HPLC；Carthamus tinctorious-containing microemulsion；hydroxyl safflor yellow A
收稿日期：2011-10-27
基金項目：國家科技攻關計劃資助項目（2004BA721A46）；山西省科技廳資助項目（2011091014）
作者簡介：季新燕（1977-），女，山西長治人，博士研究生，研究方向：中西醫結合基礎。
通訊作者：劉亞明（1957-），男，山西臨縣人，教授，博士研究生導師，研究方向：中藥方劑學與中藥制劑新技術。紅花為菊科植物紅花(Carthamus tinctorious L．)的干燥花，為中藥活血化瘀藥，常用于治療跌打扭傷、活血止痛，主要藥效成分羥基紅花黃色素(hydroxyl safflor yellow A，HSYA )具有抗炎鎮痛的作用，能增大毛細血管的直徑和開放數[1]。有臨床實踐報道，紅花利多卡因醇、紅花冰片等均有較好的抗炎鎮痛作用[2-3]，目前尚無成熟制劑上市，且使用樣品量不確切，臨床應用推廣不方便等，本實驗室以微乳為藥物載體，將其制備成外用制劑，為更好地研究紅花微乳透皮和質量的控制, 建立了高效液相色譜法（HPLC）監控主要藥理活性成分羥基紅花黃色素A的含量,本方法簡單易行,重復性好,準確可靠。
1儀器與藥品
戴安summitP680高效液相色譜儀,summitP680A低壓四元泵,PDA-100二極管陣列檢測器，ASI-100自動進樣器,summit柱溫箱，Chromeleon色譜工作站；紫外掃描分光光度計（Cary 50，Varian）。
羥基紅花黃色素A標準品溶液（濃度為0.1564mg/mL,山西太原華衛藥業提供），甲醇，磷酸為色譜純;水為超純水;其余為分析純，紅花水提液（山西太原華衛藥業提供），紅花微乳（實驗室自制，批號分別為：101220,110320,110504）。
2方法與結果
2.1色譜條件色譜柱：Diamonsil鉆石C18(2)5μm，250mm×4.6 mm；流動相：甲醇-0.4%的磷酸水溶液（三乙胺調至pH=3.30）為30∶70；檢測波長：402nm；柱溫：室溫。流速0.8mL/min。在此色譜條件下，羥基紅花黃色素A的保留時間約6.9min。
2.2對照品溶液制備精密稱取羥基紅花黃色素A對照品適量，用25%甲醇制成0.0156mg/mL的對照品溶液。
2.3供試品溶液制備精密吸取復方紅花微乳1.0mL，用25%甲醇定容于10mL容量瓶中，搖勻，用0.45μm濾膜濾過作為樣品溶液。
2.4線性考察精密稱取105℃干燥至恒重的羥基紅花黃色素A對照品，加25%甲醇制備得質量濃度為0.1564mg/mL貯備液，分別取2、5、10、15、20μL，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定羥基紅花黃色素A的峰面積。以羥基紅花黃色素A對照品進樣量X(ug)為橫坐標，以羥基紅花黃色素A的峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸，得回歸方程：Y=3×106 X +316152,r=0.9990（n=5）；結果表明：羥基紅花黃色素A在0.3128～3.128μg質量范圍內線性關系良好。
2.5陰性對照試驗精密吸取取不含紅花水提液的空白微乳0.1mL，依照2.3項下操作，結果顯示空白微乳對羥基紅花黃色素A的測定不產生干擾，說明復方紅花微乳的輔料不影響測定，結果見圖1。
2.6精密度試驗吸取2.2項下對照品溶液，依法測定，記錄連續6次的峰面積，并計算其RSD為1.89%，表明精密度良好。
2.7穩定性試驗取2.2項下對照品溶液，每隔2h進樣1次，每次10μL，考察峰面積的變化，試驗表明在8h內穩定性良好，RSD為1.63%。
2.8重復性試驗取同一批號（110504）的紅花微乳原液自制樣品5份，精密吸取1mL，用甲醇定容至10mL，依法測定，每次10μL，計算得平均含量，RSD為2.03%。
2.9加樣回收率取同一批號（110504）含羥基紅花黃色素A復方紅花微乳樣品溶液，精密吸取復方紅花微乳0.5mL，于10mL容量瓶中，同時精密加入一定濃度的對照品（0.1564mg/mL）溶液各0.5mL，然后用甲醇定容至10mL，精密吸取該樣品溶液10μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，依法測定計算結果見表1。
表1加樣回收率測定結果（n=6）
樣品量
(mg)加入量
(mg)測得量
(mg)回收率
(%)平均回收率
(%)RSD
(%)0.06150.07820.1366597.820.06150.07820.1391599.610.06150.07820.135997.280.06150.07820.1405100.570.06150.07820.139699.930.06150.07820.1378598.6898.981.292.10樣品的測定取3個不同批號的紅花微乳原液自制樣品1mL，用甲醇定容至10mL，取羥基紅花黃色素A對照品溶液（0.1564mg/mL），分別進樣10μL，依法測定，得到羥基紅花黃色素A對照品溶液峰面積積分值，用外標法計算3批紅花微乳樣品中羥基紅花黃色素A的含量，結果見表2。
表23批樣品含量測定結果（n=3）
樣品批號HYSAmg/mLRSD%1105020.10571105030.131.141105040.123ABC
A -HYSA對照品B樣品C空白微乳（陰性）
圖1羥基紅花黃色素A(HYSA)的HPLC圖3討論
近年來對紅花提取物及羥基紅花黃色素A的高效液相色譜法分析方法的報道不少[4-8]，總起來有約17種，但是存在著磷酸或冰醋酸的量較多，流動相酸度較高，對于分離的色譜柱來說，填料容易變脆,易于溶解,柱壓也會逐漸升高,色譜柱的壽命縮短；或者有些柱效低、分離度差、峰拖尾嚴重不適于含量測定如甲醇-0.4%磷酸水溶液等。在本實驗中，用三乙胺調節流動相pH值后，分離效果增強，出峰時間縮短，在線性范圍內，羥基紅花黃色素A的峰型良好，沒有拖尾現象，適用于紅花微乳的含量測定。
參考文獻
［1］舒暢，張延英，藺興遙，等.紅花凝膠劑抗炎鎮痛作用的實驗研究[J].中國實驗方劑學雜志，2009，15(1)：72-73.
[2]韋玉芳，謝紅，盧泳堂，等.利多卡因紅花醇液外涂減輕病人靜脈穿刺疼痛的臨床研究[J]中醫藥臨床雜志，2006，18（4）：399-400.
[3]韋紅梅.紅花冰片濕敷降低七葉皂苷鈉致靜脈炎的效果觀察［J］.內科，2008，3（1）：148-149.
[4]郝少君，李軍，李獻玉.高效液相色譜法測定莪紅片制劑中羥基紅花黃色A的含量 [J].藥學學報，2010(6)：531-532.
[5]王永新，徐榮，白方.高效液相色譜法測定紅花散瘀膠囊中羥基紅花黃色素A的含量[J].中國實驗方劑學雜志，2007,13（1）：12-13.
[6]張麗，張穎，宋洪濤. HPLC法測定舒胸制劑中羥基紅花黃色素A的含量 [J].藥學學報，2008 24(1)：56，66，76.
