時(shí)間：2023-05-30 09:04:10
開(kāi)篇：寫(xiě)作不僅是一種記錄，更是一種創(chuàng)造，它讓我們能夠捕捉那些稍縱即逝的靈感，將它們永久地定格在紙上。下面是小編精心整理的12篇細(xì)胞核的功能，希望這些內(nèi)容能成為您創(chuàng)作過(guò)程中的良師益友，陪伴您不斷探索和進(jìn)步。
[關(guān)鍵詞] 細(xì)胞核的功能細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)
一、導(dǎo)入新課
創(chuàng)設(shè)情景：播放視頻草履蟲(chóng)的生殖、應(yīng)激性、變形蟲(chóng)的取食運(yùn)動(dòng)和人體白細(xì)胞吞噬病菌的過(guò)程。
師：同學(xué)們想一想：他們?cè)谶M(jìn)行生命活動(dòng)的時(shí)候，究竟是細(xì)胞中的哪部分結(jié)構(gòu)起著決定性的作用呢？通過(guò)前面的學(xué)習(xí)，我們知道細(xì)胞作為生命系統(tǒng)中最小的結(jié)構(gòu)層次，其內(nèi)部每時(shí)每刻都在進(jìn)行著各種精確而有序的生物化學(xué)反應(yīng)，這又是受誰(shuí)的控制呢？（停頓片刻），這就是我們今天要學(xué)習(xí)的，系統(tǒng)的控制中心：細(xì)胞核（板書(shū)）
二、講授新課
師：細(xì)胞核在細(xì)胞的生命活動(dòng)是如何起作用？為了研究這個(gè)問(wèn)題，科學(xué)家們做了很多實(shí)驗(yàn)，今天我們就沿著科學(xué)家走過(guò)的足跡，去看看他們是如何進(jìn)行科學(xué)探究的。（屏幕顯示：科學(xué)探究的基本步驟，教師簡(jiǎn)單解說(shuō)）
師：（黑白美西螈圖片）美西螈是一種兩棲類動(dòng)物，根據(jù)膚色可分為美西螈和白美西螈兩種，于是科學(xué)家們提出這樣一個(gè)問(wèn)題：美西螈的膚色是由細(xì)胞核還是細(xì)胞質(zhì)控制的呢？
生：是細(xì)胞核控制的。
師：這個(gè)假設(shè)是否正確還需用實(shí)驗(yàn)來(lái)證明，下面我們看科學(xué)家是如何證明的，請(qǐng)同學(xué)讀教材52頁(yè)資料1。
生：學(xué)生朗讀。（幻燈片展示美西螈核移植圖解）
師：（教師解釋核移植技術(shù)）根據(jù)這個(gè)實(shí)驗(yàn)?zāi)芊癯浞肿C明假設(shè)是正確呢？
生：不能。
師：如何再設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更具有說(shuō)服力呢？
（學(xué)生小組討論）
生：將白美西螈胚胎細(xì)胞的核取出，移植到黑美西螈的去核的卵細(xì)胞中，看植入核的卵細(xì)胞發(fā)育成的美西螈的膚色。
師：通過(guò)兩組實(shí)驗(yàn)的對(duì)比，使實(shí)驗(yàn)更加的嚴(yán)密，這樣可以得出結(jié)論：美西螈的膚色是由細(xì)胞核控制的。
師：（幻燈展示傘藻圖片）傘藻是單細(xì)胞的綠藻，分為帽、柄和假根，其中細(xì)胞核位于假根部位，根據(jù)帽形可分為傘形帽和形帽，傘藻再生性很強(qiáng)，即帽切除之后，很短時(shí)間內(nèi)能夠生出新的帽，是什么決定了帽的形態(tài)呢？如何設(shè)計(jì)一個(gè)實(shí)驗(yàn)證實(shí)自己的假設(shè)呢？
（學(xué)生小組討論）
生：將兩種傘藻帽切除并且去掉核，再分別植入另外一種的細(xì)胞核，看看他們分別再生出哪種形態(tài)的帽。
師：（幻燈放映傘藻核移植圖解）你很有發(fā)展成科學(xué)家的潛質(zhì)，非常好。這樣就可以說(shuō)明細(xì)胞核決定了傘藻帽的形態(tài)建成，但是科學(xué)家們當(dāng)時(shí)并沒(méi)有直接想到利用核移植來(lái)驗(yàn)證，而是先做了兩種傘藻嫁接的實(shí)驗(yàn)（展示實(shí)驗(yàn)過(guò)程圖解），同學(xué)們分析一下，這個(gè)實(shí)驗(yàn)?zāi)芊褡C明就是細(xì)胞核決定了傘藻帽的形態(tài)呢？為什么？
（學(xué)生小組討論）
生：不能，因?yàn)榧俑糠诌€有部分細(xì)胞質(zhì)存在，所以不能排除細(xì)胞質(zhì)的影響。
師：回答得非常精彩，（掌聲鼓勵(lì)），同學(xué)們還記得初中學(xué)過(guò)的科學(xué)家們利用類似的核移植方法誕生的動(dòng)物明星――多莉嗎？（幻燈顯示：克隆羊多莉誕生的過(guò)程圖解）下面有哪位同學(xué)能結(jié)合圖解，描述一下多莉的誕生過(guò)程？
生：學(xué)生回答，教師適當(dāng)補(bǔ)充。
師：非常棒！小多莉雖然是由C羊生出來(lái)的，但多莉長(zhǎng)得像誰(shuí)？為什么？
生：像 B 羊，因?yàn)槎嗬虻募?xì)胞核來(lái)自 B 羊。
師：結(jié)合前面的資料分析和多莉的產(chǎn)生過(guò)程，我們能看出生物體的性狀遺傳主要是由細(xì)胞核決定的。這與細(xì)胞核中的什么物質(zhì)有關(guān)呢？
生：DNA，DNA 是遺傳信息的載體，主要分布在細(xì)胞核中。
師：因此可以說(shuō)，細(xì)胞核是遺傳信息庫(kù)。（板書(shū)：一、功能：遺傳信息庫(kù)）
師：以上的資料說(shuō)明細(xì)胞核與細(xì)胞的遺傳有關(guān)，那細(xì)胞核與細(xì)胞的代謝活動(dòng)是否關(guān)系呢？我們看資料2。
生：讀教材52頁(yè)資料2。
師：（屏幕展示過(guò)程圖解）結(jié)合圖解能得出什么結(jié)論？
生：細(xì)胞核與細(xì)胞的分裂、分化有關(guān)系。
師：細(xì)胞核還與細(xì)胞其他的生命活動(dòng)有關(guān)系嗎？科學(xué)家用變形蟲(chóng)做了一個(gè)這樣的實(shí)驗(yàn)。
生：認(rèn)真閱讀教材53頁(yè)資料3。（學(xué)生邊讀，教師邊播放圖解）
師：既然無(wú)核部分即將死亡，有核部分能正常生活，為什么科學(xué)家還要將有核一半中的核鉤出來(lái)，然后再移植回去，這樣做的目的是什么呢？
（學(xué)生小組討論）
生：這樣做可以使實(shí)驗(yàn)更加嚴(yán)密，因?yàn)榧?xì)胞質(zhì)內(nèi)有大量的細(xì)胞器，很可能通過(guò)切割使兩部分的細(xì)胞器分布不均，造成了無(wú)核的部分沒(méi)有細(xì)胞器也就不能再繼續(xù)生存下去。
生：細(xì)胞質(zhì)中也有少量的 DNA 和 RNA 在一定程度上也能影響生物體的生命活動(dòng)。
師：回答的太棒了，那人的成熟紅細(xì)胞還能生長(zhǎng)分裂嗎？為什么？
生：不能，因?yàn)闆](méi)有細(xì)胞核。
師：綜合這些資料，找同學(xué)概括一下，細(xì)胞核具有什么功能？
生：細(xì)胞核是細(xì)胞遺傳和代謝的控制中心。（板書(shū)）
師：我們知道結(jié)構(gòu)決定功能（板書(shū)），細(xì)胞核有如此重要的功能，它的結(jié)構(gòu)又是怎樣的呢？給同學(xué)們3分鐘時(shí)間閱讀課本53頁(yè)細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)并完成學(xué)案（細(xì)胞核結(jié)構(gòu)表格略）。
師：接下來(lái)給同學(xué)們5分鐘時(shí)間，認(rèn)真閱讀54頁(yè)第一自然段，看一下作為遺傳信息載體的染色質(zhì)和染色體有什么區(qū)別和聯(lián)系，并完成學(xué)案（染色體與染色質(zhì)比較的表格）。
縱觀各地高考卷不難發(fā)現(xiàn)，本考點(diǎn)多次考查，命題多圍繞細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行，尤其是核膜、核孔、核仁，在最后復(fù)習(xí)階段需予以重視.一、考點(diǎn)掃描考點(diǎn)一：細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)1.細(xì)胞核的有無(wú)（個(gè)數(shù)）對(duì)于真核生物來(lái)說(shuō)，絕大多數(shù)細(xì)胞具有一個(gè)核.凡是無(wú)核細(xì)胞，既不能生長(zhǎng)也不能分裂，如哺乳動(dòng)物和人的成熟紅細(xì)胞、血小板、植物的篩管細(xì)胞；人工去核的細(xì)胞，一般不能存活太久.也有的生物細(xì)胞具有兩個(gè)或是多個(gè)核，例如雙小核草履蟲(chóng)；人的骨骼肌細(xì)胞中細(xì)胞核多達(dá)數(shù)百個(gè).對(duì)于原核生物，由于其沒(méi)有核膜包被的細(xì)胞核，故稱作擬核.2.細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)（1）染色質(zhì)與染色體的關(guān)系同種物質(zhì)（DNA與蛋白質(zhì)組成）在不同時(shí)期的兩種形態(tài)（分裂間期染色質(zhì)，分裂期染色體），如同鋼絲與彈簧.染色質(zhì)分裂前期：螺旋變粗分裂末期：解螺旋，變細(xì)變長(zhǎng)染色體（2）核膜雙層膜，外膜與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相連，且有核糖體附著；在有絲分裂中周期性地消失和重建；具有選擇透過(guò)性（如無(wú)機(jī)小分子、有機(jī)小分子包括ATP、離子）.核膜是不連續(xù)的，上面分布有核孔.（3）核孔核孔并不是一個(gè)簡(jiǎn)單的孔洞，而是一個(gè)相對(duì)獨(dú)立鑲嵌著由多種不同的蛋白質(zhì)構(gòu)成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)――核孔復(fù)合體，實(shí)現(xiàn)核質(zhì)之間頻繁的物質(zhì)交換和信息交流.一些大分子物質(zhì)依據(jù)自身的擬定位信號(hào)和與核孔中專一受體蛋白（載體）結(jié)合而實(shí)現(xiàn)主動(dòng)運(yùn)輸.如細(xì)胞質(zhì)合成的DNA和RNA所需的聚合酶以及染色體中的組蛋白和核糖體蛋白都要通過(guò)核孔運(yùn)入核內(nèi)，核內(nèi)生成的各種RNA以及組裝好的核糖體亞基等大分子又必須通過(guò)核孔運(yùn)出.但是它控制物質(zhì)的通過(guò)不光依靠孔徑的大小，還依靠核膜，核孔周?chē)母鞣N蛋白質(zhì)，即使是直徑小于核孔的物質(zhì)，也不一定能順利通過(guò)，所以仍然具有選擇性.（4）核仁折光性強(qiáng)，將碘液滴加到新鮮洋蔥鱗莖表皮細(xì)胞，可見(jiàn)細(xì)胞核被染成紅褐色，而核仁染得更深，易與其他結(jié)構(gòu)區(qū)分；在有絲分裂中周期性地消失和重現(xiàn)，參與rRNA的合成及核糖體的形成 .（5）核孔的數(shù)量、核仁的大小與細(xì)胞代謝有關(guān)，如代謝旺盛、蛋白質(zhì)合成量大的細(xì)胞，核孔數(shù)多，核仁較大，如兩棲類的卵母細(xì)胞，核孔數(shù)可達(dá)百萬(wàn).核孔的作用是實(shí)現(xiàn)核質(zhì)之間頻繁的物質(zhì)交換和信息交流，因此代謝旺盛的細(xì)胞核孔數(shù)目較多.考點(diǎn)二：細(xì)胞核的功能遺傳信息庫(kù)，遺傳和代謝的控制中心，但不是細(xì)胞代謝的中心（細(xì)胞代謝的主要場(chǎng)所是細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)）.二、例題解析例1（2014宿遷調(diào)研改編）如圖1為細(xì)胞核結(jié)構(gòu)模式圖，下列有關(guān)敘述正確的是（）.A.①主要由DNA和蛋白質(zhì)組成，在細(xì)胞分裂不同時(shí)期形態(tài)相同B.破壞②不會(huì)影響胰島素的合成C.核膜由兩層磷脂分子構(gòu)成，在細(xì)胞分裂中發(fā)生周期性變化D.蛋白質(zhì)和RNA等生物大分子穿過(guò)核孔進(jìn)出細(xì)胞核需要能量解析選D.解答本題的關(guān)鍵是： （1）正確識(shí)別圖中的①為染色質(zhì)，②為核仁. （2）明確核孔具有選擇透過(guò)性.圖中①為染色質(zhì)，由絲狀DNA和蛋白質(zhì)構(gòu)成，在細(xì)胞分裂不同時(shí)期形態(tài)不同；②為核仁，其功能是與rRNA的合成和核糖體的形成有關(guān)，若破壞核仁，則核糖體無(wú)法形成，不能合成胰島素；核膜是雙層膜，即四層磷脂分子構(gòu)成；蛋白質(zhì)和RNA等大分子物質(zhì)通過(guò)核孔完成細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核之間的物質(zhì)交換，需要能量.例2（2009山東高考）真核細(xì)胞單位面積的核孔數(shù)目與細(xì)胞類型和代謝水平有關(guān).以下細(xì)胞中核孔數(shù)目最少的是（）.A.胰島細(xì)胞
B.造血干細(xì)胞C.效應(yīng)B細(xì)胞（漿細(xì)胞）
D.口腔上皮細(xì)胞解析選D.細(xì)胞的代謝越旺盛，則核孔的數(shù)目越多.A、C中的細(xì)胞分別分泌胰島素（或胰高血糖素）和抗體，代謝旺盛.B中細(xì)胞的分裂能力很強(qiáng)，代謝旺盛.只有D為高度分化的細(xì)胞，代謝較弱.故而D中的口腔上皮細(xì)胞的核孔數(shù)目最少. 例3（2014安徽聯(lián)考）如圖2為某種生物的細(xì)胞核及相關(guān)結(jié)構(gòu)示意圖，有關(guān)敘述正確的是（
）.圖2A.核孔是大分子物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞核的通道，不具有選擇性B.圖示中有中心體，說(shuō)明該生物為低等植物或動(dòng)物 C.在衰老的細(xì)胞中，細(xì)胞核體積減小，染色質(zhì)濃縮 D.rRNA（核糖體RNA）和蛋白質(zhì)在核仁中合成并組裝成核糖體解析選B.核孔也具有選擇透過(guò)性，不允許核內(nèi)DNA外出；中心體存在低等植物細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞中；在衰老的細(xì)胞中，由于代謝緩慢，細(xì)胞核代償性增大，染色質(zhì)濃縮；蛋白質(zhì)合成的場(chǎng)所是核糖體.例4（2014南通調(diào)研改編）下列關(guān)于細(xì)胞核的敘述正確的是（
）.A.真核細(xì)胞的核膜上有大量的多種酶，有利于多種化學(xué)反應(yīng)的順利進(jìn)行B.在顯微鏡下觀察分裂間期的真核細(xì)胞，可以看到細(xì)胞核的主要結(jié)構(gòu)有核膜、核仁和染色體C.葉肉細(xì)胞利用核孔實(shí)現(xiàn)核內(nèi)外DNA，RNA和蛋白質(zhì)的交換D.原核細(xì)胞的擬核除沒(méi)有核膜外，其他方面與真核細(xì)胞的細(xì)胞核沒(méi)有差別 解析選A.核膜為酶提供了大量的附著位點(diǎn)，有利于多種生化反應(yīng)的順利進(jìn)行.真核細(xì)胞分裂間期的核中無(wú)染色體，有絲狀染色質(zhì)；DNA分子不能通過(guò)核孔，而RNA及某些蛋白質(zhì)分子可以通過(guò)；原核細(xì)胞的擬核不僅無(wú)核膜，而且它只是一個(gè)的大型環(huán)狀DNA分子，沒(méi)有與蛋白質(zhì)結(jié)合成染色體，也無(wú)核仁等結(jié)構(gòu).（收稿日期：2015-06-13）
細(xì)胞學(xué)知識(shí)是生物學(xué)的核心基礎(chǔ)知識(shí)，在高中教材中占有舉足輕重的地位。其中，多種多樣的細(xì)胞、細(xì)胞膜系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能、主要細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)與功能、細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)與功能、細(xì)胞的有絲分裂、細(xì)胞的分化、細(xì)胞的全能性、細(xì)胞的衰老和凋亡與人體健康的關(guān)系在考綱中屬于Ⅱ類要求，即理解所列知識(shí)和其他相關(guān)知識(shí)之間的聯(lián)系與區(qū)別，并能在較復(fù)雜情景中綜合應(yīng)用其進(jìn)行分析、判斷、推理和評(píng)價(jià)。
分析2013年各地高考試題發(fā)現(xiàn)：細(xì)胞學(xué)知識(shí)大多通過(guò)結(jié)構(gòu)圖、模式圖、坐標(biāo)圖等形式，并與細(xì)胞代謝綜合起來(lái)進(jìn)行考查，如江蘇卷第29題將細(xì)胞器、細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)相結(jié)合進(jìn)行考查（例4）；江蘇卷第3題和浙江卷第1題側(cè)重考查了有絲分裂的相關(guān)知識(shí)；山東卷第2題考查了細(xì)胞分化的知識(shí)；江蘇卷第7題綜合考查了分化、衰老、凋亡與癌變的相關(guān)知識(shí)。另外從題型上看，這方面的知識(shí)涉及的考查點(diǎn)多，內(nèi)容比較淺顯，所以大多以選擇題形式出現(xiàn)，如新課標(biāo)全國(guó)卷I第3題，山東卷第1題，天津卷第1題，安徽卷第1題，北京卷第1題，浙江卷第2題等。
二、2013年典型高考試題的剖析
例1 （2013?安徽卷）生物膜將真核細(xì)胞分隔成不同的區(qū)室，使得細(xì)胞內(nèi)能夠同時(shí)進(jìn)行多種化學(xué)反應(yīng)，而不會(huì)相互干擾。下列敘述正確的是（ ）
A.細(xì)胞核是mRNA合成和加工的場(chǎng)所
B.高爾基體是肽鏈合成和加工的場(chǎng)所
C.線粒體將葡萄糖氧化分解成CO2和H2O
D.溶酶體合成和分泌多種酸性水解酶
【解析】細(xì)胞核是轉(zhuǎn)錄的場(chǎng)所，所以是mRNA合成和加工的場(chǎng)所，A正確。核糖體是肽鏈的合成場(chǎng)所，B錯(cuò)誤。葡萄糖是不能進(jìn)入線粒體的，C錯(cuò)誤。溶酶體中的酶是在核糖體上合成的，并經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體加工和修飾后分泌的，D錯(cuò)誤。
【答案】A。
〖點(diǎn)評(píng)〗此題題干是課文原話，可見(jiàn)課本知識(shí)是必須要牢牢掌握的。這四個(gè)選項(xiàng)是細(xì)胞核功能和幾種細(xì)胞器功能的組合，難度不大，體現(xiàn)了對(duì)基礎(chǔ)知識(shí)的考查。盡管課文沒(méi)有涉及細(xì)胞核是mRNA加工的場(chǎng)所，但只要同學(xué)們對(duì)蛋白質(zhì)的合成場(chǎng)所、呼吸作用的過(guò)程知識(shí)熟練，通過(guò)排除法是可以準(zhǔn)確作答的。
例2 （2013?天津卷）下列過(guò)程未體現(xiàn)生物膜信息傳遞功能的是（ ）
A.蔗糖溶液使洋蔥表皮細(xì)胞發(fā)生質(zhì)壁分離
B.抗原刺激引發(fā)記憶細(xì)胞增殖分化
C.胰島素調(diào)節(jié)靶細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取
D.傳出神經(jīng)細(xì)胞興奮引起肌肉收縮
【解析】當(dāng)外界蔗糖溶液濃度較高時(shí)，洋蔥表皮細(xì)胞滲透失水發(fā)生質(zhì)壁分離，該過(guò)程不涉及信息傳遞；記憶細(xì)胞與抗原具有特異性識(shí)別作用，該過(guò)程與細(xì)胞膜上的糖蛋白有關(guān)，糖蛋白具有信息識(shí)別功能；靶細(xì)胞膜表面的受體能與胰島素結(jié)合，從而使胰島素發(fā)揮作用；傳出神經(jīng)細(xì)胞興奮引起肌肉收縮的過(guò)程中有神經(jīng)遞質(zhì)與細(xì)胞膜上相應(yīng)受體的結(jié)合。B，C，D項(xiàng)均體現(xiàn)了生物膜的信息傳遞功能。
【答案】A。
〖點(diǎn)評(píng)〗此題難度中等偏上。考查學(xué)生對(duì)生物膜信息傳遞概念的理解，只有徹底理解這部分內(nèi)容，才能準(zhǔn)確評(píng)判生物學(xué)過(guò)程或生物學(xué)現(xiàn)象。對(duì)此概念課文沒(méi)有過(guò)多的文字闡述，而是列舉了具體事例并用彩圖直觀告知。在教學(xué)時(shí)需要老師高度概括提煉這一概念的要素和要點(diǎn)。確認(rèn)是否為信息傳遞，需有三個(gè)基本要素：信號(hào)分子、靶細(xì)胞受體、靶細(xì)胞內(nèi)發(fā)生復(fù)雜的生物效應(yīng)。①信號(hào)分子具有傳遞信息的作用：胰島素、神經(jīng)遞質(zhì)與靶細(xì)胞受體結(jié)合后，引起靶細(xì)胞內(nèi)發(fā)生一系列復(fù)雜的反應(yīng)，說(shuō)明二者屬于信號(hào)分子，能夠傳遞某種信息；而抗原表面的特異性蛋白等物質(zhì)（免疫學(xué)上稱之為表面抗原或抗原決定簇）也相當(dāng)于信號(hào)分子，刺激記憶細(xì)胞后，引發(fā)了記憶細(xì)胞增殖分化。②靶細(xì)胞上有和信號(hào)分子結(jié)合的受體。③靶細(xì)胞上的受體與信號(hào)分子特異性結(jié)合后，必須發(fā)生一系列復(fù)雜的生物效應(yīng)，如生化反應(yīng)水平提高、膜電位變化等，才能說(shuō)明體現(xiàn)了信息傳遞功能。
例3 （2013?山東卷）將小鼠myoD基因?qū)塍w外培養(yǎng)的未分化肌肉前體細(xì)胞，細(xì)胞分化及肌纖維形成過(guò)程如圖所示。下列敘述正確的是（ ）
A.攜帶myoD基因的載體以協(xié)助擴(kuò)散的方式進(jìn)入肌肉前體細(xì)胞
B.檢測(cè)圖中細(xì)胞核糖體蛋白基因是否表達(dá)可確定細(xì)胞分化與否
C.完成分化的肌肉細(xì)胞通過(guò)有絲分裂增加細(xì)胞數(shù)量形成肌纖維
D.肌肉前體細(xì)胞比肌肉細(xì)胞在受到電離輻射時(shí)更容易發(fā)生癌變
【解析】攜帶myoD基因的載體為環(huán)狀DNA分子，該大分子物質(zhì)不會(huì)以協(xié)助擴(kuò)散的方式進(jìn)入細(xì)胞，在基因工程中用顯微注射法，A錯(cuò)誤。核糖體蛋白基因控制合成核糖體蛋白，該基因在每個(gè)活細(xì)胞中均會(huì)表達(dá)，B錯(cuò)誤。完成分化的肌肉細(xì)胞已失去了分裂能力，不再進(jìn)行細(xì)胞分裂，C錯(cuò)誤。由題意可知，肌肉前體細(xì)胞屬于未分化細(xì)胞，處于分裂狀態(tài)，DNA復(fù)制時(shí)受電離輻射的影響程度遠(yuǎn)大于已不再分裂的肌肉細(xì)胞，因此更容易發(fā)生癌變，D正確。
【答案】D。
〖點(diǎn)評(píng)〗此題考查了學(xué)生對(duì)細(xì)胞的分裂、分化和癌變等知識(shí)理解和應(yīng)用能力。在細(xì)胞分化的過(guò)程中控制基本生命活動(dòng)的有關(guān)蛋白質(zhì)基因是活細(xì)胞，它均可以表達(dá)，而有些基因是選擇性表達(dá)的，因此細(xì)胞之間有了穩(wěn)定性的差異――細(xì)胞分化，所以只有檢測(cè)肌肉細(xì)胞特有的蛋白質(zhì)才能確定細(xì)胞分化與否。B選項(xiàng)對(duì)學(xué)生有一定的難度。題圖告訴我們肌肉細(xì)胞是由肌肉前體細(xì)胞分裂分化而來(lái)，解題時(shí)不能忽視這一題圖信息，平時(shí)要注意識(shí)圖、析圖能力訓(xùn)練。
例4 （2013?江蘇卷）如圖為某細(xì)胞的部分結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)示意圖，請(qǐng)回答下列問(wèn)題：
（1）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上合成的蛋白質(zhì)不能穿過(guò) 進(jìn)入細(xì)胞核，表明這種轉(zhuǎn)運(yùn)具有 性。
（2）細(xì)胞膜選擇透過(guò)性的分子基礎(chǔ)是 具有疏水性和 具有專一性。
（3）若該細(xì)胞是高等植物的葉肉細(xì)胞，則圖中未繪制的細(xì)胞器有 。
（4）若該細(xì)胞為小鼠骨髓造血干細(xì)胞，則圖示細(xì)胞處于細(xì)胞周期的 ，此時(shí)在光學(xué)顯微鏡下觀察明顯可見(jiàn)細(xì)胞核中有 存在。
（5）研究表明硒對(duì)線粒體膜有穩(wěn)定作用，可以推測(cè)人體缺硒時(shí)下列細(xì)胞中最易受損的是 （填序號(hào)）。
①脂肪細(xì)胞 ②淋巴細(xì)胞 ③心肌細(xì)胞 ④口腔上皮細(xì)胞
【解析】（1）由圖可知附著于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核糖體上合成的蛋白質(zhì)，沒(méi)有箭頭指向細(xì)胞核，而是經(jīng)高爾基體加工后有三個(gè)去向：成為細(xì)胞膜的成分之一、分泌到細(xì)胞外、變?yōu)槿苊阁w內(nèi)的酶。不能進(jìn)入細(xì)胞核，而細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的蛋白質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核的通道是核孔。
（2）細(xì)胞膜上磷脂分子的尾部是脂肪酸，具有疏水性。細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有特定的空間結(jié)構(gòu)，能與被轉(zhuǎn)運(yùn)的物質(zhì)特異性結(jié)合，體現(xiàn)了膜對(duì)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)倪x擇性。
（3）高等植物的葉肉細(xì)胞內(nèi)含有葉綠體，并且成熟的植物細(xì)胞具有大液泡。
（4）核膜在前期消失，在末期重現(xiàn)，圖中可見(jiàn)完整的細(xì)胞核，說(shuō)明該細(xì)胞處于細(xì)胞周期的間期。在細(xì)胞核中只有染色質(zhì)和核仁，明顯可見(jiàn)的只能是核仁了，即使圖上看不到，也必須填寫(xiě)“核仁”。
（5）細(xì)胞內(nèi)線粒體參與細(xì)胞有氧呼吸，缺硒線粒體膜無(wú)法穩(wěn)定，進(jìn)而影響到細(xì)胞內(nèi)能量的產(chǎn)生，而題目提供的細(xì)胞中，心肌細(xì)胞對(duì)能量的要求最高，所以最易受損。
【答案】（1）核孔 選擇 （2）磷脂雙分子層 膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 （3）葉綠體和液泡 （4）分裂間期 核仁 （5）③
〖點(diǎn)評(píng)〗此題考查了學(xué)生識(shí)圖、析圖的能力和準(zhǔn)確規(guī)范表達(dá)能力。首先從圖中確認(rèn)細(xì)胞器及蛋白質(zhì)的種類，理解圖中箭頭所示的含義是解答本題的關(guān)鍵。題圖展示了游離核糖體合成的蛋白質(zhì)和附著于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核糖體合成的蛋白質(zhì)的不同去向。
要做到規(guī)范答題有效得分，應(yīng)根據(jù)所填空格前后的語(yǔ)境和語(yǔ)意仔細(xì)推敲來(lái)確定內(nèi)容，再組織語(yǔ)言，例如第（4）小題中關(guān)鍵詞“明顯可見(jiàn)”就確定了該空的答案。平時(shí)的復(fù)習(xí)需注意以下幾點(diǎn)：①熟記乃至背誦教材語(yǔ)言。②套用一些平時(shí)作答時(shí)常用句式如“在一定的范圍內(nèi)”“等量且適量”“分組編號(hào)”“觀察記錄”等。③善于使用題干語(yǔ)言，有些空就是來(lái)自題干中的某一詞或短語(yǔ)，作答時(shí)不宜更改或遺漏，與題干語(yǔ)言保持高度一致。
三、2014年高考復(fù)習(xí)策略及命題趨勢(shì)預(yù)測(cè)
（一）復(fù)習(xí)策略
1.抓住教材，熟練掌握基礎(chǔ)知識(shí)
知識(shí)是能力的載體，一定量的知識(shí)儲(chǔ)備及良好的知識(shí)結(jié)構(gòu)是各種能力形成和提高的必備條件。在本專題基礎(chǔ)知識(shí)復(fù)習(xí)時(shí)可用圖形、表格等形式，通過(guò)比較、辨析來(lái)加強(qiáng)理解記憶有關(guān)概念、過(guò)程、原理。如（1）真核細(xì)胞與原核細(xì)胞的比較；（2）植物細(xì)胞與動(dòng)物細(xì)胞的比較；（3）葉綠體與線粒體的比較；（4）染色體、染色質(zhì)和染色單體的比較；（5）有絲分裂與減數(shù)分裂的比較；（6）載體與運(yùn)載體的比較；（7）原生質(zhì)體與原生質(zhì)層的比較；（8）糖蛋白、脂蛋白、球蛋白和分泌蛋白的比較；（9）細(xì)胞膜的信息傳遞功能與物質(zhì)交換功能的比較；（10）細(xì)胞分裂與細(xì)胞分化的比較；（11）細(xì)胞衰老、凋亡和壞死的比較；（12）主動(dòng)運(yùn)輸與被動(dòng)運(yùn)輸?shù)谋容^；（13）斐林試劑與雙縮脲試劑的比較。通過(guò)對(duì)以上相關(guān)、相似、易混的概念進(jìn)行比較，加強(qiáng)記憶，鞏固基礎(chǔ)知識(shí)。
2.精選巧練，提高解題能力
從每年的高考試題中選擇有代表性的題目進(jìn)行練習(xí)，由淺入深，由易到難，由基礎(chǔ)知識(shí)到分析推理，形成一個(gè)循序漸進(jìn)的訓(xùn)練過(guò)程，培養(yǎng)和提高解題能力。
審題能力：仔細(xì)審題，這是正確解答試題的前提。一些選擇題題干中包含的關(guān)鍵詞語(yǔ)，如“正確”與“錯(cuò)誤”，“一對(duì)”與“一個(gè)”，“主要”與“次要”，“根本原因”與“直接原因”，“一定”“可能”“唯一”等。找準(zhǔn)這些關(guān)鍵詞語(yǔ)，對(duì)正確解題起到至關(guān)重要的作用。對(duì)于非選擇題，在看題、讀題、解題和答題過(guò)程中，同樣要看準(zhǔn)關(guān)鍵詞，理解題意，然后正確作答。尤其是實(shí)驗(yàn)題，審準(zhǔn)題目的性質(zhì)和目的至關(guān)重要。
理解能力：在理解能力方面比較突出的問(wèn)題是，對(duì)有關(guān)知識(shí)理解不透，掌握得不夠牢固，因此，對(duì)題干所提供的信息材料不能正確理解，不懂得出題人的用意，不能準(zhǔn)確地進(jìn)行知識(shí)的遷移。如何提高理解能力呢？應(yīng)注意三個(gè)方面：①夯實(shí)課本上的基礎(chǔ)知識(shí)。②提高閱讀理解能力，通常在解題時(shí)要養(yǎng)成良好習(xí)慣，快速泛讀一遍，再細(xì)讀一遍，將關(guān)鍵字詞注上標(biāo)記。③理解出題人的用意。
表達(dá)能力：在高考試題中的非選擇題部分，重點(diǎn)體現(xiàn)《考試大綱》對(duì)考生表達(dá)能力的要求。如“能用文字、圖表以及數(shù)學(xué)方式等多種表達(dá)形式準(zhǔn)確地描述生物學(xué)方面的內(nèi)容”。學(xué)生在這一部分失分較多，主要原因有：①表達(dá)時(shí)，用詞隨意，不能用生物學(xué)術(shù)語(yǔ)準(zhǔn)確地描述。②在對(duì)生物現(xiàn)象解釋時(shí)，組織的語(yǔ)言與之不構(gòu)成因果關(guān)系。③在實(shí)驗(yàn)方法步驟的陳述中思路混亂，表達(dá)不清，語(yǔ)言拖泥帶水，不能做到言簡(jiǎn)意賅。在做非選擇題時(shí)，全面、準(zhǔn)確地表達(dá)生物信息是得分的重要保障。在平時(shí)的訓(xùn)練中要模仿課文的表達(dá)模式及用詞的嚴(yán)密性和完整性。
3.重視基本實(shí)驗(yàn)，提高分析能力
這部分的實(shí)驗(yàn)較多，有觀察類實(shí)驗(yàn)（如觀察多種多樣的細(xì)胞、線粒體和葉綠體、有絲分裂）、探究類實(shí)驗(yàn)（如探究植物細(xì)胞的吸水和失水）、模擬實(shí)驗(yàn)（如細(xì)胞大小與物質(zhì)運(yùn)輸?shù)年P(guān)系實(shí)驗(yàn)、滲透作用實(shí)驗(yàn)），還有制備細(xì)胞膜等實(shí)驗(yàn)。高考試題常以課本實(shí)驗(yàn)為模本進(jìn)行組合、拓展和遷移，特別注重對(duì)基本實(shí)驗(yàn)操作步驟、原理、現(xiàn)象的考查。因此，平時(shí)訓(xùn)練時(shí)要立足教材實(shí)驗(yàn)，提高觀察能力、設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的能力、分析實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象的能力。
最后，在復(fù)習(xí)中要形成如生物體結(jié)構(gòu)與功能相適應(yīng)的觀點(diǎn)、生物體局部與整體相統(tǒng)一的觀點(diǎn)、生命活動(dòng)的對(duì)立統(tǒng)一觀點(diǎn)，提高生物科學(xué)素養(yǎng)。
（二）高考命題預(yù)測(cè)
1.將線粒體與葉綠體的結(jié)構(gòu)和功能及有關(guān)實(shí)驗(yàn)與光合作用、呼吸作用過(guò)程原理融于一體進(jìn)行命題，以此來(lái)考查學(xué)生的綜合應(yīng)用能力。
二十世紀(jì)70年代Naftolin等的研究工作奠定了腦芳香化酶(Aromatase， AROM)假說(shuō)的基礎(chǔ)，該假說(shuō)認(rèn)為在腦組織局部，AROM可以將雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素（主要是雌二醇，E2）。以往的研究認(rèn)為腦內(nèi)AROM的表達(dá)只見(jiàn)于出生前后一短暫時(shí)期，成年后則不表達(dá)，外周E2是成年腦E2的唯一來(lái)源。近年隨著研究技術(shù)的進(jìn)步，在成年某些腦區(qū)如海馬、下丘腦也檢出AROM的表達(dá)，且不僅見(jiàn)于神經(jīng)元胞體也見(jiàn)于突觸前成分，證明成年腦仍然能夠合成E2［1］。目前為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了兩類E2受體，即經(jīng)典的核受體ERα和ERβ（Hawkins等從硬骨魚(yú)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的核受體ERγ經(jīng)研究證實(shí)它是ERβ的一個(gè)亞型；見(jiàn)Filby AL，Biol Reprod， 2005)，以及近年新發(fā)現(xiàn)的膜性受體ERX以及屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族的GPR30和GαqER［2］。
1 經(jīng)典的雌激素受體
經(jīng)典的ERα和ERβ位于細(xì)胞核內(nèi)，它們通過(guò)調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮“基因型”調(diào)節(jié)效應(yīng)。兩種經(jīng)典ER在腦內(nèi)的分布具有腦區(qū)特異性。如高表達(dá)的ERα見(jiàn)于下丘腦、終紋床核與生殖調(diào)節(jié)有關(guān)的腦區(qū)；ERβ高表達(dá)于嗅球、基底前腦、大腦皮質(zhì)、海馬錐體細(xì)胞、小腦浦肯野細(xì)胞、黑質(zhì)等與學(xué)習(xí)記憶、運(yùn)動(dòng)調(diào)控有關(guān)的腦區(qū)部位。腦垂體內(nèi)幾乎所有的催乳素陽(yáng)性細(xì)胞都不表達(dá)ERβ，提示ERβ在泌乳中樞的調(diào)節(jié)可能有限的，而ERα對(duì)泌乳中樞的調(diào)節(jié)起著主要作用 。在功能方面，經(jīng)典ER介導(dǎo)的雌激素效應(yīng)可能有所不同，但也可能協(xié)同發(fā)揮作用。如ERα主要參與對(duì)生殖調(diào)控的作用，因?yàn)樽钄郋Rα可改變動(dòng)物的性行為；ERβ可能主要參與了對(duì)高級(jí)腦功能如學(xué)習(xí)記憶、神經(jīng)退行性疾病等的調(diào)節(jié)，因?yàn)榍贸鼸Rβ基因嚴(yán)重影響學(xué)習(xí)記憶行為、LTP和突觸強(qiáng)度 ［36］。
2 非經(jīng)典的膜性雌激素受體
E2能在數(shù)秒鐘內(nèi)改變神經(jīng)元的電生理特性、在幾分鐘之內(nèi)降低不表達(dá)核受體的神經(jīng)元的Ca2+電流，導(dǎo)致特異性增強(qiáng)基因表達(dá)的蛋白質(zhì)如MAPK途徑、PKA、CREB等的活化。這些效應(yīng)受經(jīng)典ERs的膜性成分或近年新發(fā)現(xiàn)的膜性ER的介導(dǎo)，E2通過(guò)這一類ER主要發(fā)揮“非基因型”的調(diào)節(jié)作用，其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路涉及到對(duì)Ca2+、cAMP等第二信使以及各蛋白激酶級(jí)聯(lián)的活化，如src、ras、MEK和MAPK。
2.1 膜性ERα
研究發(fā)現(xiàn)ERα也可位于細(xì)胞膜，甚至突觸后致密物即PSD。1～10 nm的E2在1 h內(nèi)能增強(qiáng)作為抑制學(xué)習(xí)記憶指標(biāo)之一的長(zhǎng)時(shí)程抑制即LTD，2 h內(nèi)能增加海馬CA1中錐體神經(jīng)元的樹(shù)突棘密度，然而CA3中錐體神經(jīng)元的棘樣結(jié)構(gòu)卻減少；實(shí)驗(yàn)證明E2的快速調(diào)節(jié)作用是與通過(guò)細(xì)胞膜ERα而結(jié)合產(chǎn)生的。Hojo等因此認(rèn)為海馬錐體細(xì)胞膜性ERα在誘導(dǎo)LTD和樹(shù)突棘再生中有重要作用，并認(rèn)為這有助于“忘掉該忘掉的記憶”從而與細(xì)胞核ERβ協(xié)同發(fā)揮對(duì)學(xué)習(xí)記憶的調(diào)節(jié)作用［7］。
2.2 膜性ERβ
在某些腦區(qū)，ERβ也可能位于細(xì)胞核以外的部位，如胞漿，甚至突起內(nèi)，最早見(jiàn)于Li等1997年的報(bào)道。我們先前的免疫組化研究發(fā)現(xiàn)在成年大鼠CA1、CA2、動(dòng)眼神經(jīng)核、藍(lán)斑下核等部位除了細(xì)胞核著色以外胞漿和突起也有淡淡的著色，三叉神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核內(nèi)有一些僅為胞漿和突起著色的陽(yáng)性細(xì)胞［4］。在研究生后大鼠基底前腦ERβ的發(fā)育學(xué)表達(dá)過(guò)程中，我們注意到在出生14 d后ERβ免疫陽(yáng)性反應(yīng)主要位于細(xì)胞核，但是胞漿和突起內(nèi)也可見(jiàn)到微弱的染色，其余時(shí)相點(diǎn)以及在小鼠均是位于細(xì)胞核，其生理意義上不清楚。Herrick等報(bào)道海馬齒狀回在新生或成年大鼠新生細(xì)胞的胞膜、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)檢測(cè)到ERβ免疫陽(yáng)性反應(yīng)，提示該部位細(xì)胞核外ERβ的表達(dá)可能與神經(jīng)干細(xì)胞的活動(dòng)有關(guān)［8］。
2.3 ERX
該受體由ToranAllerand所在實(shí)驗(yàn)室于2000年首次報(bào)道并做了幾篇研究報(bào)告，認(rèn)為ERX介導(dǎo)了E2對(duì)MAPK/ERK通路的活化，其62kDa成分表達(dá)受到發(fā)育的調(diào)節(jié)，高表達(dá)的ERX見(jiàn)于野生型與ERα基因敲除鼠、轉(zhuǎn)基因AD模型鼠生后1～7 d而非成年的新皮質(zhì)、下丘腦、小腦，缺血性腦損傷或可以誘導(dǎo)其表達(dá)［9］。
2.4 GPR30
這是目前研究最多的一種膜性ER。它是一個(gè)具有7次跨膜結(jié)構(gòu)、375個(gè)氨基酸的G蛋白偶聯(lián)受體，與IL8受體有30%的同源性。1996年從B細(xì)胞cDNA文庫(kù)中分離出來(lái)，在巨噬細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中有廣泛表達(dá)。自1997年到2002年，較多文獻(xiàn)報(bào)道了GPR30在乳腺癌中的表達(dá)、調(diào)控與作用研究，2000年即發(fā)現(xiàn)E2對(duì)ERK的活化需要GPR30的參與，2005年德克薩斯大學(xué)的Thomas等正式提出GPR30是一種新的雌激素受體［1011］。
腦內(nèi)GPR30的功能研究方面目前報(bào)道還不多，已有資料表明它可能參與了雌激素對(duì)下丘腦促性腺激素釋放激素細(xì)胞內(nèi)突觸前GABA末梢對(duì)Ca2+的調(diào)節(jié)以及對(duì)海馬結(jié)構(gòu)與功能的調(diào)節(jié)，在生后7 d以及成年鼠(hamster)的下丘腦、杏仁復(fù)合體與小腦發(fā)現(xiàn)有GPR表達(dá)的性別差異，提示該受體可能參與了對(duì)這些部位神經(jīng)結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)［12］。
2.5 GαqER
2008年，Qiu等報(bào)道對(duì)小鼠和豚鼠的研究中發(fā)現(xiàn)下丘腦有一種調(diào)節(jié)GABAB受體去敏感化的ER，與GPR30一樣，它也屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族，于是將其命名為GαqER。應(yīng)用ERα和/或ERβ基因敲除小鼠證明它與上述兩種受體不同；通過(guò)GPR30基因敲除小鼠研究證明GαqER與GPR30也是不同的。它參與了對(duì)PLCPKCPKA途徑的調(diào)節(jié)， 具體過(guò)程可能是：① E2與該受體結(jié)合，引起Gαq的活化；②PLC被活化;③活化的PLC 水解PIP2并釋放DAG，游離DAG刺激PKCδ;④PKCδ 激活腺苷酸環(huán)化酶導(dǎo)致cAMP濃度升高;⑤cAMP刺激PKA;⑥PKA使細(xì)胞膜上與K+通道功能有關(guān)的靶蛋白磷酸化［1314］。
綜上所述，近年新發(fā)現(xiàn)的膜性ER尤其是經(jīng)典ER也可以位于細(xì)胞核外并發(fā)揮功能的研究打破了ER是核受體、只能位于細(xì)胞核的傳統(tǒng)觀念，對(duì)闡明E2在腦內(nèi)的功能及其機(jī)制發(fā)揮了巨大作用。兩種類型的ER并不是孤立地介導(dǎo)E2的作用，而是可以相互作用與整合以全面調(diào)節(jié)神經(jīng)元的功能，例如膜性E2受體可以導(dǎo)致經(jīng)典核受體及其輔助活化因子的磷酸化，誘導(dǎo)產(chǎn)生第三信使如Cyclin D1和cfos等從而也能調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。隨著研究手段的進(jìn)步，將來(lái)也許還會(huì)發(fā)現(xiàn)更多的核ER或膜性ER，從而為深入認(rèn)識(shí)和利用E2提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
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七年級(jí)生物上知識(shí)點(diǎn)第一單元 生物和生物圈
生物的特征：1、生物的生活需要營(yíng)養(yǎng) 2、生物能進(jìn)行呼吸 3、生物能排出體內(nèi)產(chǎn)生的廢物4、生物能對(duì)外界刺激做出反應(yīng) 5、生物能生長(zhǎng)和繁殖 6、由細(xì)胞構(gòu)成(病毒除外)
調(diào)查的一般方法
步驟：明確調(diào)查目的、確定調(diào)查對(duì)象、制定合理的調(diào)查方案、調(diào)查記錄、對(duì)調(diào)查結(jié)果進(jìn)行整理、撰寫(xiě)調(diào)查報(bào)告
生物的分類
按照形態(tài)結(jié)構(gòu)分：動(dòng)物、植物、其他生物
按照生活環(huán)境分：陸生生物、水生生物
按照用途分：作物、家禽、家畜、寵物
生物圈是所有生物的家
生物圈的范圍：大氣圈的底部：可飛翔的鳥(niǎo)類、昆蟲(chóng)、細(xì)菌等
水圈的大部：距海平面150米內(nèi)的水層
巖石圈的表面：是一切陸生生物的“立足點(diǎn)”
生物圈為生物的生存提供了基本條件：營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、陽(yáng)光、空氣和水，適宜的溫度和一定的生存空間
環(huán)境對(duì)生物的影響
非生物因素對(duì)生物的影響：光、水分、溫度等
光對(duì)鼠婦生活影響的實(shí)驗(yàn)P15
探究的過(guò)程：1、提出問(wèn)題 2、作出假設(shè) 3、制定計(jì)劃 4、實(shí)施計(jì)劃 5、得出結(jié)論 6、表達(dá)和交流
對(duì)照實(shí)驗(yàn) P15
生物因素對(duì)生物的影響：
最常見(jiàn)的是捕食關(guān)系，還有競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系、合作關(guān)系
生物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)和影響
生物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)P19的例子
生物對(duì)環(huán)境的影響：植物的蒸騰作用調(diào)節(jié)空氣濕度、植物的枯葉枯枝腐爛后可調(diào)節(jié)土壤肥力、動(dòng)物糞便改良土壤、蚯蚓松土
生態(tài)系統(tǒng)的概念：在一定地域內(nèi)，生物與環(huán)境所形成的統(tǒng)一整體叫生態(tài)系統(tǒng)。一片森林，一塊農(nóng)田，一片草原，一個(gè)湖泊，等都可以看作一個(gè)生態(tài)系統(tǒng)。
生態(tài)系統(tǒng)的組成：
生物部分：生產(chǎn)者、消費(fèi)者、分解者
非生物部分：陽(yáng)光、水、空氣、溫度
如果將生態(tài)系統(tǒng)中的每一個(gè)環(huán)節(jié)中的所有生物分別稱重，在一般情況下數(shù)量做大的應(yīng)該是生產(chǎn)者。
植物是生態(tài)系統(tǒng)中的生產(chǎn)者，動(dòng)物是生態(tài)系統(tǒng)中的消費(fèi)者，細(xì)菌和真菌是生態(tài)系統(tǒng)中的分解者。
食物鏈和食物網(wǎng)：
食物鏈以生產(chǎn)者為起點(diǎn)，終點(diǎn)為消費(fèi)者，且是不被其他動(dòng)物捕食的“最高級(jí)”動(dòng)物。
物質(zhì)和能量沿著食物鏈和食物網(wǎng)流動(dòng)的。
營(yíng)養(yǎng)級(jí)越高，生物數(shù)量越少;營(yíng)養(yǎng)級(jí)越高，有毒物質(zhì)沿食物鏈積累(富集)。
生態(tài)系統(tǒng)具有一定的自動(dòng)調(diào)節(jié)能力。
在一般情況下，生態(tài)系統(tǒng)中生物的數(shù)量和所占比例是相對(duì)穩(wěn)定的。但這種自動(dòng)調(diào)節(jié)能力有一定限度，超過(guò)則會(huì)遭到破壞。
例如：在草原上人工種草，為了防止鳥(niǎo)吃草籽，用網(wǎng)把試驗(yàn)區(qū)罩上，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，網(wǎng)罩內(nèi)的草的葉子幾乎被蟲(chóng)吃光，而未加網(wǎng)罩的地方，草反而生長(zhǎng)良好。原因是：食物鏈被破壞而造成生態(tài)系統(tǒng)平衡失調(diào)。
生物圈是最大的生態(tài)系統(tǒng)。人類活動(dòng)對(duì)環(huán)境的影響有許多是全球性的。
生態(tài)系統(tǒng)的類型p29
森林生態(tài)系統(tǒng)、草原生態(tài)系統(tǒng)、農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)、海洋生態(tài)系統(tǒng)、城市生態(tài)系統(tǒng)等
生物圈是一個(gè)統(tǒng)一的整體p30
注意DDT的例子 (富集)課本26頁(yè)。
課本27頁(yè)1題33頁(yè)生物圈2號(hào)
生物的生存依賴于環(huán)境，以各種方式適應(yīng)環(huán)境，影響環(huán)境。
七年級(jí)生物上知識(shí)點(diǎn)第二單元 生物和細(xì)胞
顯微鏡的結(jié)構(gòu)
鏡座：穩(wěn)定鏡身;
鏡柱：支持鏡柱以上的部分;
鏡臂：握鏡的部位;
載物臺(tái)：放置玻片標(biāo)本的地方。中央有通光孔，兩旁各有一個(gè)壓片夾，用于固定所觀察的物體。
遮光器：上面有大小不等的圓孔，叫光圈。每個(gè)光圈都可以對(duì)準(zhǔn)通光孔。用來(lái)調(diào)節(jié)光線的強(qiáng)弱。
反光鏡：可以轉(zhuǎn)動(dòng)，使光線經(jīng)過(guò)通光孔反射上來(lái)。其兩面是不同的：光強(qiáng)時(shí)使用平面鏡，光弱時(shí)使用凹面鏡。
鏡筒：上端裝目鏡，下端有轉(zhuǎn)換器，在轉(zhuǎn)換器上裝有物鏡，后方有準(zhǔn)焦螺旋。
準(zhǔn)焦螺旋：粗準(zhǔn)焦螺旋：轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)鏡筒升降的幅度大;細(xì)準(zhǔn)焦螺旋。
轉(zhuǎn)動(dòng)方向和升降方向的關(guān)系：順時(shí)針轉(zhuǎn)動(dòng)準(zhǔn)焦螺旋，鏡筒下降;反之則上升
顯微鏡的使用 P37-38 的圖要掌握
觀察的物像與實(shí)際圖像相反。注意玻片的移動(dòng)方向和視野中物象的移動(dòng)方向相反。
放大倍數(shù)=物鏡倍數(shù)X目鏡倍數(shù)
放在顯微鏡下觀察的生物標(biāo)本，應(yīng)該薄而透明，光線能透過(guò)，才能觀察清楚。因此必須加工制成玻片標(biāo)本。
觀察植物細(xì)胞：實(shí)驗(yàn)過(guò)程P43-44
切片、涂片、裝片的區(qū)別 P42
植物細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)
細(xì)胞壁：支持、保護(hù)
細(xì)胞膜：控制物質(zhì)的進(jìn)出，
細(xì)胞質(zhì)：液態(tài)的，可以流動(dòng)的。細(xì)胞質(zhì)里有液泡，液泡內(nèi)的液泡內(nèi)溶解著多種物質(zhì)(如糖分)
細(xì)胞核：貯存和傳遞遺傳信息
葉綠體：進(jìn)行光合作用的場(chǎng)所，
液泡：細(xì)胞液
觀察口腔上皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)P47
動(dòng)物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)
細(xì)胞膜：控制物質(zhì)的進(jìn)出
細(xì)胞核：貯存和傳遞遺傳信息
細(xì)胞質(zhì)：液態(tài)，可以流動(dòng)
植物細(xì)胞與動(dòng)物細(xì)胞的相同點(diǎn)：都有細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核
植物細(xì)胞與動(dòng)物細(xì)胞的不同點(diǎn)：植物細(xì)胞有細(xì)胞壁和液泡，動(dòng)物細(xì)胞沒(méi)有。
細(xì)胞的生活需要物質(zhì)和能量
細(xì)胞是構(gòu)成生物體的結(jié)構(gòu)和功能基本單位。
細(xì)胞是物質(zhì)、能量、和信息的統(tǒng)一體。細(xì)胞通過(guò)分裂產(chǎn)生新細(xì)胞。
細(xì)胞中的物質(zhì)
有機(jī)物(一般含碳，可燒)：糖類、脂類、蛋白質(zhì)、核酸，這些都是大分子
無(wú)機(jī)物(一般不含碳)：水、無(wú)機(jī)物、氧等，這些都是小分子
細(xì)胞膜控制物質(zhì)的進(jìn)出，對(duì)物質(zhì)有選擇性，有用物質(zhì)進(jìn)入，廢物排出。注意課本52頁(yè)圖叫什么
細(xì)胞內(nèi)的能量轉(zhuǎn)換器：
葉綠體：進(jìn)行光合作用，是細(xì)胞內(nèi)的把二氧化碳和水合成有機(jī)物，并產(chǎn)生氧。線粒體：進(jìn)行呼吸作用，是細(xì)胞內(nèi)的“動(dòng)力工廠”“發(fā)動(dòng)機(jī)”。
二者聯(lián)系：都是細(xì)胞中的能量轉(zhuǎn)換器
二者區(qū)別：葉綠體將光能轉(zhuǎn)變成化學(xué)能儲(chǔ)存在有機(jī)物中;
線粒體分解有機(jī)物，將有機(jī)物中儲(chǔ)存的化學(xué)能釋放出來(lái)供細(xì)胞利用。
動(dòng)植物細(xì)胞都有線粒體。
細(xì)胞核是遺傳信息庫(kù)，遺傳信息存在于細(xì)胞核中
多莉羊的例子p55，
57頁(yè)1題
細(xì)胞核中的遺傳信息的載體——DNA
DNA的結(jié)構(gòu)像一個(gè)螺旋形的梯子
基因是DNA上的一個(gè)具有特定遺傳信息的片斷
DNA和蛋白質(zhì)組成染色體
不同的生物個(gè)體，染色體的形態(tài)、數(shù)量完全不同
同種生物個(gè)體，染色體在形態(tài)、數(shù)量保持一定
染色體容易被堿性染料染成深色
染色體數(shù)量要保持恒定，否則會(huì)有嚴(yán)重的遺傳病
細(xì)胞的控制中心是細(xì)胞核
細(xì)胞通過(guò)分裂產(chǎn)生新細(xì)胞
生物的由小長(zhǎng)大是由于：細(xì)胞的分裂和細(xì)胞的生長(zhǎng)
細(xì)胞的分裂
1、染色體進(jìn)行復(fù)制
2、細(xì)胞核分成等同的兩個(gè)細(xì)胞核
3、細(xì)胞質(zhì)分成兩份
4、植物細(xì)胞：在原細(xì)胞中間形成新的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁
動(dòng)物細(xì)胞：細(xì)胞膜逐漸內(nèi)陷，便形成兩個(gè)新細(xì)胞
新生命的開(kāi)端---受精卵
經(jīng)細(xì)胞分化形成的各種各樣的細(xì)胞各自聚集在一起才能行使其功能，這些形態(tài)結(jié)構(gòu)相似、功能相同的細(xì)胞聚集起來(lái)所形成的細(xì)胞群叫做組織。
不同的組織按一定的次序結(jié)合在一起構(gòu)成器官。
動(dòng)物和人的基本組織可以分為四種：上皮組織、結(jié)締組織、肌肉組織、神經(jīng)組織。
四種組織按照一定的次序構(gòu)成，并且以其中的一種組織為主，形成器官。
能夠共同完成一種或幾種生理功能的多個(gè)器官按照一定的次序組成在一起構(gòu)成系統(tǒng)。
系統(tǒng)：運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)，神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)。
動(dòng)物和人的基本結(jié)構(gòu)層次(小到大)：細(xì)胞→組織→器官→系統(tǒng)→動(dòng)物體和人體
植物結(jié)構(gòu)層次(小到大)：細(xì)胞→組織→器官→植物體
P65題3
第二節(jié) 植物體的結(jié)構(gòu)層次
綠色開(kāi)花植物的六大器官
營(yíng)養(yǎng)器官：根、莖、葉 ;
生殖器官：花、果實(shí)、種子
第三節(jié) 只有一個(gè)細(xì)胞的生物體
單細(xì)胞生物：草履蟲(chóng)、酵母菌、、衣藻、眼蟲(chóng)、變形蟲(chóng)
關(guān)鍵詞： 核轉(zhuǎn)錄因子κB;核轉(zhuǎn)錄因子κB抑制因子;中性粒細(xì)胞;凋亡
急性肺損傷、急性胰腺炎等炎癥反應(yīng)過(guò)程中，中性粒細(xì)胞首先浸潤(rùn)于炎癥灶中，并可能過(guò)度活化導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征〔1〕。核轉(zhuǎn)錄因子κB（NFκB）作為多種介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，不僅參與炎癥介質(zhì)的調(diào)控，同時(shí)也對(duì)中性粒細(xì)胞凋亡基因的表達(dá)調(diào)控有重要作用。因此，NFκB自身的活性狀況對(duì)炎癥進(jìn)程有至關(guān)重要的作用。本研究通過(guò)脂多糖(LPS)刺激中性粒細(xì)胞，探討NFκB天然抑制調(diào)節(jié)因子IκBα對(duì)中性粒細(xì)胞凋亡的影響。
1 材料與方法
1.1 材料
LPS、來(lái)普霉素B（leptomycin B，LMB）購(gòu)自深圳晶美生物公司，IκBα單抗、Western印跡試劑盒購(gòu)自武漢博士德公司,Trans AMTM NFκBp65 kit 為大連寶生物公司產(chǎn)品。細(xì)胞核漿蛋白制備試劑盒購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。
1.2 中性粒細(xì)胞分離培養(yǎng)及細(xì)胞核、漿蛋白制備
2 w內(nèi)未服用藥物的健康成人志愿者（為獻(xiàn)血員），參照文獻(xiàn)〔2〕進(jìn)行中性粒細(xì)胞分離純化。純化后的細(xì)胞懸浮于含10%胎牛血清的RPMI1640溶液中至終濃度為5×109/L,于37℃振蕩培養(yǎng)。將離體培養(yǎng)的中性粒細(xì)胞分為4組：（1）生理鹽水對(duì)照組（A組）；（2）LMB干預(yù)組（B組）；（3）LPS刺激組（C組）；LMB+LPS組（D組）。LPS刺激的終濃度為0.1 g/L；LMB+LPS組中，予LPS刺激前45 min加入1‰（V/V）LMB。應(yīng)用北京博奧森生物技術(shù)有限公司細(xì)胞核漿蛋白制備試劑盒提取核漿蛋白，步驟參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。應(yīng)用Bradford法測(cè)定制備蛋白濃度。
1.3 細(xì)胞核NFκB活性檢測(cè)
采用Trans AMTM NFκBp65 試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。以不加入核提取物為空白對(duì)照，實(shí)驗(yàn)組中每個(gè)時(shí)相點(diǎn)進(jìn)行5次測(cè)定，讀取分光光度計(jì)450 nm處A值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
1.4 細(xì)胞核、漿IκBα含量檢測(cè)
將提取的各組細(xì)胞核、漿蛋白進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺（SDSPAGE）蛋白電泳。上樣量20 μg，90 V電泳2 h后，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜。5%（W/V）脫脂奶粉封閉1h,加入兔抗IκBα多克隆抗體（1∶200）4℃過(guò)夜，羊抗兔Ⅱ抗（1∶5 000）室溫下孵育1 h。應(yīng)用化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描分析，并用測(cè)得目的條帶的灰度×面積表示結(jié)果。
1.5 中性粒細(xì)胞凋亡的檢測(cè)
采用流式細(xì)胞儀DNA倍體分析法：收集1×105個(gè)中性粒細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min,棄培養(yǎng)液，用PBS液洗2次后加入70%冷乙醇2 ml混勻，4℃固定30 min。再以1 000 r/min離心5 min,棄培養(yǎng)液，用PBS洗2次后加入1 ml碘化丙啶（PI）染色，4℃孵育30 min，上機(jī)分析。
1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
以SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以x±s表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)。
2 結(jié) 果
2.1 細(xì)胞核NFκB活性檢測(cè)結(jié)果
LMB干預(yù)組細(xì)胞核NFκB活性(0.041 2±0.003 1)與對(duì)照組(0.042 1±0.003 3)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。給予LPS刺激后，NFκB活性(0.622 0±0.053 6)較對(duì)照組顯著增強(qiáng)(P＜0.05)；而給予LPS刺激的同時(shí)加入LMP，NFκB活性(0.050 0±0.003 6)明顯受到抑制。
2.2 細(xì)胞核、漿IκBα含量檢測(cè)結(jié)果
細(xì)胞核、漿IκBα Western印跡結(jié)果見(jiàn)圖1。細(xì)胞核、漿IκBα凝膠圖像掃描結(jié)果見(jiàn)表1。對(duì)照組、LMB干預(yù)組胞漿與胞核中IκBα含量無(wú)顯著性差異；LPS刺激組中胞漿含量略低于胞核(P＜0.05)，且LPS刺激組胞漿及胞核中含量均低于對(duì)照組(P＜0.05)；LMB+LPS組胞漿明顯低于胞核。表1 細(xì)胞核、漿IκBα凝膠圖像掃描結(jié)果（略)
2.3 中性粒細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果
見(jiàn)圖2。與對(duì)照組相比，LMB干預(yù)組中性粒細(xì)胞凋亡百分比無(wú)明顯改變；而LPS刺激組顯著下降(P＜0.05)。LMB+LPS組與LPS刺激組比較，中性粒細(xì)胞凋亡百分比明顯上升(P＜0.05)。
3 討 論
中性粒細(xì)胞作為機(jī)體內(nèi)最活躍的炎癥細(xì)胞，在臟器內(nèi)大量扣押、活化是導(dǎo)致急性肺損傷等炎性疾病惡化的中心環(huán)節(jié)。激活的中性粒細(xì)胞通過(guò)呼吸爆發(fā)產(chǎn)生大量自由基、蛋白水解酶及炎癥介質(zhì)等有害物質(zhì)造成組織損傷。適度清除中性粒細(xì)胞是控制炎癥發(fā)展的重要措施。凋亡的中性粒細(xì)胞脫顆粒、呼吸爆發(fā)等致炎功能下降，而且更易被吞噬細(xì)胞吞噬。被整體吞噬的中性粒細(xì)胞致炎能力顯著下降。因此，凋亡作為中性粒細(xì)胞重要的非炎性清除方式，對(duì)炎癥疾病轉(zhuǎn)歸有重要作用〔3，4〕。
【關(guān)鍵詞】胰腺內(nèi)分泌腫瘤 臨床病理學(xué) 免疫組化特點(diǎn)分析
【Summary】：To pick: ：To the advancement of pathological and the clinical characteristics of the immunity. the method of 23 respectively， for example， pets and pas， immune to the organization ’s - chemical (p method dyeing) observation. the example the average age of 23 pets 42. four years， there was a tumor. part 2， there is more solid envelope lump， they will be poor. the organization， lymphoma cells in a small circular， streaming. the thin cell in quality in nuclear chromatin Fine grainy. cells in trabecula ， glands make or truth. immunization group ： 23 cases in the pets syn 13， and 10 nse cga ck 7 and ins 6 cases. the positive conclusion ： endocrine the tumor may the man of unusual characteristics and clinical psychologists immunization form.
【Keywords】：The key words：The endocrine the tumor， clinical pathology， the analysis of the characteristics of immunity
免疫組織化學(xué)：預(yù)后胰腺內(nèi)分泌腫瘤(pancreaticendocrinetumors，PETs)僅占所有胰腺腫瘤的1%～2%是臨床上非常少見(jiàn)的腫瘤。筆者對(duì)收集的PETs病例進(jìn)行臨床回顧性研究，探討PETs的臨床病理學(xué)特征、免疫表型及預(yù)后。
1、臨床資料
選取本院2001～2006年病理診斷為PETs的資料齊全病例共18例，經(jīng)兩位病理主任醫(yī)師重復(fù)閱片確診。18例PETs患者中5例因上腹部不適，3例因偶然發(fā)現(xiàn)上腹部腫塊，7例因反復(fù)頭暈乏力而入院就診。1例腫塊為多發(fā)，其余均為單發(fā)。B超10例示胰腺腫塊，3例示后腹膜塊，1例示膽總管后腫塊。CT示7例胰腺實(shí)性腫塊。18例隨訪1.5～5年，2例復(fù)發(fā)。標(biāo)本經(jīng)10%的福爾馬林固定、石蠟包埋，4μm厚切片，HE染色、PAS染色及免疫組化染色。
免疫組化抗體：抗糜蛋白酶(AACT)、波形蛋白(Vim)、突觸素(Syn)、嗜鉻粒蛋白(CgA)、神經(jīng)元烯醇化酶(NSE)、細(xì)胞角蛋白(CK)、胰島素(Ins)均為福州邁新生物技術(shù)公司產(chǎn)品，方法為S-P法，使用LabVision全自動(dòng)免疫組化染色系統(tǒng)(美國(guó))。每次染色設(shè)陰性及陽(yáng)性對(duì)照。
2、病理檢查結(jié)果
2.1巨檢11例手術(shù)切除PETs腫塊標(biāo)本，1例為灰白色，余均為褐色或粉紅色，腫塊與周?chē)M織分界清楚。6例有完整包膜，1例有部分包膜，4例無(wú)明顯包膜。直徑1.5～5.5cm，平均直徑2.4cm。10例切面為實(shí)性質(zhì)軟(其中3例有出血)，1例切面為囊實(shí)性，囊內(nèi)有出血。
2.2鏡檢23例PETs中部分腫塊有厚薄不均勻的纖維包膜，腫瘤細(xì)胞由形態(tài)相對(duì)一致的小圓形細(xì)胞構(gòu)成，胞漿嗜酸性或嗜雙色性，細(xì)胞核居中，核染色質(zhì)呈細(xì)顆粒狀、腫瘤細(xì)胞排列成小梁狀、腺胞狀或?qū)嵭浴ｉg質(zhì)有豐富的血管。惡性PETs可見(jiàn)包膜浸潤(rùn)和周?chē)馨徒Y(jié)、腸系膜等轉(zhuǎn)移。6例腫瘤細(xì)胞核異型明顯。
2.3生物學(xué)行為與預(yù)后病例1有胰腺、周?chē)窘M織、小灶性血管侵犯病例4有包膜、血管侵犯以及胰周淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例5有包膜侵犯病例10有腸系膜轉(zhuǎn)移病例11有肝轉(zhuǎn)移且腫塊為多發(fā)性，4例確診為惡性經(jīng)手術(shù)后隨訪2例復(fù)發(fā)。
3、討論
3.1臨床特征PETs好發(fā)于成年人，女性多于男性2、本文報(bào)道的23例PETs中7例為男性，16例為女性，患者的平均年齡為42.4歲，PETs分為功能性和非功能性兩類。大多數(shù)PETs為功能性，而非功能性僅占其中的15%左右。非功能性PETs通常沒(méi)有明顯的臨床內(nèi)分泌紊亂癥狀，患者多以上腹部不適或偶發(fā)上腹部包塊就診。而功能性PETs可因腫瘤分泌的主要激素不同而分為不同的亞型，它們各自都有特征性的臨床癥狀。胰島素瘤是最常見(jiàn)的功能性PETs。影像學(xué)所見(jiàn)對(duì)于PETs的術(shù)前定位及定性診斷有重要價(jià)值。B超與CT不僅能顯示胰腺全貌，而且還能顯示周?chē)鞴偌傲馨徒Y(jié)有無(wú)轉(zhuǎn)移，為術(shù)前判定腫瘤良惡性、術(shù)式選擇及切除范圍提供依據(jù)。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)血糖濃度、血漿激素水平等生化指標(biāo)對(duì)功能性PETs的診斷也有重要價(jià)值。
關(guān)鍵詞：紅瘰疣螈（Tylototriton verrucoosus Anderson）;消化系統(tǒng);消化腺
中圖分類號(hào)：Q945.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）12-2846-04
Microanatomy Observation of Digestive System in Tylototriton verrucoosus Anderson
XIAO Xiao-liu，PENG Dong-yan，DU-qin，LI Hong-mei
（Yuxi Normal University， Yuxi 653100，Yunnan，China）
Abstract： In this experiment， paraffin-embedded， HE staining， conventional continuous slice were adopted on digestive histological observation of Tylototriton verrucoosus Anderson. The results showed that the esophagus of Tylototriton verrucoosus Anderson consisted of epithelial cells， mucosal layer， submucosa， muscle layer， esophageal glands， goblet cells， outer membrane; and the stomach composed of epithelial cells， folds， submucosa， gastric pits， tunica propria， muscle layers and gastric gland. The duodenum， ileum， rectum were made of the epithelial cells， folds， goblet cells， muscle layers. The gastrointestinal epithelium was simple columnar cells. The esophagus had groups of esophageal glands， thick mucous layer which folded inward to form plica， and developed single tubular gastric gland. The intestinal were rich of goblet cells yet least in duodenum and gradually increasing in ileum and rectum.
Key words： Tylototriton verrucoosus Anderson; digestive system; digestive gland
紅瘰疣螈（Tylototriton verrucoosus Anderson）是兩棲綱（Amphibia）有尾目（Caudata）蠑螈科（Salamandridae）疣螈屬（Tylototriton）的代表動(dòng)物之一，云南省主要分布于麗江、騰沖、保山、景洪、新平等地區(qū)[1]。體色因其生活環(huán)境而有所差異[2]，指4，趾5。主要以蚯蚓、蜈蚣、步行蟲(chóng)、蝸牛、黃粉蟲(chóng)等為食，為雜食性動(dòng)物。紅瘰疣螈屬于水生脊椎動(dòng)物向陸生脊椎動(dòng)物過(guò)渡階段的一個(gè)類群，其生活環(huán)境特殊，因而其對(duì)研究動(dòng)物系統(tǒng)進(jìn)化有重要意義[3]。目前，中國(guó)有很多學(xué)者對(duì)紅瘰疣螈做了研究，例如，從線粒體Cyt b基因探討紅瘰疣螈物種地位的有效性[4]、體溫調(diào)節(jié)[5]、繁殖生態(tài)[6，7]、皮膚顯微結(jié)構(gòu)觀察[8]等。本研究對(duì)紅瘰疣螈消化系統(tǒng)做了組織學(xué)研究，并與其他動(dòng)物作比較，探究其內(nèi)部構(gòu)造對(duì)其生活環(huán)境的適應(yīng)性，也為兩棲動(dòng)物組織學(xué)研究提供基礎(chǔ)資料。
1 材料與方法
1.1 材料
試驗(yàn)所用活體紅瘰疣螈采自云南鳳慶縣小灣鎮(zhèn)，3雌1雄，平均體長(zhǎng)15.5～18.6 cm，游標(biāo)卡尺測(cè)量。平均體重14.4～22.1 g，雌性個(gè)體比雄性個(gè)體大，體色鮮艷且生長(zhǎng)狀況良好。
1.2 方法
取消化系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)各部分組織用8%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，常規(guī)石蠟切片，切片厚度一般為5 μm左右，經(jīng)HE染色，顯微鏡拍照，觀察。
2 結(jié)果與分析
為敘述方便起見(jiàn)，將紅瘰疣螈消化道分為食道、胃、十二指腸、回腸、直腸。
2.1 消化系統(tǒng)的組織結(jié)構(gòu)
紅瘰疣螈的食道由固有膜和單層上皮細(xì)胞共同向食道腔形成多個(gè)褶皺（圖1-1），皺襞高度為153.6～706.4 μm 。黏膜上皮為單層柱狀上皮，黏膜層厚度為67.2～124.8 μm。表皮細(xì)胞有4～6層，細(xì)胞核橢圓形，位于細(xì)胞基底部，厚度為57.6～134.4 μm。表皮細(xì)胞間有杯狀細(xì)胞，大小為9.6～38.4 μm。黏膜基底層上皮細(xì)胞呈矮柱狀，細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，黏膜基底層可見(jiàn)不甚明顯的泡狀食管腺，黏膜下層為疏松結(jié)締組織（圖1），其間分布有血管、神經(jīng)和空泡狀細(xì)胞，其下為肌肉層，肌肉層由平滑肌構(gòu)成內(nèi)環(huán)外縱兩層，其間還有扁平狀的漿細(xì)胞。外膜由外向內(nèi)由漿膜和纖維膜構(gòu)成，漿膜厚105.6～192.0 μm，纖維膜厚度為1.5 μm左右。
胃可分為賁門(mén)胃、胃體和幽門(mén)胃三部分。紅瘰疣螈胃的腔面里有10～12個(gè)褶皺組成的皺襞群（圖1-2），高度為163.2～556.8 μm，由黏膜層和黏膜下層組成。黏膜上皮為單層柱狀細(xì)胞，大小為3.4～6.8 μm，細(xì)胞核為橢圓形被染成深紫色，位于細(xì)胞基底部，細(xì)胞質(zhì)被染成粉紅色，嗜酸性。胃黏膜上皮下陷到固有膜形成單管狀胃腺，且胃腺發(fā)達(dá)，細(xì)胞核大且呈圓形或近似于圓形，位于細(xì)胞中央。黏膜下層由疏松結(jié)締組織組成，在結(jié)締組織之間有成堆的脂肪細(xì)胞和血管，以及壁細(xì)胞和頸黏液細(xì)胞，壁細(xì)胞近似于圓形，細(xì)胞核呈圓形且位于細(xì)胞中央，頸黏液細(xì)胞為長(zhǎng)柱狀細(xì)胞，細(xì)胞核橢圓形，位于細(xì)胞基部。胃肌肉層由內(nèi)層環(huán)肌和外層縱肌構(gòu)成，環(huán)肌較厚，占肌肉層的2/3，最外層膜為一層纖維膜。
紅瘰疣螈十二指腸黏膜層較發(fā)達(dá)（圖1-3），黏膜上皮為單層柱狀上皮。黏膜向腸腔內(nèi)形成10～15個(gè)皺襞，皺襞高201.0～668.4 μm，皺襞的表層有較豐富的絨毛，絨毛高9.6～28.8 μm，其下為高柱狀細(xì)胞，在小腸中數(shù)量最多，大小為7.8～14.4 μm，細(xì)胞核橢圓形或長(zhǎng)橢圓形，位于細(xì)胞中央，大小為4.8～7.8 μm。在柱狀細(xì)胞中有巨型杯狀細(xì)胞，杯狀細(xì)胞為長(zhǎng)橢圓形，個(gè)體較大。固有膜內(nèi)分布著腸腺，還可見(jiàn)少量的乳糜管。黏膜肌層較胃肌層薄，由內(nèi)環(huán)外縱兩層平滑肌組成，環(huán)肌較厚，縱肌較薄，兩層肌肉之間有疏松結(jié)締組織連接，可見(jiàn)微血管，黏膜下層為疏松結(jié)締組織，分布有血管、神經(jīng)等。
紅瘰疣螈黏膜向腸腔內(nèi)形成多個(gè)以單個(gè)個(gè)體形式存在的皺襞（圖1-4），黏膜上皮為單層柱狀上皮，黏膜表層有一層絨毛（圖1-5），柱狀細(xì)胞數(shù)目較多，大小為23.5～35.8 μm，細(xì)胞核大多為圓形，少數(shù)為橢圓形，較小，位于細(xì)胞中央。在柱狀細(xì)胞中有杯狀細(xì)胞，呈短橢圓形，直腸中最多（表1）。肌層較明顯，但不發(fā)達(dá)，內(nèi)環(huán)外縱，環(huán)肌較薄，縱肌較厚。
直腸黏膜上皮為單層柱狀上皮（圖1-6），具微絨毛，柱狀細(xì)胞數(shù)目最多，細(xì)胞呈橢圓形或圓形，細(xì)胞核近圓形，位于細(xì)胞中央，柱狀細(xì)胞中還分布有較多的杯狀細(xì)胞，杯狀細(xì)胞近似于圓形。直腸肌肉層環(huán)肌和縱肌同等發(fā)達(dá)，內(nèi)環(huán)外縱，縱肌上分布有脂肪細(xì)胞。
2.2 消化腺的組織結(jié)構(gòu)
由單層柱狀細(xì)胞及肌肉層組成（圖1-7），細(xì)胞層排列整齊緊密，大小為1.0～12.5 μm細(xì)胞為橢圓形，相鄰細(xì)胞分界不明顯，細(xì)胞核呈橢圓形，位于細(xì)胞中央。肌肉層較薄，厚度為15～50 μm，為單層的縱肌，其間分布有脂肪細(xì)胞。
在40倍光學(xué)顯微鏡下觀察到肝小葉之間分界不明顯，肝小葉分界處有肝管（圖1-8），在肝小葉的中央有一條中央靜脈（圖1-9），管徑小，靜脈腔不明顯。肝細(xì)胞呈不規(guī)則的多邊形，分界清楚，胞質(zhì)豐富，呈顆粒狀，部分肝細(xì)胞出現(xiàn)空泡和空隙（圖1-8）。細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，位于細(xì)胞中央。肝細(xì)胞由6～10個(gè)圍繞中央靜脈呈放射狀排列成肝細(xì)胞索（圖9），大小為33.6～76.8 μm，肝細(xì)胞索之間形成的空隙為竇狀隙，竇狀隙呈狹長(zhǎng)型，其內(nèi)可見(jiàn)殘留的血細(xì)胞。此外，肝實(shí)質(zhì)內(nèi)有黑色顆粒聚縮形成黑色素團(tuán)，體積大小不一樣，分布也不均勻，其間分布有肝血竇。肝的表面為一層薄薄的漿膜，結(jié)締組織少，緊接著結(jié)締組織是由5～6層單層扁平細(xì)胞組成的表皮細(xì)胞。
外膜為一薄層結(jié)締組織（圖1-10），胰腺細(xì)胞形狀不規(guī)則，細(xì)胞核橢圓形，位于細(xì)胞基底。排泄管貫穿于腺細(xì)胞之間，排泄管內(nèi)可見(jiàn)分泌物（圖1-11），經(jīng)HE染色后呈紅色，嗜酸性。
3 討論
紅瘰疣螈處于水生到陸生的過(guò)渡階段，它的消化系統(tǒng)需要面臨由水生生活轉(zhuǎn)變?yōu)殛懮顜?lái)的序列問(wèn)題，所以在結(jié)構(gòu)上有一序列相應(yīng)的特征之與相適應(yīng)。
3.1 紅瘰疣螈消化道與其他兩棲類動(dòng)物的比較
從解剖學(xué)上來(lái)講紅瘰疣螈食道短而粗，利于紅瘰疣螈在捕食時(shí)將整個(gè)食物都吞進(jìn)去，與大鯢[9]相似。從組織學(xué)上來(lái)講，紅瘰疣螈食管內(nèi)有縱行的皺襞，當(dāng)吞咽食物時(shí)，皺襞平展，這就大大擴(kuò)大了食道管腔的面積，且皺襞上有黏液細(xì)胞，可以分泌黏液以濕潤(rùn)食物助于吞咽。紅瘰疣螈黏膜下層相對(duì)較厚，增強(qiáng)了消化道各部分組織的舒展性，使食物在消化道中得到充分的消化吸收，與鰱魚(yú)[10]黏膜下層較薄有差異，這一點(diǎn)說(shuō)明紅瘰疣螈在進(jìn)化過(guò)程中細(xì)胞分化更為完全。在食道黏膜下層分化出體積大小不等的兩種杯狀細(xì)胞，與中華蟾蜍[11]、版納魚(yú)螈[12]食道黏膜上皮細(xì)胞中的杯狀細(xì)胞相似，其主要功能是分泌蛋白[13]，起作用，能夠保護(hù)消化道并利于食物順利通過(guò)。與版納魚(yú)螈等有尾及大多無(wú)尾兩棲類[11，14，15]相似，都有食道腺，但與版納魚(yú)螈[12]不同，版納魚(yú)螈食道腺為團(tuán)泡狀腺，紅瘰疣螈為單管狀食道腺。食道最外層為漿膜層，與鰱魚(yú)[10]漿膜層相似，由扁平細(xì)胞組成。
紅瘰疣螈胃內(nèi)壁較粗大的皺襞和發(fā)達(dá)的肌肉結(jié)合，大大增加了胃的舒展性，可以容納體積較大的食物，而花背蟾蜍[16]胃中皺襞更加發(fā)達(dá)，為5～7條縱行的皺襞組成且胃中皺襞高度相對(duì)其他組織高，這表明它的胃具有較強(qiáng)的舒張性，皺襞高就使得食物在胃中停留時(shí)間延長(zhǎng)。胃的上表皮有豐富的單層柱狀上皮細(xì)胞和頸黏液細(xì)胞、壁細(xì)胞，它們共同促進(jìn)了胃對(duì)食物的蠕動(dòng)。胃里還有豐富的胃腺，分泌胃液，使食物得到濕潤(rùn)，有利于食物的消化吸收，這些結(jié)構(gòu)的結(jié)合使得食物得到初步的消化并被迅速送到腸內(nèi)。
紅瘰疣螈的十二指腸、回腸、直腸有高度不同的皺襞，從前到后皺襞逐漸變矮，皺襞在食物消化過(guò)程中起到了屏障作用，使食物在消化道內(nèi)停留的時(shí)間加長(zhǎng)。小腸內(nèi)壁有豐富的絨毛，增加了食物與腸道的接觸面積，使食物的消化吸收更加充分，同時(shí)絨毛還具有緩沖作用，可預(yù)防食物對(duì)消化道的機(jī)械損傷。十二指腸中有豐富的絨毛（高9.6～28.8 μm），體現(xiàn)了十二指腸的重吸收作用，但沒(méi)有中華蟾蜍[11]絨毛發(fā)達(dá)（高40.8～52.8 μm）。腸中有豐富的杯狀細(xì)胞，食道、十二指腸、回腸、直腸中數(shù)目依次增加，與文縣疣螈[17]相似，在排便過(guò)程中水分得到重吸收，體內(nèi)水分得到保持，干燥的糞便順利排出體外，減少對(duì)水分的散失，更加適應(yīng)陸地生活。
3.2 紅瘰疣螈消化腺與其他兩棲類動(dòng)物的比較
紅瘰疣螈肝臟較發(fā)達(dá)，肝細(xì)胞為不規(guī)則多邊形，細(xì)胞核較大，位于細(xì)胞中央，呈圓形。肝細(xì)胞中還有大量的空泡和空隙，與大涼疣螈相似，李蓓等[18]在成體大涼疣螈肝臟的組織形態(tài)學(xué)觀察中認(rèn)為肝臟細(xì)胞質(zhì)空泡和空隙中分布著脂質(zhì)和糖原，是重要的儲(chǔ)能器官。紅瘰疣螈與大涼疣螈為同一屬的動(dòng)物，因此也認(rèn)為紅瘰疣螈肝臟細(xì)胞的空泡和空隙有脂質(zhì)和糖原的分布，能儲(chǔ)存更多的能量。肝實(shí)質(zhì)內(nèi)還有黑色素顆粒組成的黑色素團(tuán)，且成堆存在，經(jīng)分析認(rèn)為，這與已報(bào)道的蠑螈科[18]種類相似，是低氧環(huán)境下保護(hù)性適應(yīng)的結(jié)果。肝臟還是重要的代謝器官，發(fā)達(dá)的肝細(xì)胞增強(qiáng)了紅瘰疣螈的代謝功能，紅瘰疣螈肝臟細(xì)胞特點(diǎn)與其功能相適應(yīng)。
致謝：感謝李澤君老師及茶云肖、段生麗同學(xué)對(duì)本項(xiàng)目研究提供的幫助。
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乙肝是一類大病，在我國(guó)感染人數(shù)有1到2億，目前國(guó)內(nèi)或者國(guó)外對(duì)于乙肝的治療主要方法還是抗病毒保肝護(hù)肝的治療。主要是由于乙型肝炎病毒cccDNA在感染者肝內(nèi)長(zhǎng)期存在，并作為HBV復(fù)制的模板，成為根治乙型肝炎病毒感染的困難所在。然而，患者的病情往往會(huì)反反復(fù)復(fù)，即使對(duì)于患者的病情控制的非常得當(dāng)，也只能在一段時(shí)間內(nèi)起到較好的效果。如何能夠徹底的治愈，現(xiàn)在還沒(méi)有很好的方案，因此，準(zhǔn)確地檢測(cè)肝內(nèi)和/或血清HBV cccDNA的量對(duì)病情判斷、療效評(píng)估和預(yù)后均有重要的意義。
1 HBV 感染與復(fù)制過(guò)程
1.1感染途徑 ：乙型肝炎病毒感染人體主要是通過(guò)血液傳播，大多數(shù)情況通過(guò)注射；二是通過(guò)母嬰傳播；其次性傳播。無(wú)論通過(guò)哪個(gè)途徑，乙肝病毒進(jìn)入血液循環(huán)在體內(nèi)流動(dòng)，會(huì)經(jīng)過(guò)人體的一個(gè)非特異性免疫清除，在血液循環(huán)里面要經(jīng)過(guò)吞噬細(xì)胞的吞噬。病毒在循環(huán)中突破了這些屏障，游離到它需要復(fù)制的靶位，即肝細(xì)胞。病毒進(jìn)入肝細(xì)胞復(fù)制，首先要使肝細(xì)胞接受它，也就是說(shuō)肝細(xì)胞上要有受體與病毒結(jié)合。病毒可以依靠肝細(xì)胞的細(xì)胞膜的某一部分，通過(guò)胞引作用進(jìn)到肝細(xì)胞內(nèi)。病毒可以在此釋放核酸，核酸在肝細(xì)胞內(nèi)依靠細(xì)胞內(nèi)的原料進(jìn)行復(fù)制和合成。1.2復(fù)制與免疫應(yīng)答：病毒一旦在肝細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，肝細(xì)胞就會(huì)有核酸出現(xiàn)，核酸產(chǎn)生后核心抗原就會(huì)相應(yīng)的出現(xiàn)。核心抗原會(huì)包裹核酸，但由于核酸分子較小，包裹以后會(huì)有多余的一部分結(jié)構(gòu)。多余的部分可以被核內(nèi)的一些酶切掉，這一部分就是 E 抗原。因此 E 抗原的存在就是乙肝病毒復(fù)制的一個(gè)標(biāo)志。 E 抗原從肝細(xì)胞釋放到細(xì)胞以外，血液循環(huán)里面就能夠檢測(cè)到 E 抗原的存在。人體的免疫細(xì)胞就會(huì)通過(guò)免疫的應(yīng)答產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，即 E 抗體。在病毒復(fù)制的初期， E 抗原產(chǎn)生的量要大于抗體，因此這時(shí)檢測(cè)到的是 E 抗原而 E 抗體檢測(cè)不到。如果病毒處于復(fù)制的高峰期，釋放的抗原在血液循環(huán)內(nèi)增加，特別是大蛋白的抗原，包括表面抗原的大蛋白，就可以誘導(dǎo)的人體細(xì)胞對(duì)它進(jìn)行識(shí)別和應(yīng)答。1.3免疫損傷：人體除在血液循環(huán)內(nèi)對(duì)抗原進(jìn)行應(yīng)答之外，含有病毒復(fù)制的肝細(xì)胞還會(huì)有細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的一些變化。這些變化可以誘導(dǎo)人體的免疫細(xì)胞，對(duì)有病毒的肝細(xì)胞進(jìn)行免疫應(yīng)答，從而對(duì)該細(xì)胞進(jìn)行殺傷，使肝細(xì)胞發(fā)生免疫損傷，細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)氨酶就會(huì)釋放到血液循環(huán)內(nèi)，細(xì)胞核也會(huì)破碎從而把細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)釋放出來(lái)，這就是免疫應(yīng)答的過(guò)程，導(dǎo)致了免疫損傷。因此也導(dǎo)致了我們所說(shuō)的肝功能損害，通過(guò)一些生化指標(biāo)的監(jiān)測(cè)可以監(jiān)測(cè)到肝功的損害。1.4cccDNA 的形成：乙肝是慢性疾病，乙肝病毒在肝細(xì)胞內(nèi)是連續(xù)傳代。病毒一旦進(jìn)入肝細(xì)胞以后就會(huì)開(kāi)始復(fù)制，復(fù)制出的病毒就會(huì)從肝細(xì)胞里面釋放出來(lái)，而釋放出來(lái)的病毒除了被人體免疫系統(tǒng)進(jìn)行識(shí)別和殺傷之外，還有一部分會(huì)再侵犯其他的肝細(xì)胞，并在其他肝細(xì)胞里面再進(jìn)行這樣的復(fù)制，如此循環(huán)。能夠在肝細(xì)胞里復(fù)制的病毒是有活性的，這種乙肝病毒它的 DNA 是松散的雙鏈結(jié)構(gòu)。它是個(gè)這種雙鏈結(jié)構(gòu)是松散的而不是閉合的環(huán)結(jié)構(gòu)。但是，有些病毒的核酸在進(jìn)到肝細(xì)胞的細(xì)胞核以后，在 DNA 聚合酶的作用下，將環(huán)形松散的缺口補(bǔ)齊，變成一個(gè)超螺旋的共價(jià)、閉合、環(huán)狀 DNA ，即 cccDNA 。
2 HBV cccDNA 的概念及意義
2.1“睡眠”的病毒 DNA：cccDNA 形成之后狀態(tài)比較穩(wěn)定，可以稱其為肝細(xì)胞核內(nèi)“睡眠”的病毒 DNA ，當(dāng)病毒活躍性復(fù)制時(shí)，它又可以作為一個(gè)模塊來(lái)復(fù)制病毒。一般在每個(gè)肝細(xì)胞核內(nèi)，可以有 5～50 拷貝的 cccDNA。2.2cccDNA 的意義：cccDNA在肝細(xì)胞內(nèi)很穩(wěn)定，只要肝細(xì)胞不被破壞很少釋放到外周血液循環(huán)，因此很難從血液中檢測(cè)。但如有大片肝細(xì)胞壞死，大量的 cccDNA 就會(huì)從細(xì)胞核內(nèi)釋放到血液循環(huán)，此時(shí)人體的免疫系統(tǒng)除對(duì)釋放的 cccDNA 有應(yīng)答外，對(duì)于人的細(xì)胞核也會(huì)產(chǎn)生抗體，即抗核抗體。抗核抗體的存在是細(xì)胞核暴露所引起的。目前通過(guò)肝活檢來(lái)監(jiān)測(cè)乙肝患者肝組織中的cccDNA水平變化存在著一定困難，因而監(jiān)測(cè)血液中的cccDNA的動(dòng)態(tài)變化也許更具有現(xiàn)實(shí)意義。當(dāng)然，其中還存在一些問(wèn)題有待研究和解決，比如血液中的cccDNA水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于肝組織中的cccDNA水平，也遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于血液中的的rcDNA水平，因此必須進(jìn)一步提高cccDNA定量檢測(cè)的靈敏度。
3 針對(duì) cccDNA 的治療現(xiàn)狀
目前臨床治療時(shí)雖然很多抗病毒藥物，但并沒(méi)有能夠進(jìn)到細(xì)胞核以內(nèi)的藥物，還不能夠達(dá)到清除細(xì)胞核內(nèi) cccDNA 的目的。現(xiàn)有的抗病毒治療只是抑制病毒的復(fù)制，而不能把藏匿于核內(nèi)的，復(fù)制的最基本模板―― cccDNA 去掉。因此肝病往往是慢性的，而且比較容易復(fù)發(fā)，所謂復(fù)發(fā)，就是在肝細(xì)胞核內(nèi)“睡眠”的病毒 DNA 按照病毒自身的復(fù)制周期進(jìn)行復(fù)制。 對(duì)于肝細(xì)胞以外的器官是否有 cccDNA 的存在，目前還在研究階段。另外，目前還沒(méi)有一個(gè)比較穩(wěn)定、可靠和敏感的 cccDNA 檢測(cè)的方法上市，因此 cccDNA 的檢測(cè)和治療都是相當(dāng)困難的。
4 cccDNA 和 rcDNA 的差異
4.1一級(jí)結(jié)構(gòu)差異：從核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)來(lái)看 cccDNA 是一條完整的雙鏈，是共價(jià)閉和環(huán)。松弛環(huán)狀 DNA（ rcDNA ），雖然也是環(huán)狀的，但是它是有缺口的，它不完整的。4.2空間結(jié)構(gòu)差異：從核酸空間結(jié)構(gòu)來(lái)看cccDNA 是超螺旋結(jié)構(gòu)；rcDNA 是松弛環(huán)狀，不是超螺旋的結(jié)構(gòu)。4.3與蛋白結(jié)合差異：cccDNA 因?yàn)橐呀?jīng)形成了穩(wěn)定的共價(jià)閉合環(huán)狀的結(jié)構(gòu)，所以不能和蛋白結(jié)合。而 rcDNA 卻可以和蛋白共價(jià)結(jié)合，因此如果通過(guò)沉淀蛋白的方法來(lái)提取乙肝病毒的DNA ，所得到的更多的是cccDNA ，因?yàn)閞cDNA 可以和蛋白結(jié)合被沉淀下去。4.3核酸酶抗性差異：cccDNA 對(duì)某些核酸酶的抗性較強(qiáng)，一般不易被降解，而 rcDNA 則相對(duì)較弱，很容易被降解。
關(guān)鍵詞： 5型腺病毒；間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）；胰腺十二指腸同源框蛋白1（PDX1）；成對(duì)盒基因4（PAX4）；轉(zhuǎn)錄因子
中圖分類號(hào)：Q78文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A
文章編號(hào)：1672-1098（2016）02-0080-07
Abstract：With the use of pADxsi system， the recombinant adenovirus of expressing PDX1 and PAX4 is in place.GFP in the pShuttle-GFP-CMV vector is replaced with the target gene of PDX1 obtained from the pEGFP-N1-PDX1 plasmid， resulting in the pShuttleCMV-PDX1 plasmid. With the pEGFP-N1-PAX4 plasmid cut off， PAX4 is inserted into pShuttle-CMV-PDX1 to acquire the pShuttle-CMV-PDX1/CMV-PAX4 plasmid. Afterwards， the CMV-PDX1/CMV-PAX4 fragment is transferred to the ADxsi skeleton vector to get the pADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4 virus vector. Finally， the recombinant adenovirus is packaged， amplificated， and titrated in HEK293 cells for the infection of human umbilical cord mesenchymal stem cells. The structure of pADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4 adenovirus expression vector is confirmed by means of a restriction analysis and PCR. RT-PCR and Western blot results have established that the target genes are persistently expressed in the infected cells.The recombinant human PDX1 and PAX4 expressing adenovirus is successfully constructed， packaged， and amplificated.The target genes can be continuously presented in mesenchymal stem cells.
Key words：adenovims vector；pancreatic and duodenal homeobox factor 1；paired box gene 4；mesenchymal stem cells
糖尿病是由于胰島β細(xì)胞功能絕對(duì)或相對(duì)缺陷，以慢性高血糖為特征的終身性代謝性疾病[1-2]。長(zhǎng)期血糖增高，可導(dǎo)致大血管、微血管受損并危及心、腦、腎、周?chē)窠?jīng)、眼睛、足等，每年因糖尿病死亡者有一半以上是心腦血管所致，10%是腎病變所致；因糖尿病截肢是非糖尿病的10～20倍[3-4]。因此，預(yù)防糖尿病的并發(fā)癥并最終控制血糖是重要的社會(huì)問(wèn)題。
至目前為止，控制患者血糖仍主要是依賴每天胰島素的補(bǔ)充，給患者生活帶來(lái)極大的不便與沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。尋找具有合成與分泌胰島素的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞替代治療一直是研究的熱點(diǎn)。近年來(lái)研究證實(shí)間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化的潛能且無(wú)免疫原性，是一類極具應(yīng)用潛能的干細(xì)胞[4-5]。胰十二指腸同源框基因1 （pancreatic and duodenal homeobox factor 1，PDX 1）在胚胎發(fā)育過(guò)程中具有促進(jìn)胚胎干細(xì)胞向胰腺的早期發(fā)育和晚期胰島素分泌細(xì)胞分化的功能[6]；此外，還具有維持胰島β細(xì)胞合成與分泌胰島素的功能[7-8]；然而，單獨(dú)的PDX1轉(zhuǎn)錄因子并不能有效誘導(dǎo)干細(xì)胞定向向胰島β細(xì)胞分化，在胰腺前體分化與發(fā)育過(guò)程中，成對(duì)盒基因4（paired box gene 4，PAX4）表達(dá)將有利于胰腺前體細(xì)胞定向向β細(xì)胞分化，并參與調(diào)控β細(xì)胞功能的成熟[8-10]。因此，PDX1與PAX4聯(lián)合作用對(duì)誘導(dǎo)MSCs定向向具有合成與分泌胰島素功能的β樣細(xì)胞可能具有促進(jìn)作用，基于這一假設(shè)，在本研究中，選用對(duì)MSCs具有較高感染效率的Ⅴ型腺病毒載體，構(gòu)建攜帶目的基因PDX1與PAX4的重組腺病毒ADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4，感染MSCs細(xì)胞，以觀測(cè)所攜帶的目的基因表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究PDX1與PAX4在誘導(dǎo)MSCs向具有合成與分泌胰島素功能的β樣細(xì)胞分化的可能及其分子機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
1材料和方法
1.1材料與試劑
Bgl II等多種限制性內(nèi)切酶、Klenow及T4 DNAligase均購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；CIP（Alkaline Phosphatase，Calf Intestinal）酶、質(zhì)粒提取純化試劑盒和凝膠回收試劑盒購(gòu)自北京天恩澤公司；腺病毒pADxsi載體系統(tǒng)由上海漢恒生物有限公司提供；293細(xì)胞及DH5a菌株由深圳清華研究院鄭義博士惠贈(zèng)，pEGFP-N1-PAX4與pEGFP-N1-PDX1質(zhì)粒為前期本實(shí)驗(yàn)室所構(gòu)建。Anti-PAX4 antibody （ab42450）/IgG、Anti-PDX1 antibody （ab47383）/IgG購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，HRP標(biāo)羊抗鼠IgG、HRP標(biāo)羊抗兔IgG、FITC標(biāo)羊抗兔IgG、CY5標(biāo)羊抗鼠IgG購(gòu)自eBioscience公司。Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen公司；引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成；RT-PCR試劑盒為北京天恩澤公司； DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)自Hyclone公司。原代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞購(gòu)自北京醫(yī)科利昊生物科技有限公司。
1.2方法
1） pADxsi-CMV- PDX1/CMV- PAX4腺病毒載體的構(gòu)建。 首先構(gòu)建pShuttle-GFP-CMV- PDX1穿梭質(zhì)粒：已知PDX1序列上游有Nhe I和Bgl II酶切位點(diǎn)，下游有Sal I和EcoR I酶切位點(diǎn)，首先用Sal I酶切pEGFP-N1- PDX1，再用Klenow平端處理，最后用Nhe I酶切，回收0.66 kb片段；其次用Nhe I和Pme I雙酶切pShuttle-GFP-CMV載體，替換GFP， CIP去磷酸化處理，回收載體片段5.2 kb；最后，酶連切好的載體片段和插入片段，獲得pShuttle-CMV-PDX1。再構(gòu)建pShuttle-CMV-PDX1/CMV-PAX4穿梭質(zhì)粒載體：從pEGFP-N1-PAX4上用BamH I和Sal I雙酶切切下PAX4（PAX4序列上游存在BamH I和Bgl II酶切位點(diǎn)，下游存在Xba I和Sal I酶切位點(diǎn)）；同時(shí)對(duì)pShuttle-CMV- PDX1載體用BamH I和 Sal I雙酶切，CIP去磷酸化處理，膠分別回收與純化載體與酶切PAX4目的基因片段并用T4 DNA 連接酶酶連得到pADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4穿梭質(zhì)粒。最后用T4 DNA 連接酶酶連目的片段pShuttle-CMV-PDX1/CMV-PAX4和pADxsi骨架質(zhì)粒；轉(zhuǎn)化產(chǎn)物并轉(zhuǎn)染DHSa，擴(kuò)增pADxsi -CMV-PDX1/CMV- PAX4質(zhì)粒，對(duì)質(zhì)粒產(chǎn)物進(jìn)行提取并進(jìn)行電泳簽定，產(chǎn)物由上海豐恒生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。
2） 重組腺病毒的包裝、擴(kuò)增和滴度測(cè)定。 Pac I酶切線性化重組腺病毒質(zhì)粒，用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞密度約80%的293細(xì)胞。3～5 d后，開(kāi)始出現(xiàn)明顯噬斑，待大部分細(xì)胞病變（cyto-pathic effect，CPE）時(shí)，收集細(xì)胞混懸液，于-80℃/25℃反復(fù)凍融3次，再離心收集上清，繼續(xù)感染293細(xì)胞擴(kuò)增病毒以提高腺病毒（ADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4）滴度，TCID 50法測(cè)定病毒滴度。
3） ADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4感染MSCs與目的基因表達(dá)。 于六孔板接種MSCs細(xì)胞5.0×105/孔，細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)，按感染指數(shù)為10PFU/細(xì)胞、50PFU/細(xì)胞、100PFU/細(xì)胞加入相應(yīng)量的腺病毒液；同時(shí)設(shè)ADxsi-CMV-GFP感染的空病毒對(duì)照組。當(dāng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到相應(yīng)階段時(shí)，即培養(yǎng)到24h、48h和72h等階段分別收集細(xì)胞行WB、免疫細(xì)胞化學(xué)與間接熒光檢測(cè)；同時(shí)RT-PCR檢測(cè)目的基因表達(dá)，引物分別如下PDX1 的F：5′-AAGCTAGCCCGCAGCCATGA-3′、R：5′-TCCTCGAGTCATCGTGGTTCCTG-3′，Tm為61.5℃，擴(kuò)增目的片段為882bp；PAX4：F：5′-TCCCAGTGTCTCCTCCATC-3′、R：5′-ACCTTTCCGGTGCTGTTGC-3′，Tm為60 ℃，擴(kuò)增目的片段為515 bp；內(nèi)參照分子GAPDH：F：5′-GTCAGTGGTGGACCTGACCT-3′、R： 5′-TGAGGAGGGGAGATTCAGTG-3′。
（4）Western blotting檢測(cè)
胰酶消化，收集目的細(xì)胞，裂解細(xì)胞并離心取上清液，應(yīng)用15%的SDS-PAGE膠電泳2h后，濕轉(zhuǎn)移法至PVDF膜，脫脂牛奶TBST液封閉1h，再分別加抗人PAX4、PDX1抗體IgG液振蕩過(guò)夜，HRP標(biāo)記相應(yīng)二抗親合反應(yīng)后ECL顯色。
2結(jié)果
2.1鑒定重組腺病毒質(zhì)粒
Xho I酶切pADxsi-CMV- PDX1/CMV-PAX4病毒質(zhì)粒，陽(yáng)性克隆pADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4由以下6條帶組成即：14 kb、11.8 kb、5.9 kb、2.47 kb、1.45 kb、0.6 kb；而陰性克隆（pADxsi骨架質(zhì)粒）只有以下6條帶組成：14 kb、11.8 kb、4.0 kb、2.47 kb、1.45 kb、0.6 kb；酶切結(jié)果陽(yáng)性質(zhì)粒均與理論預(yù)期一致，具體酶切結(jié)果（見(jiàn)圖1）。
2.2重組腺病毒的包裝和滴度測(cè)定
Pac I酶切線性化的pADxsi-CMV- PDX1/CMV-PAX4重組腺病毒質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后3 d，開(kāi)始出現(xiàn)病變效應(yīng)（見(jiàn)圖3）。120 h后，此時(shí)約70%細(xì)胞懸浮，收集細(xì)胞與上清液體，凍融后，再應(yīng)用293細(xì)胞重復(fù)擴(kuò)增、收集病毒液。空斑計(jì)數(shù)法（PFU）測(cè)定病毒滴度為1.0×108 PFU/mL；使用同樣方法測(cè)定對(duì)照組。空載腺病毒ADxsi的滴度為2.0×108 PFU/mL。
2.3 目的基因表達(dá)
MSCs在光學(xué)顯微鏡下呈典型的長(zhǎng)梭形，呈漩渦狀或放射狀平行排列（見(jiàn)圖4）； ADxsi-CMV-GFP空病毒感染后24 h即可在熒光鏡下觀察到GFP表達(dá)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色與間接熒光分別證實(shí)ADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4腺病毒以感染復(fù)數(shù)（MOI）=100感染目的細(xì)胞 （MSCs）24 h后，實(shí)驗(yàn)組MSCs的細(xì)胞核中即可檢測(cè)到PDX1與PAX4 mRNA；細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)顯示，PDX1與PAX4 主要定位于細(xì)胞核內(nèi)，陽(yáng)性率高于75%。間接熒光同樣證實(shí)細(xì)胞核中PAX4（FITC）與PDX1 （CY5）均穩(wěn)定表達(dá)（見(jiàn)圖4）。
轉(zhuǎn)染后光鏡下的細(xì)胞形態(tài)相同于正常的MSCs細(xì)胞形態(tài)，呈梭形排列，應(yīng)用ADxsi-CMV-EGFP空病毒感染細(xì)胞后，可見(jiàn)到細(xì)胞內(nèi)綠色熒光表達(dá)，分別應(yīng)用抗體檢測(cè)PDX1與PAX4表達(dá)與定位，熒光結(jié)果顯示PDX1與PAX4均定位于細(xì)胞核內(nèi)，且免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)也證實(shí)兩轉(zhuǎn)錄因子定位于細(xì)胞核內(nèi)，且穩(wěn)定表達(dá)。
2.4 目的基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)
RT-PCR法與WB分別檢測(cè)重組腺病毒ADxsi-CMV- PDX1/CMV-PAX4轉(zhuǎn)染后不同時(shí)段細(xì)胞內(nèi)目的基因mRNA和蛋白表達(dá)結(jié)果顯示：MSCs胞質(zhì)內(nèi)PDX1與PAX4 mRNA水平穩(wěn)定；進(jìn)一步Western blotting（WB）法檢測(cè)感染后12 d的細(xì)胞核內(nèi)PDX1與PAX4蛋白一直穩(wěn)定表達(dá)（見(jiàn)圖5），提示重組腺病毒ADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4可以有效感染MSCs，且目的基因均能穩(wěn)定表達(dá)，這為后續(xù)研究目的基因在MSCs轉(zhuǎn)分化過(guò)程中的功能奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
3討論
MSCs具有多向分化潛能，為探討MSCs分化為合成與分泌胰島素功能的胰腺β細(xì)胞，選用了在胰腺前體細(xì)胞向β細(xì)胞分化過(guò)程中起關(guān)鍵作用的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子PDX1與PAX4[8-11]，并構(gòu)建對(duì)MSCs具有穩(wěn)定轉(zhuǎn)染能力的Ⅴ型腺病毒載體[12-13]，用PDX1換去示蹤基因EGFP，把PAX4基因插入到多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建并包裝成帶PDX1與PAX4雙目的基因的活性重組腺病毒（ADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4），酶切結(jié)果與測(cè)序結(jié)果證實(shí)重組腺病毒構(gòu)建成功，目的基因連接正確。
應(yīng)用ADxsi-CMV-PDX1/CMV-PAX4感染MSCs結(jié)果顯示，重組病毒可以穩(wěn)定高效感染MSCs，間接熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染的MSCs在細(xì)胞核穩(wěn)定表達(dá)PDX1與PAX4分子，細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果同樣證實(shí)PDX1與PAX4分子定位于在MSCs細(xì)胞核內(nèi)，這提示帶PDX1與PAX4轉(zhuǎn)錄因子基因的重組腺病毒不僅可以高效感染目的細(xì)胞，并且穩(wěn)定表達(dá)目的轉(zhuǎn)錄因子，而且所帶的轉(zhuǎn)錄因子均具有核定位功能。
另一方面應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄重組腺病毒的MSCs細(xì)胞內(nèi)目的基因的轉(zhuǎn)錄水平表明目的基因在重組腺病毒感染細(xì)胞后仍可以檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄目的基因的mRNA水平穩(wěn)定，提示在腺病毒的CMV啟動(dòng)子的作用下，目的基因在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄。進(jìn)一步抽提感染腺病毒的MSCs的細(xì)胞白，并行WB檢測(cè)PDX1和PAX4轉(zhuǎn)錄因子蛋白水平，發(fā)現(xiàn)兩種轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞核水平穩(wěn)定，這一方面提示腺病毒的CMV啟動(dòng)子具有強(qiáng)的啟動(dòng)目的基因轉(zhuǎn)錄功能，另一方面，目的轉(zhuǎn)錄因子穩(wěn)定定位于細(xì)胞核，說(shuō)明表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子具有核定位能力。的并且能穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄與表達(dá)PDX1與PAX4分子。
綜上檢測(cè)結(jié)果證實(shí)， PDX1與PAX4雙帶目的基因的Ⅴ型重組腺病毒被成功構(gòu)建，重組腺病毒所帶的目的基因均能穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄與翻譯成功能轉(zhuǎn)錄因子PDX1與PAX4，且兩功能轉(zhuǎn)錄因子均具有核定位功能，這為下一步研究2功能轉(zhuǎn)錄因子在誘導(dǎo)MSCs定向向胰腺β細(xì)胞分化過(guò)程中的功能與分子機(jī)制奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
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初見(jiàn)馬炯，并沒(méi)有想象中那么嚴(yán)肅。他坦誠(chéng)、開(kāi)朗、愛(ài)笑，直言不諱，又分寸有佳。他聊星座，說(shuō)自己能在兩個(gè)領(lǐng)域里吃香大概是“托了這個(gè)雙子座的福”；還笑言自己是追星族，并拿出與諾獎(jiǎng)得主的照片和記者一同分享。而談及他的科研工作，馬炯并沒(méi)有太多地說(shuō)起科研工作的辛苦，而是更多地分享他的步步歷程。
一半是技術(shù)，一半是生物
馬炯1999年進(jìn)入復(fù)旦大學(xué)物理系，2008年取得物理系光學(xué)專業(yè)博士學(xué)位。博士階段開(kāi)始，馬炯就致力于發(fā)展光學(xué)技術(shù)與生物課題相結(jié)合的研究工作。期間他曾作為訪問(wèn)學(xué)者前往南非羅德斯大學(xué)化學(xué)系和挪威奧斯陸大學(xué)生理系進(jìn)行學(xué)術(shù)交流。
在南非期間，他確認(rèn)水溶性CdTe量子點(diǎn)的光催滅機(jī)理，首次測(cè)定其單態(tài)氧產(chǎn)量，并開(kāi)創(chuàng)出一種應(yīng)用于其實(shí)現(xiàn)光動(dòng)力治療癌癥的方法。2008年赴美從事博士后工作后，他一直致力于發(fā)展新型的單分子超分辨熒光顯微鏡，用于細(xì)胞核孔復(fù)合物的研究工作。在美國(guó)，馬炯與Yang教授共同開(kāi)發(fā)了SPEED顯微技術(shù)，并在10nm空間精度和400μs時(shí)間精度下，研究了各類分子穿越細(xì)胞核孔的選擇機(jī)制。他首次觀測(cè)到細(xì)胞核孔內(nèi)非折疊蛋白的三維結(jié)構(gòu)，并首次獲得生物小分子穿越細(xì)胞核孔三維路徑，確定了其間的選擇性機(jī)制，并于2010年及2012年在Proceedings of the National Academy of Sciences上發(fā)表了兩篇高質(zhì)量論文。
馬炯還與Walter教授合作，開(kāi)發(fā)應(yīng)用于超分辨顯微鏡的mRNA熒光標(biāo)記系統(tǒng)，結(jié)合單分子顯微追蹤技術(shù)，完成了mRNA穿越核孔的選擇機(jī)制的初步研究，確認(rèn)了mRNA核孔輸出三維路徑，糾正了一維路徑數(shù)據(jù)所造成的認(rèn)知誤解，并發(fā)表在Nature Communication上。
而談到技術(shù)和生物研究，馬炯說(shuō)他從來(lái)沒(méi)有糾結(jié)兩者之間的取舍，而是始終游走在兩者的平衡之中。曾經(jīng)在南非和挪威做訪問(wèn)學(xué)者的時(shí)候，他感到技術(shù)上偏重太多時(shí)，就在前去美國(guó)的時(shí)候有意識(shí)地加重了生物研究的選擇。技術(shù)是他的“技”，而生物就是他的“巧”。有技方成巧，通過(guò)超分辨率光學(xué)顯微鏡的技術(shù)不斷提高，他在細(xì)胞核孔復(fù)合物領(lǐng)域的研究也不斷加深；以巧推動(dòng)技，通過(guò)細(xì)胞核孔復(fù)合物實(shí)驗(yàn)研究的需求，他又不斷革新超分辨光學(xué)顯微鏡的技術(shù)。雙子的多面性，他展現(xiàn)在了科研領(lǐng)域中，并且大獲成功。
2015年6月，馬炯?xì)w國(guó)。他坦言，歸國(guó)的一部分原因是因?yàn)楣枢l(xiāng)的父母，另一部分則是國(guó)家現(xiàn)在對(duì)于青年學(xué)者的重視，能夠讓他在最有精力的時(shí)刻投入到科研中去。“能夠?yàn)閲?guó)家做一點(diǎn)事情，國(guó)家也重視我做的事情，這當(dāng)然是再好不過(guò)了。”馬炯笑言。
超分辨光學(xué)顯微鏡下看世界
顯微鏡的發(fā)展?jié)M足了人們對(duì)觀察微觀世界的需求，讓人們可以看得越來(lái)越“小”。但由于衍射極限的存在，幾十年來(lái)光學(xué)顯微鏡的分辨率停滯在了200nm左右。2014年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)?lì)C發(fā)給了美國(guó)及德國(guó)三位科學(xué)家Eric Betzig、Stefan W. Hell和William E. Moerner，獲獎(jiǎng)理由是“研制出超分辨率熒光顯微鏡”。幾位獲獎(jiǎng)?wù)咔擅钤O(shè)計(jì)了避開(kāi)衍射極限的方法，其研究突破性地將光學(xué)顯微鏡帶入了納米維度。在納米顯微鏡下，科學(xué)家實(shí)現(xiàn)了活體細(xì)胞中單個(gè)分子通路的可視化，能夠觀察到分子是如何在大腦神經(jīng)細(xì)胞之間生成神經(jīng)突觸；可以追蹤帕金森病、阿爾茲海默癥和亨廷頓癥患者體內(nèi)相關(guān)蛋白的累積情況；還能跟蹤受精卵在分裂形成胚胎時(shí)蛋白質(zhì)的變化過(guò)程。現(xiàn)在已經(jīng)進(jìn)入了“光學(xué)顯微鏡2.0”的時(shí)代，超分辨熒光顯微鏡推動(dòng)著新一輪生物醫(yī)學(xué)的飛速發(fā)展。
現(xiàn)今，已具有多種不同超分辨成像技術(shù)實(shí)際應(yīng)用于生物系統(tǒng)的范例，也已出現(xiàn)了商業(yè)化的超分辨顯微鏡系統(tǒng)，但仍然沒(méi)有達(dá)到完美狀態(tài)。在許多生物研究中，各類超分辨系統(tǒng)有著各自的局限性，如對(duì)于特殊熒光標(biāo)記的發(fā)光特性依賴，或是高空間精度測(cè)量制約了探測(cè)時(shí)間進(jìn)一步縮短。因此，研究和發(fā)展合適新的原理和方法，研制出適合專項(xiàng)生物課題研究的顯微鏡將是今后發(fā)展的一大方向。
談起二維到三維的超分辨退卷積計(jì)算開(kāi)發(fā)的時(shí)候，馬炯說(shuō)起了一個(gè)有意思的故事：他做出這個(gè)開(kāi)發(fā)之后，花了整整一個(gè)星期的時(shí)間說(shuō)服他的老師來(lái)相信他的成果，因?yàn)樗睦蠋煾緹o(wú)法想象有人可以做出從二維分布中獲取系統(tǒng)的三維分布的開(kāi)發(fā)。而當(dāng)他的老師認(rèn)可了他的成果，他和他的老師又開(kāi)始一起說(shuō)服領(lǐng)域里的其他研究者一起應(yīng)用這項(xiàng)成果的相關(guān)研究人員。“這告訴我們，固化思維的可怕。科技要進(jìn)步，科研人員要?jiǎng)?chuàng)新研究，首先就要從打破自己的固有傳統(tǒng)認(rèn)知開(kāi)始。”馬炯嚴(yán)肅地說(shuō)。
歸國(guó)后的馬炯將開(kāi)始著手建立顯微鏡第二平臺(tái)熒光返還探測(cè)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)兼具超高的時(shí)間和空間分辨率的三維分子熒光追蹤系統(tǒng)。他將把研究中所獲得的信息將與跟蹤RNA輸出細(xì)胞核孔的研究互相印證，通過(guò)分析RNA在細(xì)胞核孔各位置的高時(shí)空精度動(dòng)態(tài)過(guò)程，進(jìn)一步研究細(xì)胞核孔蛋白調(diào)控基因的機(jī)理。此外，研究中所發(fā)展的原理和方法還將能夠被廣泛用于毫秒量級(jí)甚至更快的纖毛內(nèi)分子運(yùn)輸、細(xì)胞間分子交換及跨膜通道開(kāi)關(guān)等生物問(wèn)題的研究。
在研究中，馬炯將采用創(chuàng)新技術(shù)，促使實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)同時(shí)具有很高的時(shí)間和三維空間分辨率，在不影響平面二維光學(xué)分辨精度的前提下，不通過(guò)擬合點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)，而在亞毫秒級(jí)時(shí)間分辨量級(jí)和10nm三維空間分辨量級(jí)，實(shí)現(xiàn)對(duì)三維單分子熒光信息的實(shí)時(shí)探測(cè)和分析，滿足高速動(dòng)態(tài)生物學(xué)研究的特點(diǎn)和條件。在新型光學(xué)系統(tǒng)中，他還將利用凹面鏡返還光程無(wú)色差的光學(xué)原理，創(chuàng)新設(shè)計(jì)凹面鏡熒光返還光路系統(tǒng)，能夠?qū)方向信息轉(zhuǎn)換成x-y水平方向的信息，從而獲取單分子z方向的位置信息。
細(xì)胞核孔復(fù)合物探尋
在細(xì)胞核孔復(fù)合物的研究中，馬炯將利用SPEED顯微鏡技術(shù)，完成各類FG屏障與各類主要的傳輸分子間反應(yīng)區(qū)域的三維分布測(cè)量。細(xì)胞核孔復(fù)合物是真核細(xì)胞中連接細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核之間的選擇性雙向通道，控制著絕大部分細(xì)胞核所需的蛋白輸入，以及核內(nèi)基因物質(zhì)的輸出。可以說(shuō)，核孔是細(xì)胞內(nèi)基因調(diào)控中非常重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。核孔的缺陷會(huì)導(dǎo)致核孔相關(guān)的白血病及阿爾茲海默癥等疾病。其本身更是各類病毒侵入細(xì)胞的重要關(guān)口之一，各類病毒會(huì)通過(guò)不同的方式通過(guò)核孔，最終侵入細(xì)胞的基因表達(dá)系統(tǒng)導(dǎo)致疾病發(fā)生。核孔的結(jié)構(gòu)與功能的研究將為各類基因調(diào)控機(jī)制的研究提供一環(huán)重要的依據(jù)，對(duì)核孔蛋白缺失相關(guān)的白血病、阿爾茲海默癥的致病機(jī)制，以及各種類病毒的侵入機(jī)制等核孔相關(guān)病理機(jī)制或基因治療提供關(guān)鍵信息。
一個(gè)NPC是由30種多不同的核孔蛋白構(gòu)成，長(zhǎng)約200nm、直徑為120nm、中心內(nèi)徑為50nm的大分子復(fù)合物。其中有三分之一的核孔蛋白富含苯丙氨酸-甘氨酸（FG）氨基酸片段，且在自然狀態(tài)下呈現(xiàn)出非固定形態(tài)，我們稱之為FG-Nups。這些FG-Nups組成了具有選擇性機(jī)制的FG屏障。FG屏障選擇性地調(diào)控基因相關(guān)物質(zhì)按照被動(dòng)運(yùn)輸或者主動(dòng)介入運(yùn)輸?shù)姆绞竭M(jìn)出細(xì)胞核：只有小于60kDa的分子才能通過(guò)被動(dòng)運(yùn)輸?shù)姆绞剑杂蓴U(kuò)散通過(guò)NPC；另一種方式是主動(dòng)運(yùn)輸，如含有入核信號(hào)或者核孔輸出信號(hào)的蛋白或復(fù)合物分子，在核孔運(yùn)輸?shù)鞍讕椭拢纬蓮?fù)合物，通過(guò)TRs與FG片段相互作用，從而通過(guò)FG屏障。TRs與需要傳輸?shù)牡鞍仔纬傻膹?fù)合物的結(jié)合與解離，通過(guò)細(xì)胞核內(nèi)外的RanGDP和RanGTP的濃度梯度來(lái)調(diào)節(jié)。通過(guò)電子顯微鏡可以觀察到細(xì)胞核孔結(jié)構(gòu)蛋白，但卻無(wú)法獲得這些高度自由的非折疊蛋白的結(jié)構(gòu)，所以至今在生理狀態(tài)下FG屏障及其相關(guān)的核孔物質(zhì)傳輸?shù)臋C(jī)理仍不清楚。
馬炯將利用SPEED顯微鏡技術(shù)，完成各類FG屏障與各類主要的傳輸分子間反應(yīng)區(qū)域的三維分布測(cè)量。他將確認(rèn)活細(xì)胞內(nèi)FG-Nup相互反應(yīng)的存在及相應(yīng)的水凝膠分布。綜合各反應(yīng)分布，完成接近完善的FG屏障的完整分布。他還將利用基因敲除，獲取缺失核孔蛋白的分布，理解其對(duì)白血病的致病機(jī)理及對(duì)腺相關(guān)病毒（AAV）基因療法的調(diào)控機(jī)制。從傳輸?shù)鞍组g的競(jìng)爭(zhēng)情況，了解細(xì)胞核孔在大通量物質(zhì)運(yùn)輸下對(duì)應(yīng)的優(yōu)先選擇機(jī)制。
達(dá)成這項(xiàng)研究的基礎(chǔ)，是SPEED顯微技術(shù)能在超短的時(shí)間內(nèi)獲得高精度的空間位置信息，調(diào)控光學(xué)設(shè)置的穩(wěn)定和準(zhǔn)確，以及對(duì)各不同分子不同擴(kuò)散速率下，在確保單分子熒光定位精度的同時(shí)，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件獲取最多的數(shù)據(jù)量，是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。擁有豐富的超分辨光學(xué)經(jīng)驗(yàn)，這讓馬炯能夠滿足數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性及穩(wěn)定地產(chǎn)出量。據(jù)此，他將創(chuàng)新領(lǐng)先技術(shù)，努力實(shí)現(xiàn)分子競(jìng)爭(zhēng)通過(guò)核孔的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)創(chuàng)新。
未來(lái)故事
回國(guó)后的馬炯選擇了他的母校復(fù)旦大學(xué)作為科研工作的新起點(diǎn)。這里熟悉的環(huán)境讓他很快就進(jìn)入到了工作當(dāng)中并規(guī)劃新的征程。
首先，馬炯將繼續(xù)提升SPEED顯微技術(shù)的性能及推廣其應(yīng)用范圍。所有的對(duì)稱體系研究中，馬炯的SPEED顯微技術(shù)都可以推廣應(yīng)用。而在快速跟蹤領(lǐng)域中，這項(xiàng)技術(shù)也具有明顯優(yōu)勢(shì)。其次，他將繼續(xù)完善超快速的實(shí)時(shí)單分子三維追蹤。再次，馬炯將提高靜態(tài)單分子熒光定位下的超分辨圖像精度。現(xiàn)在的主流超分辨顯微鏡是用了一種光開(kāi)關(guān)蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)，這將會(huì)造成單位時(shí)間內(nèi)的信號(hào)光的損失。馬炯換了其他方式，利用分子運(yùn)動(dòng)進(jìn)特定區(qū)域時(shí)將這個(gè)分子可能發(fā)出的所有熒光進(jìn)行收集，從而提高靜態(tài)單分子熒光定位下的超分辨圖像精度。
此外，馬炯還將利用單分子熒光圖像獲取除未知外的其他信息。他認(rèn)為這部分是相當(dāng)有意思的內(nèi)容。利用這些單分子圖像可以看到，隨著探測(cè)時(shí)間的加長(zhǎng)，隨著分子運(yùn)動(dòng)速度越來(lái)越快，這個(gè)分子的單分子影像所占區(qū)域會(huì)越來(lái)越大，馬炯可以通過(guò)這些分子的大小探測(cè)到運(yùn)動(dòng)速率的快慢，確定這個(gè)區(qū)域的黏滯性有多大，從而找到這個(gè)分子所在納米位置的環(huán)境信息。
【摘要】 目的 探討冬眠心肌細(xì)胞內(nèi)TNF-α mRNA與心肌細(xì)胞凋亡的變化和意義，初步探索冬眠心肌形成的分子生物學(xué)機(jī)制。方法 行冠狀動(dòng)脈搭橋手術(shù)（CABG）的冠心病患者10例，術(shù)前1周內(nèi)用多巴酚丁胺超聲負(fù)荷試驗(yàn)（DSE）結(jié)合多普勒組織成像(DTI)確定冬眠心肌及正常心肌的存在部位，CABG術(shù)中根據(jù)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行取材（分別取正常心肌和冬眠心肌），并經(jīng)電鏡證實(shí)。取材心肌用 Tunel法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡情況，原位雜交法(ISH)測(cè)定TNF-α mRNA的活性。分析TNF-α mRNA與心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)系。結(jié)果 冬眠心肌細(xì)胞凋亡數(shù)及TNF-α mRNA的表達(dá)較正常細(xì)胞高；TNF-α mRNA與冬眠心肌細(xì)胞凋亡數(shù)相關(guān)（r＝0.816，P＜0.05）。結(jié)論 心肌缺血缺氧時(shí)，心肌細(xì)胞內(nèi)TNF-α分泌增加，TNF-α促進(jìn)冬眠心肌的形成并誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。
【關(guān)鍵詞】 冬眠心肌；腫瘤壞死因子α；分子生物學(xué)機(jī)制
心肌冬眠(hibernating myocardium，HM)是心臟自動(dòng)適應(yīng)心肌慢性低灌注的一種反應(yīng)，此時(shí)心肌灌注和心肌功能之間達(dá)到一種新的平衡。HM已成為近年來(lái)冠心病研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一，但迄今HM形成的確切機(jī)制尚不完全清楚。有研究發(fā)現(xiàn)，HM局部收縮功能與腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)高表達(dá)呈負(fù)相關(guān)［1］，TNF-а的高表達(dá)可以促進(jìn)動(dòng)物心肌細(xì)胞凋亡。TNF-α的表達(dá)與冠心病患者HM凋亡之間的關(guān)系鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究觀察冠心病患者HM細(xì)胞的TNF-α mRNA表達(dá)，同時(shí)觀察HM細(xì)胞凋亡情況。
1 材料和方法
1.1 實(shí)驗(yàn)材料 TNF-α mRNA原位雜交試劑盒、細(xì)胞凋亡試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物公司。冠心病患者的心肌標(biāo)本由徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胸心外科協(xié)助取材。
1.2 心肌標(biāo)本來(lái)源 10例心肌標(biāo)本均來(lái)自2004年8月—2006年3月在我院胸心外科行冠狀動(dòng)脈搭橋手術(shù)（CABG）的冠心病患者，冠狀動(dòng)脈造影至少有1支冠狀動(dòng)脈狹窄程度大于85%。男性7例，女性3例，平均年齡（58.3±4.24）歲。術(shù)中取HM及正常心肌（normal myocardium，NM）。
1.3 HM定位
1.3.1 采用多巴酚丁胺超聲負(fù)荷試驗(yàn)(DSE)結(jié)合組織多普勒成像（DTI）技術(shù)。將左心室按美國(guó)超聲心動(dòng)圖協(xié)會(huì)方法分為相對(duì)應(yīng)的16個(gè)節(jié)段。
1.3.2 DSE檢查方案 試驗(yàn)分為靜息、多巴酚丁胺10 μg/(kg·min)、30 μg/(kg·min) 3個(gè)級(jí)別，每級(jí)負(fù)荷維持5 min，于每級(jí)負(fù)荷時(shí)記錄超聲圖像，并記錄常規(guī)12導(dǎo)聯(lián)ECG和血壓；終止指標(biāo)為：出現(xiàn)心絞痛；收縮壓
1.3.3 室壁節(jié)段運(yùn)動(dòng)異常的判定 DTI測(cè)量心肌收縮期峰值平均運(yùn)動(dòng)速度。如靜息時(shí)平均運(yùn)動(dòng)速度低于正常速度，負(fù)荷10 μg/(kg·min) 多巴酚丁胺時(shí)心肌運(yùn)動(dòng)速度較靜息時(shí)明顯增高，負(fù)荷30 μg/(kg·min) 多巴酚丁胺時(shí)心肌運(yùn)動(dòng)速度反而減低，此時(shí)定義心肌運(yùn)動(dòng)呈雙相反應(yīng)，判定為HM。
1.4 心肌處理 4%戊二醛、10%甲醛（含0.1%焦碳酸二乙酯，DEPC）固定，在電子顯微鏡觀察確認(rèn)后分別進(jìn)行ISH、Tunel試驗(yàn)。ISH法測(cè)TNF-α mRNA，Tunel法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。原位雜交及Tunel法均按試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。
原位雜交探針序列為：
（1）5′-GAGCA CTGAA AGCAT GATCC GGGAC GTGGA-3′
（2）5′-GAGTG ACAAG CCTGT AGCCC ATGTT GTAGC-3′
（3）5′-GGGCA GGTCT ACTTT GGGAT CATTG CCCTG-3′
1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，統(tǒng)計(jì)軟件采用SPSS 13.0，統(tǒng)計(jì)方法采用配對(duì)t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。
2 結(jié) 果
2.1 病理結(jié)果 電鏡下(×12 000)可見(jiàn)HM與NM比較有以下一些特點(diǎn)：心肌纖維數(shù)量減少、稀疏，心肌纖維數(shù)量減少主要集中在細(xì)胞核周?chē)Ｐ募±w維數(shù)量減少時(shí)細(xì)胞容量無(wú)變化（這一點(diǎn)與細(xì)胞萎縮不同）；心肌細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)糖原積淀；心肌細(xì)胞內(nèi)線粒體體積變小，散在分布于胞質(zhì)內(nèi)；細(xì)胞核扭曲，可見(jiàn)散在的異染色質(zhì)；心肌細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有發(fā)生小泡、水腫、染色體腫脹、細(xì)胞核崩解、脂質(zhì)沉積等細(xì)胞壞死和萎縮時(shí)常見(jiàn)的變化。見(jiàn)圖1A。
2.2 原位雜交結(jié)果 HM TNF-α mRNA胞質(zhì)著色成棕黃色（圖1B），原位雜交用Leica Qwin圖像分析儀測(cè)定平均灰度值。HM組TNF-α胞質(zhì)平均灰度值明顯高于NM組(P＜0.05)。見(jiàn)表1。
2.3 心肌凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù) NM細(xì)胞核呈藍(lán)色，而HM中凋亡心肌細(xì)胞核呈棕黃色（圖1C）。在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野（HPF，×100）中凋亡陽(yáng)性心肌細(xì)胞核數(shù)目求其均值，HM組陽(yáng)性心肌細(xì)胞凋亡數(shù)明顯高于NM組。見(jiàn)表1。
2.4 HM 組TNF-α mRNA表達(dá)水平與心肌細(xì)胞凋亡數(shù)的相關(guān)性 HM 組TNF-α mRNA胞質(zhì)平均灰度值與心肌細(xì)胞凋亡數(shù)成正相關(guān)（r=0.816，P＜0.05）。 表1 2組TNF-α mRNA測(cè)定的灰度值及心肌細(xì)胞陽(yáng)性凋亡數(shù)的比較
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3 討 論
TNF-α是一種具有多種生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，人體包括心肌細(xì)胞在內(nèi)的大部分細(xì)胞都能夠合成TNF-α［3］，其參與介導(dǎo)多種疾病發(fā)生發(fā)展的病理生理過(guò)程。TNF-α主要由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞也可合成釋放。心肌也可分泌TNF-α，而且心肌細(xì)胞膜存在TNF-α受體。因此，心肌既是TNF-α的分泌場(chǎng)所，也是其作用的靶目標(biāo)［4］。在生理狀態(tài)下，TNF-α具有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)分化、參與機(jī)體免疫反應(yīng)等多種生物活性；在病理狀態(tài)下則引起炎癥反應(yīng)、器官損害，使心肌細(xì)胞收縮力下降、心肌肥大及心肌細(xì)胞纖維化，最終導(dǎo)致心功能不全［5］。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α在心肌梗死患者心肌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮介導(dǎo)作用［8］。Krown等［9］研究表明，TNF-α可使培養(yǎng)鼠的心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡，且凋亡細(xì)胞數(shù)量與TNF-α濃度成正比。劉亮等［10］研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注損傷和持續(xù)缺血可導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡，抗TNF-α單克隆抗體預(yù)處理能明顯減輕心肌細(xì)胞凋亡程度。本研究用DSE結(jié)合DTI的方法定位冠心病患者HM的部位成功取材，經(jīng)電鏡觀察證實(shí)HM中TNF-α mRNA表達(dá)及心肌細(xì)胞凋亡數(shù)較正常心肌明顯升高。TNF-α mRNA表達(dá)與與HM凋亡數(shù)目成正相關(guān)。表明心肌缺血缺氧時(shí)，心肌細(xì)胞內(nèi)TNF-α分泌增加。TNF-α促進(jìn)HM的形成，并可介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。HM內(nèi)凋亡細(xì)胞會(huì)影響心肌功能，而大量存在的凋亡細(xì)胞會(huì)使血運(yùn)重建后的HM功能恢復(fù)受限。本研究表明，通過(guò)觀察心肌TNF-α mRNA的表達(dá)，能間接反映冠心病患者HM細(xì)胞凋亡的水平，為臨床是否進(jìn)行血運(yùn)重建治療提供依據(jù)。
本研究的不足之處是：采用DSE結(jié)合DTI檢測(cè)HM的方法尚達(dá)不到HM檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但經(jīng)過(guò)電鏡證實(shí)也能達(dá)到準(zhǔn)確診斷的要求。 另外就是所收集的病例數(shù)有限。TNF-α對(duì)敏感細(xì)胞的凋亡效應(yīng)是通過(guò)與細(xì)胞膜上特異性TNF受體（TNFR，主要是TNFR1）結(jié)合后，觸發(fā)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。至于TNF-α表達(dá)促進(jìn)MAPK活化介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的具體過(guò)程目前尚不十分清楚，仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。
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