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開篇：寫作不僅是一種記錄，更是一種創造，它讓我們能夠捕捉那些稍縱即逝的靈感，將它們永久地定格在紙上。下面是小編精心整理的12篇基因編輯技術，希望這些內容能成為您創作過程中的良師益友，陪伴您不斷探索和進步。
[關鍵詞] 基因靶向修飾技術；Cas9；CRISPR/Cas；基因組編輯；基因治療
[中圖分類號] Q78 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）08（a）-0154-04
Review about CRISPR/Cas system as a new targeted genome editing technology
JIA Liangjie
College of Life Sciences， Shaanxi Normal University， Shaanxi Province， Xi′an 710119， China
[Abstract] CRISPR （clustered， regularly interspaced， short， palindromic repeats）/Cas （CRISPR-associated） systems are a unique prokaryotic defense against foreign genetic elements. It also be considered as a targeted genome editing tool in molecular biology research. Because of its simplicity， high success rate and high efficiency in genome targeting， Cas system became the best genome targeting tools compared with ZFNs （Zinc-finger nucleases） and TALENs （Transcription activator-like effector nucleases）. According to the recent researches， Cas system could be used as an efficient system for site-specific transcriptional repression or activation. Additionally， a specific Cas9 protein has been observed to target an RNA substrate， suggesting that Cas9 may have the same ability as RNAi technology to be programmed to target RNA as well. Overall， the targeted genome editing technology via CRISPR/Cas system has been Widely promoted and applied in many field such as the research on gene functions， the the disease model of gene knock-out animal construction and the gene therapy. So it will have significant impact on future advancements in genome engineering.
[Key words] Gene targeting； Cas9； CRISPR/Cas； Genome editing； Gene therapy
CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）/Cas（CRISPR-associated）系統是一種原核生物特有的針對外源性遺傳物質免疫系統，通過序列特異的RNA介導，切割降解外源性DNA，這些外源性遺傳物質包括噬菌體或者外源性質粒[1]。CRISPR/Cas系統可分為三種類型，其中類型Ⅱ CRISPR/Cas系統由于其組成簡單，被改造成為基因組靶向編輯的工具。在類型Ⅱ CRISPR/Cas系統中，CRISPR能夠轉錄產生前體crRNA（Pre-CRISPR RNA，Pre-crRNA），Pre-crRNA經過Cas9-tracrRNA復合物加工后產生成熟的crRNA（CRISPR RNA），crRNA的5′端區域能夠與靶位點互補配對，而其3′端能夠與tracrRNA（trans-activating crRNA）及Cas9蛋白形成復合物，從而引導Cas9蛋白結合于靶位點進行特異性地切割。CRISPR/Cas系統與其他外源核酸防御系統（如限制修飾系統）最重要的區別在于：CRISPR/Cas系統具有記憶性，細菌會記憶首次入侵外源核酸的信息，在其再次入侵時，特異性的識別并切割這些外源核酸酶使其降解，保護自身遺傳物質的完整準確[1]。特異的Cas蛋白會識別外源性的遺傳物質中具有原型間隔序列毗鄰區（protospacer adjacent motifs，PAM）的DN段，通過Cas蛋白將PAM5′端的DNA（即原型間隔序列）加工成短的DN段，插入到其CRISPR序列的重復序列之間，最終使得細菌通過spacer序列識別并且隨后靶向這些外來原件進行切除[2]。
類型Ⅱ CRISPR/Cas系統組成最為簡單，只需要Cas9蛋白、tracrRNA、crRNA、RNase Ⅲ四種成分即可發揮作用[3]。在這一系統中，Cas9蛋白在crRNA的加工以及對外源DNA的特異性切割中都發揮著重要的作用[4]。因此本綜述也主要介紹針對類型ⅡCRISPR/Cas改造而來的相關技術。
1 CRISPR/Cas系統可以作為一種位點特異性基因編輯平臺
CRISPR/Cas系統作為一種具有位點特異性的基因編輯系統，其最大的特點在于操作簡單，這是因為其識別的特異性是有crRNA序列決定的。有報道稱，可以通過人工合成crRNA序列使得Cas9系統識別并結合到與該crRNA互補的DNA序列上，最終介導Cas9蛋白特異性的切割該雜交區域[5]。與crRNA互補的靶位點序列稱為原型間隔序列，除了與crRNA存在互補序列外，在互補序列的毗鄰區還必須存在原型間隔序列毗鄰區（proto-spacer adjacent motif，PAM）。PAM序列對于Cas9系統能夠有效穩定的發揮作用有著重要的意義，其使得雙鏈RNA復合體與靶序列精準的結合，并有效地避免了自身結合現象的發生。
在Cas9系統發揮識別剪切過程中，tracrRNA首先與crRNA形成crRNA：tracrRNA復合體，Cas9蛋白識別并與crRNA：tracrRNA復合體結合，在crRNA的引導下識別并切割靶位點。為了進一步簡化操作過程，研究人員依據crRNA：tracrRNA復合體的結構特征設計了sgRNA（single guide RNA），sgRNA具備crRNA：tracrRNA復合體的功能，能夠被Cas9蛋白識別并引導Cas9蛋白結合于靶位點[5]。
上述Cas9所具有的這些優點使得其能夠成為一種跨平臺的基因編輯工具在多種實驗模型中發揮價值。最新的研究結果顯示，Cas9作為一種基因組編輯工具已經成功的應用在細菌、酵母、植物、線蟲、果蠅、斑馬魚、小鼠和人的細胞模型之中（既包括傳代細胞系和干細胞中）[5-7]{Cong，2013#427}{Cong，2013#427}{Mali，2013#409}{Mali，2013#409}{Cong，2013#425}{Cong，2013#425}{Cong，2013#425}。這說明了它是一種多物種適應性的，位點特異性的有效基因組編輯工具。Cas9-sgRNA在靶位點切割產生雙鏈DNA斷裂（Double strand break，DSB）后，細胞可以通過兩種方式對DNA進行修復，非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）修復方式和同源重組方式（homology-directed repair，HDR）。非同源末端連接往往使得核酸鏈被剪切的區域發生基因突變，導致編碼的基因會喪失功能[8-9]。而同源重組往往通過供體DNA與基因組DNA之間的同源重組造成靶位點的糾正或者靶向插入外源基因[8-9]。
由于sgRNA對靶序列識別的長度只有20個堿基，且Cas9蛋白對sgRNA 5′端序列與靶位點的錯配不敏感，這使得Cas9-sgRNA技術的脫靶率比較高。為了提高該技術打靶的特異性，一種突變型的Cas9蛋白（Cas9 D10A）被構建出來[8-9]。這種突變型的Cas9核酸內切酶是將Cas9蛋白的兩個核酸內切酶結構域之中的一個（RuvC-Ⅰ）經過點突變的從而失活，另一個切割結構域被保留，從而使得目標序列形成單鏈斷裂（nicked DNA）[5]。這樣需要有結合于兩條互補的DNA鏈上相鄰位置的一對sgRNA同時引導Cas9 D10A識別并切割靶位點才能造成DSB，從而加大了識別的長度，有效的提高了Cas9-sgRNA技術的特異性[8-9]。
2 利用Cas9系統在轉錄水平對基因表達的調節
Cas9-sgRNA作為一種能夠與靶位點特異性識別并切割的技術，其用途不僅限于對靶位點的靶向編輯。通過點突變使Cas9蛋白的兩個核酸內切酶結構域活性全部喪失獲得dCas9，但是dCas9仍保留了與靶位點特異性結合的能力，這樣將dCas9-sgRNA作為與DNA特異性識別的平臺，同樣具有很大的應用價值[5，10]。dCas9-sgRNA結合與DNA上，阻斷該位點上基因的轉錄，可以起到轉錄抑制的效果。如果在dCas9的C端融合轉錄抑制結構域KRAB（Krüppel associated box），獲得的dCas9-KRAB-sgRNA具有更強的轉錄抑制效果，將可以替代脫靶效應明顯的siRNA技術。如果在dCas9的C端融合轉錄激活結構域p65AD，則可獲得能激活特定基因轉錄的轉錄因子[10]。通過以上這兩個方面的改造可以使Cas9-sgRNA成為對基因表達的調控工具。由于原核表達系統中，需要依賴于誘導與阻遏調控機制，相反，真核生物中，調控的方式是散在的協同調控方法。所以當我們設計在原核生物中表達一個真核生物的基因或是在真核生物中表達一個原核生物的基因時，這就需要在基因序列前附加一個新的啟動子和具有調控作用的小分子進行轉錄水平的調控，甚至需要對于特定的基因序列設計相應的增強子來對于目標基因的表達進行調控，而利用dCas9-激活或抑制系統就可以繞過這些繁瑣的步驟[11-13]。
3 利用Cas9系統對目標RNA序列進行操縱
最近，相關研究證明了病原體Francisella novicida基因組中編碼的Cas9核酸內切酶能夠引起一個位點特異性的轉錄抑制作用[14]。該文章報道了通過tracrRNA和一種新型的小RNA（small CRISPR/Cas-associated RNA，scaRNA）所介導，F.novicida Cas9（FnCas9）能夠與靶向的mRNA相結合，從而進一步發生反應的過程。隨后，這種Cas9-scaRNA-tracrRNA-mRNA復合結構的各組分之間互作導致了mRNA穩定性衰減從而將靶序列的表達量降低。以此可以推測FnCas9或可能其他的Cas9系統將可以很容易的被介導靶向RNA。事實上，實驗還為研究Cas9系統優先靶向RNA或DNA的機制方面提供了啟發，也就是FnCas9系統作為Cas9系統的一個個例，具有較強的結構特異性和序列需求性。
FnCas9系統靶向特定的RNA序列原理做出第一種推測是， FnCas9系統自身結構的特殊性決定了功能。在目前已知的蛋白結構中沒有一個是可以通過保守殘基與靶向mRNA結合的[14]。相反，在FnCas9系統中存在一個精氨酸富集基元（arginine-rich motif，ARM）結構域，并被證明是在其結合mRNA的過程中發揮了重要的作用[12]。FnCas9系統可能在tracrRNA和mRNA中間形成了一個簡單的腳手架結構，這個結構促使了靶向的核酸內切酶對目標區域RNA的降解[15]。另一種推測是介導RNA和靶向RNA之間的非同源性互作下進行識別并結合。實驗證實，這個現象在病原體F. novicida中出現，tracrRNA上與mRNA反向互補的同源序列和非同源序列相互交錯結合，從而形成tracrRNA-mRNA復合物。
這項新的技術一經提出，預示著FnCas9將會代替shRNA（short hairpin RNA）/siRNA等傳統RNAi（small interfering RNA）技術成為一種新型的RNA干擾物而對于不同種類的細胞及動物模型定的基因的下游產物進行RNA干擾[16]。在目前的研究成果看來，并不能確定此系統能否穩定地在真核生物的細胞之中都能發揮降解RNA的作用[23]。當然，FnCas9系統也并不是唯一一個能夠與mRNA結合產生干擾作用的Cas9系統一種存在于Pyrococcus furiosus 的CRISPR/Cas蛋白亞型（Ⅲ型）被證明可以靶向消化RNA底物[16]。研究發現，與先前提到的FnCas9相比，這一系統所能夠識別并干擾的RNA序列更長，也就表明，這一系統與基于Cas9系統的FnCas9干擾物相比有更高的特異性，這一平臺的發現將極大促進RNAi技術的進步。
4 展望及結語
到目前為止對CRISPR/Cas9技術的開發尚屬初步。首先，雖然Cas9系統會被sgRNA引導從而識別出靶序列，但脫靶效應依然存在[11]。為了減少脫靶效應，研究人員得出了很多方法改變現狀，如通過改變sgRNA的二級結構、改變sgRNA的長度、或是通過互補的切口酶預先制造雙鏈DNA斷裂，這都能有效地減少脫靶效應[11，17-19]。另外，PAM區域與靶片段的同源序列的長短也在近期被報道，在對于Neisseria meningitidis中的Cas9系統（NmCas9）的PAM序列的特異性分析的報道中我們就可以發現，NmCas9系統的PAM區域（5′-NNNNGATT-3′）與Streptococcus thermophilus中的Cas9系統的PAM區域（5′-NNAGAAW-3′）比Streptococcus pyogenes Cas9（5′-NGG-3′）對PAM區域配對的要求嚴格的多[5，8，20]。
從最開始認識到CRISPR作為細菌和古細菌的一種免疫系統，到之后通過觀察到這種獲得性的免疫能力的細菌或是古細菌也能夠生存下來并能將免疫能力傳遞給下一代，認識到 CRISPR/Cas9是一種能夠遺傳的免疫系統，這完美地驗證了拉馬克的獲得性遺傳理論[21]。通過這種在原核生物中發現的遺傳物質靶向操作系統，現在能夠很快速地對遺傳物質進行操作或修飾，無論是在細胞系中還是在模式動物的胚胎中[22]。CRISPR/Cas9系統在基因治療方面能夠發揮較大的作用。通過導入Cas9系統和相應的靶向致病基因的sgRNA載體，來對遺傳缺陷進行糾正或刪除，這種技術將在未來幾十年之內將會逐步成為一種可靠地治療手段。當然，與成熟的ZFN 和 TALEN等遺傳物質靶向編輯系統相比，CRISPR/Cas9核酸內切酶系統具有得天獨厚的優越性，其優越性體現在如構建簡單方便快捷、安全性高、毒性小等方面。CRISPR/Cas9系統在臨床治療、基礎理論研究和農牧漁業等領域必將會發揮巨大的作用，并且將會對分子生物學研究和基因治療領域產生深遠的影響。
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永久性治療乳腺癌
現在，對于癌癥的治療有多種方法，例如，對于女性的乳腺癌可以在發現后進行手術、化療、放療和生物療法。但是，從預防的角度看，與其患病后治療，不如早期預防更有效。而早期的預防是通過健康的生活方式來實現的，如注重飲食均衡、不熬夜、不抽煙、不酗酒等。不過，對于攜帶有乳腺癌致癌基因的人來說，現在又有了一種新的防治癌癥的選擇，即提前切除可能患癌的靶器官，如和卵巢等。美國影視明星朱莉就是這么做的。
2011年，朱莉進行基因檢測發現，她的體內攜帶有致癌基因BRCA1，醫生認為，她患上乳腺癌的概率大約是87%，患卵巢癌的概率是50%。于是，2013年2月，朱莉決定將發病的可能性減到最小，進行了乳腺切除手術，并在切除乳腺后重塑。
切除乳腺后剛兩年，朱莉又做出驚人之舉。2015年3月24日，朱莉宣布，由于擔心罹患卵巢癌，她再次接受手術，切除了卵巢和輸卵管。在兩年的時間內，這位只有39歲的女性為了防癌，先后切除了3種器官（、卵巢和輸卵管）。這一治療方式自然引發了專業人員和公眾的熱議和爭論，在未出現癥狀和影響身體正常生理功能之前就切除部分器官，是否操之過急，是否值得？
當然，各執己見的人都不能說服對方，這實際上也成為今天癌癥治療的一種選擇，提前進行治療。不過，現在還有一種更有遠見，也能從根本上去除致病基因的防治乳腺癌和卵巢癌的方法，即對胚胎或生殖細胞的致癌基因進行清除。顯而易見，這樣的方式更容易引發爭議。
現在，正在美國哈佛大學喬治?丘奇教授的實驗室中從事博士后研究的中國留學生楊璐菡等人進行的一項研究就是修改人類卵細胞遺傳基因，以便永久性地防治乳腺癌和卵巢癌。楊璐菡等人利用目前最好的基因編輯技術，在實驗室中修補卵巢細胞中導致乳腺癌和卵巢癌的BRAC1致癌基因。當這一基因被修正或清除，隨著卵巢細胞逐漸成長為卵細胞，其中的BRAC1基因也會被修改或清除。于是，以這樣的卵子孕育后代，以后就不會患乳腺癌和卵巢癌。
這一相關研究結果尚未公開發表。即便如此，楊璐菡等人的研究情況披露后也引起了爭論。因為，對于修改人類卵子、和胚胎的基因在許多國家都存在爭議，反對者認為，這些研究違背道德準則，在技術上也充滿不確定性，風險太大。
面對爭議，哈佛大學的丘奇教授強調說，楊璐菡等人在實驗室中所做的研究完全是嘗試性的。其中用到的卵巢細胞是在實驗室里培養的，根本沒有打算讓卵細胞受精，更別提將其移植到一位女性體內了。
顯然，修改卵子、和胚胎的基因目前還只是一種嘗試，但未來這種嘗試是否會成真呢？
修改動物胚胎的嘗試
同樣是利用基因編輯技術修改胚胎基因的研究也在嘗試之中，而且獲得了比較明顯的成功。這種研究體現在兩個方面：一是對動物胚胎進行修改，一是對人的胚胎進行修改。
云南中科靈長類生物醫學重點實驗室季維智、牛昱宇研究小組與南京醫科大學、南京大學、中科院動物研究所合作，利用基因編輯技術對獼猴的3個基因進行剪接：一個是調節代謝的基因Ppar-γ；一個是調節免疫功能的基因Rag1；另一個是調節干細胞和性別決定的基因。
研究人員是在180多個單細胞期猴胚胎中同時靶向編輯這3個基因。在對15個胚胎的基因組DNA進行測序后，發現其中有8個胚胎顯示出兩個靶基因（Ppar-γ和Rag1）同時突變的跡象。隨后研究人員把經過基因編輯的胚胎移植到代孕母猴體內，其中一個生出了一對孿生猴。檢測這對孿生猴的基因組后發現，猴子體內的兩個靶基因（Ppar-γ和Rag1）已經發生改變。
調節代謝的基因Ppar-γ和調節免疫功能的基因Rag1如果變異，將會產生種種生理變化或疾病，但需要等這種在胚胎期就修改了基因的猴子長大（3年）后才能證實，如此就意味著可以在胚胎期進行基因修改以預防疾病，比如修改可能引發帕金森病和囊性纖維變性的基因，以根治這些疾病。但是，這也僅僅是一種方向。
與此同時，美國馬薩諸塞州博德研究所的研究人員證實，可以利用基因編輯技術修改小鼠胚胎或卵子的基因，他們已經修改了小鼠胚胎干細胞中的5個基因，這同樣為在胚胎期根治疾病奠定了基礎。
由于這類研究是在動物身上進行的，因而倫理爭議較少。
修改人的胚胎
地中海貧血是一種遺傳病，同樣可以通過胚胎期的基因清除或修改來根治這類疾病，但是，目前這也只是一種嘗試，而且引發了巨大爭議。
地中海貧血又稱海洋性貧血和珠蛋白生成障礙性貧血，是一組遺傳性溶血性貧血。由于遺傳基因缺陷致使血紅蛋白中一種或一種以上珠蛋白鏈合成缺如或不足，從而導致貧血。由于基因缺陷的復雜性與多樣性，缺乏的珠蛋白鏈類型、數量及臨床癥狀變異性較大，因此地中海貧血分為α型、β型、δβ型和δ型4種，其中以β和α地中海貧血較為常見。
β地中海貧血（β珠蛋白生成障礙性貧血）在中國南方人群中比較常見，已知有100種以上的β基因突變，主要是由于基因的點突變，少數為基因缺失。現在，中國中山大學的黃軍就研究團隊試圖通過修改胚胎中的β珠蛋白基因來根治這種遺傳病。
研究人員利用基因編輯技術對86個人的廢棄胚胎進行了改造，48小時后，對71個存活胚胎的54個進行檢測發現，有28個胚胎的基因被切割，但是，只有4個胚胎包含設計的基因序列。這也意味著，只有4個胚胎被切除了導致β地中海貧血的基因。盡管這一技術尚不成熟，但這一研究表明，這是未來極有可能根除遺傳病的一種全新的方法。
然而，這種對人胚胎的修改引發了極大爭議，首先是黃軍就等人的研究論文被英國的《自然》和美國的《科學》雜志拒絕，理由是存在倫理爭議。后來，他們的研究論文在中國的期刊《蛋白質與細胞》上發表。后這一研究甚至招來批評。
可否修改人類胚胎或生殖細胞基因
利用基因編輯技術對胚胎或生殖細胞的基因進行修改不僅可以治療多種疾病，最主要的是治療遺傳病，同時，基因編輯技術也可以用在更多的基因修改上，例如，可以修改決定皮膚、肌肉、神經、骨骼和內臟等細胞的基因，以幫助研究和治療疾病，同時還可以修改控制人的身高、體重、膚色，甚至決定智商的基因，把人改造成超人。另外，改變了的基因也是可以遺傳的，這就必然會引發巨大的社會問題。
在黃軍就等人的研究發表后，美國國立衛生研究院（NIH）于2015年4月29日發表聲明，重申禁止開展涉及編輯人類胚胎基因的研究。該院院長弗朗西斯?柯林斯在聲明中闡述了美國國立衛生研究院一直秉持的反對資助此類研究的長期政策以及反對的倫理和法律理由。
基因編輯技術存在著很大風險，現在只是試驗性的技術，既不完全，也不完美，因此，這樣的技術可能傷害生命，不符合倫理原則。
現在，防止父母將遺傳性疾病傳遞給孩子并非只有基因編輯的方法，還可以采用更成熟的試管嬰兒技術，在體外培育胚胎，然后篩選掉含有缺陷基因的胚胎。因此，基因編輯不是讓生命變得美好和正常的唯一技術，也不是非用不可的技術。國際醫學科學組織理事會與世界衛生組織（WHO）頒布的《涉及人的生物醫學研究國際倫理準則》規定了涉及人的生物醫學研究需要遵守的21項準則（上期《換頭術可行嗎？》一文已對21項準則進行了詳細介紹，此處不再贅述）。
從這些倫理規定來看，目前的基因編輯技術用于修改生命還不算是非做不可和對病人唯一有利。因此，顯然不太符合倫理要求。黃軍就等人也認為，要對正常的胚胎進行編輯和修改，成功率必須接近100%。由于目前該方法還很不成熟，中山大學研究團隊也暫停了后續研究。
在法律上，美國1996年頒布的《迪基-韋克修正案》特別規定，禁止政府資助破壞人類胚胎或者為了研究目的培育人類胚胎的試驗。但是，后來的法律修正案允許開展胚胎干細胞的研究。而且，美國前總統布什在任期間一直禁止聯邦資金用于胚胎干細胞研究，但奧巴馬上臺后于2009年3月9日簽署行政命令，解除這一禁令。
即便法律修正案解除禁止政府資助人類胚胎研究的禁令，美國的法律措辭也是指，對無法存活的人類胚胎進行研究也在禁止資助之列，因為胚胎的定義是任何源自“受精、單性生殖、克隆或任何其他方式”的產物。所以，在法律上，美國對于研究人類胚胎存在模棱兩可的情況。
但是，英國對利用基因編輯技術修改人類胚胎或生殖細胞采取絕對禁止的態度，因為，管理者認為，這一技術用于治療可能產生倫理影響之外，還涉及其他因素，比如，只是為了讓孩子擁有某些優良的屬性可能會帶來嚴重后果。基因編輯技術只需對胚胎DNA進行較小的變動，就可以改變嬰兒眼睛的顏色，或使孩子變得更強壯等等，這就有可能產生不止是治療疾病的行動，而是讓人趨之若鶩地改變自己后代的基因，以求后代生長得比別人更為強大和聰明，這無疑是天才論在遺傳學中的實踐。
但是，丘奇教授不認為基因編輯技術不成熟，因為研究人員沒有使用最新的基因編輯技術，如果采用新的技術，黃軍就等人的基因修改會更為準確，他們遇到的嚴重脫靶問題將可避免。而且，丘奇教授認為，楊璐菡和黃軍就等人的研究目前雖然還不被人們廣泛接受，但他們的論文的某些方面內容最終會被人們接受。
關鍵詞：CRISPR/Cas9；基因敲除；Mindin
中圖分類號：Q7 文獻標識碼：A
CRISPR/Cas9是近年來從古細菌免疫系統中發展起來的一種新型高效的基因組編輯技術，利用人工設計的sgRNA介導外源表達的Cas9核酸酶與基因組靶點特異性結合從而實現對靶序列的特異性切割，進而誘導細胞通過非同源末端連接或同源重組方式來修復斷裂的DNA雙鏈[1-2]。非同源末端連接的修復效率高于同源重組的修復效率，但易形成錯配修復，從而在切割位點引入序列的缺失或插入，引發靶點基因編碼的蛋白發生移碼突變從而實現對靶點基因的敲除。當存在同源片段時，斷裂的DNA鏈可能發生同源重組修復，將外源片段整合到基因組中，從而實現基因的敲除、敲入及突變等[2-3]。
Mindin是一種高度保守的分泌性細胞外基質蛋白[4]，我們研究發現，Mindin是腸癌發病過程中重要的抑癌基因。由于前期對其功能研究的主要手段為RNA干擾技術，是在轉錄后水平降低蛋白的表達，其瞬時性和不徹底性會影響對其功能的深入研究。因此，我們迫切需要利用CRISPR/Cas9技術在基因水平上完全敲除Mindin基因并篩選出可穩定遺傳的細胞株，為進一步深入研究Mindin在腸癌發生與發展過程中的作用提供有力的細胞模型支持。
1 資料與方法
1.1一般資料 L929細胞株（小鼠成纖維細胞株）由廈門大學李勤喜教授實驗室饋贈；pUC57-sgRNA質粒載體（Addgene 51132）以及pST1374-Cas9-NLS表達質粒由上海科技大學黃行許教授饋贈；pBKS質粒由廈門大學林圣彩教授實驗室饋贈。sgRNA寡聚核苷酸鏈引物由廈門安特奧生物有限公司合成；單克隆引物由上海生工生物有限公司合成；質粒測序及單克隆菌液測序由廈門閩博生物有限公司完成。
1.2方法
1.2.1質粒構建 針對Mindin基因編碼序列設計三個sgRNA作用靶點，合成寡聚核苷酸鏈，序列如下：
F1：5’-TAGGactgtgcagggggccggaac-3’& R1：5’-AAACgttccggccccctgcacagt-3’
F2：5’-TAGGcctgccatccctagcggtac-3’& R2：5’-AAACgtaccgctagggatggcagg-3’
F3：5’-TAGGaagtctgcccggtaccgcta-3’& R3：5’-AAACtagcggtaccgggcagactt-3’
寡聚核苷酸序列5’端TAGG和AAAC堿基為pUC57-sgRNA質粒載體通用粘性末端。合成的寡聚核苷酸鏈利用PCR儀退火后連接入經Bsa I酶切的pUC57-sgRNA載體，構建sgRNA表達質粒。所得質粒通過測序檢驗連入片段的正確性。
1.2.2細胞的轉染與篩選 將測序正確的pUC57-sgRNA質粒載體連同pST1374-Cas9-NLS質粒載體利用電轉儀電轉入消化好的L929細胞中，待細胞貼壁生長后換液并加入殺稻瘟菌素（Blasticidin）進行篩選，即可獲得細胞庫。從細胞庫中提取基因組DNA，測序鑒定突變情況。
1.2.3單克隆的挑選與擴增 待對照組細胞全部死亡后，將實驗組細胞利用DMEM培養液進行梯度稀釋，分裝至96孔板中培養，10 d后，于顯微鏡下觀測各孔細胞生長情況，確定真正的單克隆細胞，進行后續培養分析。
1.2.4細胞基因組提取與鑒定 將待鑒定的細胞加入含蛋白酶K的DNA Digestion Buffer（Jackson Lab）中56℃消化過夜，利用酚氯仿抽提法提取細胞基因組DNA。利用單克隆引物TA-F1：5’-tgagtcttgccctgggcaga-3’&TA-R1：5’-agctactgtgccctccaaca-3’和TA-F2： 5’-atgcagtcaggcctttgca-3’& TA-R2：5’-acaggtccagactgtcgat-3’進行PCR擴增，所得DN段通過連接酶非依賴的克隆構建方法（Ligase independent clone，LIC）將其連入利用BamH I和Xho I酶切好的pBKS質粒載體中，挑選單克隆菌落進行測序分析。
2 結果
2.1 sgRNA的設計和打靶載體的構建 針對Mindin基因組中蛋白編碼序列，我們利用MIT張鋒教授實驗室提供的在線軟件分析了所有的可能sgRNA位點（PAM序列為NGG），從中挑選出三個評分最高的sgRNA位點，設計并合成寡聚核苷酸鏈。合成的寡聚核苷酸鏈利用PCR儀退火后連接入經Bsa I酶切的pUC57-sgRNA載體，構建sgRNA表達質粒。通過測序證實插入片段正確。
2.2 sgRNA效率的檢測 實驗組和對照組轉染完24 h后加入殺稻瘟菌素處理，待對照組細胞全部死亡后，將實驗組剩下的細胞繼續培養至24孔板中。利用酚氯仿抽提法提取細胞基因組進行PCR擴增并測序。三個sgRNA位點的突變情況，見表1，所有測序的克隆均發生不同程度的突變。
2.3 Mindin基因敲除單克隆細胞的獲得 根據細胞庫敲除的情況，我們挑選了sgRNA位點3的細胞庫進行單克隆分選。用培養基稀釋的細胞培養14天后，于顯微鏡下挑選正確的單克隆提取基因組DNA，利用單克隆測序引物TA1或TA2進行測序。其中所獲得的第23號單克隆缺少了10bp，是一株Mindin基因敲除并可穩定遺傳的細胞。而所獲得的第12號單克隆缺失了3bp，是一種不會改變后續閱讀框的突變，可以用于當作對照組細胞株，見圖1。
圖1 Mindin敲除的單克隆細胞基因組測序結果
3 討論
基因組編輯是研究基因功能以及進行基因治療的重要手段，人工核酸酶技術的出現為基因組編輯提供了強有力的工具。CRISPR/Cas9作為新一代的基因組編輯核酸酶技術，其對靶位點的識別依賴于sgRNA 5’端與靶位點DNA序列間的互補配對，針對不同靶點序列的sgRNA僅需替換識別位點處20bp的序列即可，應用時簡單易行，具有顯著的優勢，成為目前生命醫學領域的研究熱點。
真核生物基因組DNA具有復雜的高級結構，并且組蛋白上經常會發生各種修飾，故而尋找高效的sgRNA位點是確保CRISPR/Cas9系統有效工作的重要前提。為了探究如何獲得高效的sgRNA，在本研究工作中，我們挑選了腸癌抑制基因Mindin作為靶基因，利用已有的設計軟件，構建了針對Mindin基因的三條sgRNA，并將其導入鼠源L929細胞中，檢測sgRNA的效率。結果表明，所挑選的三條sgRNA都能高效的介導基因組編輯，細胞庫內測序的所有克隆都發生了突變，并且突變位點都位于sgRNA后NGG序列附近，證明了這三條sgRNA都可以介導Cas9蛋白高效切割Mindin基因靶序列。從細胞庫中分離得到的不同單克隆細胞株進一步證實了這種基因組編輯可以穩定遺傳的。由此，我們得到了一個穩定敲除Mindin基因的L929細胞株，為后續研究Mindin基因在腸癌發生與發展過程中的作用提供了必要的研究素材。此外，我們設計出的高效sgRNA位點也可用于Mindin基因敲除動物的制備，為其動物模型的建立打下堅實的基礎。
參考文獻：
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關鍵詞：反義RNA；RNA干擾；ZFN；TALEN；CRISPR-Cas系統
中圖分類號：Q78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）08-1405-08
DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2017.08.002
Research Progress on Loss of Gene Function Technologies
NING Hui-yua，b，LIU Caia，b，ZOU Hua-wena，b
（a.College of Agriculture；b.Hubei Collaborative Innovation Center for Grain Industry，Yangtze University，Jingzhou 434025，Hubei，China）
Abstract： Loss of gene function technology is one of the most important and efficient methods to study gene function at present. Now main widely used loss of gene function technologies are anti-sense RNA， RNA interference，ZFN，TALEN，CRISPR-Cas nucleases technology and so on. Those technologies aim to inhibiting or turning off the expression of the target gene， researching the change of the biological phenotype， and thus their related functions were speculated. In the practical studies， loss of gene function is always along with gene overexpression， providing the most direct evidence for gene function research， which was widely used in biology， medicine， agriculture and other fields. This paper systematically introduces the developing history， technological principles and application of some common loss of gene function technologies， and the protest of their future research and application is introduced.
Key words： anti-sense RNA； RNA interference； ZFN； TALEN； CRISPR-Cas nucleases
20世o50年代DNA雙螺旋結構的發現，標志著人們對生命科學的研究進入了分子生物學時代。隨著后基因組時代的到來，基因組學的研究重心從揭示生命的所有遺傳信息結構、組成等轉移到對功能的研究上。除了傳統的轉基因（基因過量表達）外，定向抑制或完全消除特定基因的表達也是目前研究基因生物學功能的重要手段。因此，出現了反義RNA、RNA干擾等技術。隨著研究技術手段的發展，近年來又興起了ZFN技術、TALEN技術、CRISPR-Cas系統等基因功能修飾技術。這些技術不斷被發現及應用，極大地促進了生物學研究的發展。本研究主要對基因功能缺失技術發展歷程、技術原理及應用等方面進行概述。
1 反義RNA技術
反義RNA是指與靶RNA（多為mRNA）具有互補序列的RNA分子，它通過與靶RNA進行堿基互補配對的結合方式影響mRNA的后續翻譯過程。反義RNA最早在原核生物E.coli的產腸桿菌素的Col E1質粒中發現[1]。隨后發現在真核生物中也存在天然的反義RNA，特別是發現了人工構建的反義寡核苷酸在真核生物中具有生物學效應以來，反義RNA技術已成為一種直接有效的人為控制基因表達的方法，并且倍受生物學界關注。
1.1 反義RNA作用機理
反義RNA主要通過與靶RNA以堿基互補配對的方式結合，參與基因表達調控。其作用機理為：①在DNA復制水平上。反義RNA通過與DNA復制時的起始引物RNA結合，阻止RNA引物與模板DNA的結合，抑制DNA的復制。②在轉錄水平上。反義RNA可以直接與mRNA5′端互補，阻止轉錄。③在翻譯水平上。反義RNA通過與mRNA上的特定序列互補配對而結合。結合位置包括起始密碼子AUG、靶mRNA的非編碼區、原核生物的SD序列以及真核生物的mRNA5′端，從而直接或間接地抑制mRNA的翻譯[2]。
1.2 反義RNA技術的應用
目前，反義RNA技術作為一種重要的基因調控手段，在植物、病毒、細菌中得到廣泛應用。在植物中最顯著的應用是果實成熟的控制。科學家通過控制乙烯合成途徑中的關鍵酶來限制乙烯的合成，從而達到控制果實成熟的目的[3]。Oeller等[4]利用反義RNA技術抑制ACC合成酶的活性，使果實內的乙烯含量被抑制了99.5%。這為果實的貯藏、加工、運輸等提供了新方法。
反義RNA技術在植物抗病方面也得到了很好的應用。植物病毒是影響植物生長的重要因素之一。由于DNA病毒和RNA病毒在復制和表達的過程中都要經歷RNA生物合成階段，這為利用反義RNA技術進行抗病毒研究提供了理論依據。Nelson等[5]利用TMV 5′端的基因片段作為目的基因，成功構建了反義基因并獲得了表達反義基因的轉基因煙草植株。試驗結果表明，病毒RNA和后代病毒的合成被抑制了25～50倍，病毒侵染癥狀大量減少甚至消失，并且該抗病毒性狀可穩定遺傳。
由于抗生素的濫用，細菌的耐藥性越來越強。為了能夠快速、簡便獲得新的抗菌藥物，反義RNA技術被應用到藥物篩選模型上。2006年科學家在金黃色葡萄球菌體內誘導表達出了針對單功能脂肪酸合成酶FabF的反義RNA，并構建了反義工程菌。研究發現，構建的反義工程菌對FabF（Fatty acidbiosynthesis geneF）的特異性抑制劑非常敏感，通過藥物篩選獲得了能夠有效抑制MRSA（Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus）和VRE（Vancomycin-Resistant Enterococci）的新型抗生素平板霉素[6]。因此，可利用反義RNA技術尋找新型抗生素解決細菌耐藥性的問題。
1.3 反義RNA技術的優缺點
隨著研究的不斷深入，人們對反義RNA技術也有了比較成熟的認識。與傳統的基因敲除技術相比，反義RNA技術具有許多的優越性。①反義RNA技術操作較簡單，適用范圍廣泛。通過靶mRNA的序列就可以合成所需的反義RNA，可用多個反義RNA同時阻斷多個基因的表達。②特異性強[7]。反義RNA技術可以有選擇性的迅速抑制目的基因的表達。該技術不會對蛋白質產生完全抑制，從而能避免致死突變，對細胞的正常生長影響較小。③安全性高[8]。導入細胞的反義RNA不能被翻譯產生蛋白質，因此該技術在基因工程上的應用具有很大的安全性。
眾多的因素限制了反義RNA的發展。主要包括：①成本較高。②靶基因定位困難。由于高等生物的基因組復雜，對特殊基因的靶向定位很困難。③使用效率問題。反義RNA的堿基序列、含量、靶序列結合部位和濃度等都會影響其使用效率[9]。
2 RNA干擾技術
RNA干擾（RNA interference，RNAi）是指與靶mRNA存在同源互補序列的雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）在細胞內特異性地降解靶mRNA的一種基因轉錄后沉默現象[10]。這一現象在自然界中廣泛存在，是生物體在進化過程中形成的一種進化上保守的用來抵御外來基因或外來病毒侵犯的防御機制。
1990年Napoli等[11]將查爾酮合成酶CHS基因轉入到牽牛花中，試圖獲得開出深紫色花朵的牽牛花，結果卻得到了白色和斑片狀花朵，即轉入的CHS基因和與該基因同源的色素基因的表達均受到抑制，將這種現象稱為轉錄后基因沉默 （Post-transcriptional gene silencing）或者共抑制（Co-suppression）。1994年Cogoni等[12]分別將外源基因albino-1和albino-3轉入粗糙脈孢菌（Neurospora）中，也出現了與植物共抑制相同的轉錄后基因沉默現象，將其稱為基因壓制（Gene quelling）現象。1995年Guo等[13]發現將秀麗新小桿線蟲（Caenorhabditis elegans）par-1基因的正義鏈RNA和反義鏈RNA分別注射到線蟲體內均會抑制par-1基因的表達，但當時的理論無法解釋這一現象。直到1998年Fire等[10]才解釋了這一現象，即RNAi是由于dsRNA引起的轉錄后序列特異性基因沉默，并將其命名為基因沉默（Gene silencing）。
2.1 RNA干_作用機理
RNA干擾作用機理可分為3個過程：siRNA的形成、靶mRNA的降解、RNAi的形成。①siRNA的形成[14]。細胞質中的內源性或外源性的長dsRNA首先與Dicer酶結合，形成Dicer-dsRNA復合物，在Dicer酶的RNase的作用下，長dsRNA被特異性地裂解為21～23 nt siRNA。其5′端為磷酸基，3′端為羥基且含有2個突出的黏性末端。②靶mRNA的降解。siRNA在解旋酶的作用下解鏈，形成正義鏈和反義鏈，其中的反義鏈可指導形成RNA誘導的沉默復合體（RISC）[15]。在siRNA的引導下，RISC通過堿基互補配對的方式識別具有同源序列的靶mRNA并進行剪切，其剪切位點為與siRNA反義鏈互補的第1個核苷酸下游的11或12個核苷酸處，然后降解靶mRNA。③RNAi的形成。在RNA依賴性RNA聚合酶（RdRP）的作用下，以靶mRNA為模板，siRNA為引物，合成dsRNA。合成的dsRNA在Diser酶的作用下，又產生新的siRNA，如此循環多次，可以使RNAi的作用進一步放大。因此，少量的siRNA可以產生高效的基因沉默效應[16]。研究還發現siRNA除了能導致轉錄后基因沉默，還可指導DNA甲基化酶與DNA的特定部位結合，引發該特定部位DNA中的胞嘧啶甲基化，導致轉錄水平的基因沉默[17]。
2.2 RNA干擾技術的應用
雖然人們對RNA干擾的研究只有短短的十幾年時間，但發展卻極為迅速，在生物醫學等領域得到廣泛應用。①疾病治療上的應用。RNA干擾作為一種基因敲除技術，在腫瘤、病毒感染、遺傳病治療方面得到了廣泛應用。An等[18]利用RNA干擾技術構建了卵巢癌OVCAR3細胞IGF-IR基因的siRNA表達質粒，通過脂質體法轉染到人的卵巢癌OVCAR3細胞中，研究發現IGF-IR基因的siRNA能顯著抑制其mRNA及蛋白質的表達，并且還能抑制OVCAR3細胞的增殖。RNA干擾技術為疾病在基因領域的治療提供了新方法。②作為基因研究的新工具。由于RNA干擾能特異性的抑制目的基因的表達，根據其表型等的改變可以分析基因的功能，因此是研究基因功能的一種有效的手段[19]。Yu等[20]通過構建cyclin D1基因的siRNA表達質粒，研究cyclin D1基因對疤痕疙瘩成纖維細胞的細胞增殖和細胞周期的變化。③RNA干擾技術還被廣泛應用于信號傳導通路的研究。通過和傳統的缺失突變技術結合，RNA干擾技術可以很容易確定復雜信號傳導途徑中不同基因的上下游關系[21]。Jin等[22]利用RNAi技術發現argonaute-1在FMRP參與神經元發育和突觸生長過程中起重要作用，證明FMRP能調節信號通路。④藥物的開發與應用。RNA干擾可作為尋找和鑒定新藥物靶標的工具。利用RNA干擾技術可以明顯縮短從鑒定到認識藥物靶基因功能的時間，有助于藥物開發過程中對已知靶基因功能的高通量分析[23]。Duff等[24]利用RNA干擾技術能降低蛋白轉移酶9（PCSK9）的表達量，研究發現PCSK9表達量的降低能明顯降低小鼠血清膽固醇水平，說明沉默PCSK9可成為治療高膽固醇的藥物靶點。
2.3 RNA干擾技術的優缺點
RNA干擾技術具有以下特點：①高效性。RNAi存在級聯放大效應。siRNA在Diser酶的作用下，以靶mRNA為模板可以產生新的siRNA，如此循環多次，可以使RNA干擾的作用進一步放大。因此，少量的siRNA可以產生高效的基因沉默效應。②特異性。siRNA與靶mRNA通過堿基互補配對原則進行結合，只特異性的誘導靶mRNA的降解。研究表明，即使是一個堿基的錯配，也會影響靶mRNA沉默效率[25]。對mRNA前體幾乎沒有影響，以內含子或啟動子構成的dsRNA也不產生RNA干擾現象。③可傳播和可遺傳性。RNA干擾效應可以在不同細胞間進行傳遞，并且可以傳遞到下一代。Fire等[10]通過將dsRNA注射到線蟲體內，發現dsRNA可以擴散到其他細胞中，并且在下一代也表現出了RNA干擾現象。
目前，對RNA干擾的研究仍處于初級階段，還有許多問題亟待解決。主要包括：①存在脫靶現象。siRNA可以引起一些非靶基因的非特異性沉默或表達上調，抑制細胞的正常生長。②穩定性差。siRNA導入受體細胞后RNA干擾效應持續數天后便會消失。③載體的安全性問題。在臨床應用上，載體作為外來抗原可激活機體的免疫應答，使載體失活，甚至可能對機體造成嚴重的不良后果[26]。
3 鋅指核酸酶（ZFN）技術
1983年，鋅指蛋白（Zinc finger protein，ZFP）首次在非洲蛙蟾轉錄因子IIIA中被發現。隨著研究的不斷深入，人們對ZFP有了進一步的了解。1996年Kim等[27]將鋅指結構域與IIs型限制性核酸內切酶FokⅠ的切割結構域融合，獲得了具有識別特性的人工合成的核酸內切酶。隨后，Bibikova等[28]利用ZFN技術對爪蟾的卵母細胞開展外源DNA修復試驗，并取得成功。Bibikova等[29]又利用ZFN技術成功敲除了果蠅的一個內源基因。ZFN技術的應用實現了對基因的高效定點修飾，對研究基因的功能具有重要意義。
3.1 ZFN的結構及作用機理
ZFN是由鋅指蛋白（ZFP）結構域和核酸內切酶（FokⅠ）的切割結構域兩部分組成[27]。ZFP結構域主要負責識別并特異結合靶DNA序列。FokⅠ的切割結構域主要負責切割靶DNA。
ZFP結構域一般是由3～6個Cys2-His2型的鋅指結構域串聯組成，多個鋅指結構的串聯不僅可識別較長的靶DNA序列，還可以增加其修飾的特異性。每個鋅指折疊成α-β-β（C端-N端）型的二級結構[30]，其中的α螺旋可插入到DNA雙螺旋的大溝，α螺旋中的-1～+6位的7個氨基酸殘基（+4位通常為亮氨酸殘基）決定了對靶DNA識別的特異性[31]。每個鋅指蛋白可識別并結合一個三聯體密碼（圖1a）[32]。
FokⅠ是海床黃桿菌（Flavobacterium okeanokoites）表達的一種限制性內切酶，通過與ZFP的C端融合形成ZFN單體。FokⅠ的切割結構域必須形成二聚體才能發揮內切酶活性[33]。因此，在切割靶位點時，2個ZFN單體按照一定的距離和方向同各自的靶DNA鏈特異結合，2個FokⅠ切割結構域恰好可形成有活性的二聚體，在2個結合位點的間隔區（Spacer，通常為5～7 bp）切割DNA產生DSB切口。細胞再通過非同源性末端接合（NHEJ）或同源重組（HR）等方式對基因進行修復，改變靶DNA序列，從而達到基因敲除的目的[34]（圖1b）。構建能特異性識別靶DNA的ZFP結構域是ZFN技術的關鍵。因此，只需根據目的基因設計出鋅指結構域，再與FokⅠ融合形成ZFNs。然后將融合的ZFNs通^電穿孔、轉染及病毒運輸等方式導入細胞核中完成對靶基因敲除。
3.2 ZFN技術的應用
ZFN作為一種靶向修飾技術，可以精確地修飾基因及其周圍調控元件，在生物體基因組改造與基因功能研究等方面得到廣泛應用。ZFN已經成功應用于線蟲、大鼠、小鼠、中國倉鼠、果蠅、海膽、斑馬魚、家蠶、植物、豬及人類iPS細胞和ES細胞中[35]。主要包括以下兩方面：①對動植物基因組的靶向修飾。Bibikova等[29]利用ZFN技術對果蠅X性染色體的yellow基因進行定點修飾，結果發現50%的雄性果蠅發生顏色的改變。Zhang等[36]設計了針對敲除擬南芥ADH1和TT4基因的ZFN，通過雌激素誘導啟動子表達，研究發現T1代分別有7%和16%的植物含有體細胞突變，并且能穩定遺傳給后代。②疾病的治療。Li等[37]利用ZFN技術治愈了血友病B型小鼠，這為以后利用ZFN技術治療基因疾病提供了新的有效手段。
3.3 ZFN技術的優缺點
ZFN作為第一代人工核酸內切酶技術，打破了只能通過同源重組的方式對基因組進行改造的觀念。ZFN技術的優點包括：①與傳統的方法相比較，ZFN技術提高了基因組的編輯效率，操作簡單，可以快速敲除目的基因。②能夠廣泛地應用于各種生物，并誘導靶位點進行定點突變。
ZFN技術也存在著許多的局限性：①存在脫靶現象。由于ZFN對靶位點進行切割時容易脫靶，導致細胞代謝紊亂，從而對細胞產生毒副作用。②存在上下文依賴效應[38]。ZFN在識別靶DNA位點時，識別靶DNA的重復氨基酸之間會相互作用，導致識別的特異性發生改變，即識別靶DNA的特異性不高，影響基因打靶的效果。③成本高。由于ZFN的特異性不高，很難設計出高特異性的鋅指組合，目前該技術一直被生物公司壟斷。
4 轉錄激活子樣效應物核酸酶（TALEN）技術
1989年一類可以使植物患病的轉錄激活子樣效應蛋白TALE（Transcription activator-like effector）在黃單胞桿菌（Xanthomonas）中分離得到[39]。2007年Kay等[40]發現一種TALE蛋白（AvrBs3）可以被黃單胞桿菌注入到宿主細胞內，然后進入宿主細胞核，與宿主upa20基因的啟動子結合，激活宿主upa20基因的表達。2009年Moscou等[41]發現了TALE蛋白特異結合宿主基因啟動子的機制。隨著對TALE蛋白的深入了解，科學家發現TALE蛋白可以補足第一代人工合成的核酸內切酶（ZFN）技術的許多缺陷。2010年Christian等[42]首次報道了人工構建的TALEN技術。2011年Li等[43]用AvrXa7和PthXo1中天然存在的TALE重復序列進行了類似的試驗，發現FokⅠ結構域連接到TALE結構域的C端的切割效果好于連接到N端。2012年Deng等[44]通過解析TALE蛋白的晶體結構，清晰揭示了TALE蛋白結合DNA的作用機制，為以后更好改造和應用TALEN打下了基礎。
4.1 TALEN的結構及作用機理
TALEN是由TALE結構域和核酸內切酶（FokⅠ）的切割結構域兩部分組成[45]。與ZFN技術原理類似，TALE結構域主要負責識別并特異結合靶DNA序列，FokⅠ的切割結構域主要負責切割靶DNA。
TALE蛋白是由N端的具有分泌信號功能的易位結構域（Translocation domain，TD）、中部DNA特異識別結合域、C端核定位信號（Nuclear localization signal，NLS）和轉錄激活結構域（Activation domain，AD）4部分構成。其中，中部DNA特異識別結合域是由一系列數目不定的串聯重復單元組成。每個重復單元通常由34個氨基酸組成[46]，其中32個氨基酸是高度保守的，只有12位和13位上的氨基酸是可變化的，這2個氨基酸又被稱為重復可變雙殘基（Repeat variable diresidue，RVD）。每個重復單元只識別1個核苷酸，其識別的特異性由RVD決定，并且RVD可與4種堿基有特定的配對關系，即NI特異識別A，HD特異識別C，NG特異識別T，NH特異識別G，NN對應G或A[41，46]。研究發現，第12位氨基酸主要起穩定RVD環的功能，第13位氨基酸是真正識別特異堿基的氨基酸，決定識別的特異性[44，47]（圖2a）。
FokⅠ與TALE的C端融合形成TALEN。對靶DNA進行切割時，FokⅠ也需要形成二聚體發揮切割作用，當兩個TALEN分別結合到各自的靶DNA序列上時，2個FokⅠ會在靶DNA序列的間隔區（Spacer，14～18 bp）處形成二聚體[48]，并對靶DNA進行切割，形成DSB切口，進而引發細胞內的NHEJ和HR修復機制，導致基因沉默（圖2b）。總之，通過構建不同的TALE就可實現對不同靶DNA的切割。
4.2 TALEN技術的應用
TALEN技術的發明使得基因組編輯效率明顯提高，因此，在人、小鼠、大鼠、斑馬魚、水稻、擬南芥等物種中得到廣泛應用。①遺傳病治療方面的應用。科研人員利用TALEN技術對來源β-地中海貧血病人的非整合型iPSCs進行珠蛋白基因HBB修復，研究發現細胞在修復過程中沒有產生TALEN引發的脫靶突變并且這些修復好的iPSCs具有多能性及正常核型，表明這種方法可作為一種治療地中海貧血疾病的有效途徑[50]。②生物模型的構建。2014年中國科學家利用TALEN技術成功的敲除了食蟹猴基因。首次用該技術成功構建了非人類靈長類動物模型[51]。③新品種的培育。Li等[52]利用TALEN技術剔除掉了水稻基因組中對水稻白葉枯病敏感基因Os11N3，獲得了穩定遺傳的抗病水稻新品種。這也顯示出了TALEN技術介導的基因定點修飾在作物遺傳育種中具有廣闊的應用前景。
4.3 TALEN技術的優缺點
作為第二代人工合成的核酸內切酶技術，與ZFN技術相比，TALEN技術具有明顯的優勢。①與ZFN技術相比，TALEN篩選更為簡便，它不需要復雜的篩選過程，只需要簡單的分子克隆技術就可以獲得高效的TALEN。②脫靶現象減少，降低了對細胞的毒性。③切割位點的特異性強。
TALEN技術雖然有很多優點，但也存在許多不足。主要包括：①TALE蛋白較大，并且序列重復性很強，構建表達載體較為復雜[53]。一般由生物公司合成，r格較貴。②仍然存在脫靶現象。③一對TALEN只能對一個靶基因進行修飾。當對多個基因同時進行編輯時，需要共轉染多個TALEN載體，這樣會導致轉染效率下降，很難獲得所需的陽性細胞[54]。
5 CRISPR-Cas核酸酶（CRISPR-Cas RGNs）技術
1987年Ishino等[55]首先在大腸桿菌的堿性磷酸酶基因下游發現了成簇的短間隔重復序列，但該序列當時沒有引起人們的足夠重視。隨著研究的不斷深入，發現大約40%的細菌和90%的古生菌都存在這種成簇的短間隔重復序列。2002年這種成簇的短間隔重復序列被命名為串聯間隔短回文重復序列[56，57]（Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，CRISPR）。此外，在CRISPR位點附近還存在著多個與CRISPR相關的Cas（CRISPR-associated genes）基因。隨后的研究又發現，CRISPR中的間隔序列與質粒或噬菌體等外源DNA序列高度同源。當病毒入侵宿主細胞時，細菌和古細菌中的CRISPR序列就能夠引導CRISPR相關（CRISPR-associated，Cas）蛋白使外源DNA降解，從而起到免疫保護的作用[58]。
5.1 CRISPR-Cas系統的結構及作用機理
CRISPR-Cas系統主要是由CRISPR序列元件和Cas基因家族蛋白組成[59]。目前，CRISPR-Cas系統一般被分為3種類型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。Ⅰ型和Ⅲ型系統在介導靶DNA雙鏈降解時需要多種Cas蛋白的參與，而Ⅱ型CRISPR-Cas系統只需要Cas9就可完成對靶DNA雙鏈的切割[60]。通過比較，Ⅱ型CRISPR-Cas系統更為簡便，更適合應用于基因編輯。目前，CRISPR-Cas技術主要是Cas9系統的應用，本研究將對CRISPR-Cas9系統進行闡述。
CRISPR序列元件主要是由一個前導序列（Leader）、多個重復序列（Repeats）及多個間隔序列（Spacers）組成，其中重復序列和間隔序列以相互交替的方式連接（圖3）。前導序列是一段富含AT，長度為550 bp的不保守序列，位于CRISPR的上游，可啟動CRISPR序列轉錄；重復序列是一組長度為23～50 bp，平均長度為31 bp的高度保守的短小序列；間隔序列為來源于噬菌體、質粒等的平均長度為36 bp的外源基因片段即原間隔序列（Protospacers）[61]。Cas9是一個多結構域蛋白，主要由α-螺旋組成的識別區（REC）、位于蛋白中間位置的HNH核酸酶結構域、 位于氨基末端的RuvC-like結構域以及位于C端的PAM結合區組成[62]。
CRISPR-Cas9系統[63]的作用機理可分為3個階段：①可變間隔序列的獲得[64]。CRISPR-Cas9系統能夠識別外源核酸中的特殊片段，該特殊片段中存在原型間隔序列毗鄰基序（Protospacer-associated motif，PAM），并將PAM旁的原型間隔序列加工整合入自身基因組中的CRISPR序列中。②crRNA（CRISPR-derived RNA）的形成[60]。在前導序列的啟動下CRISPR轉錄產生前體CRISPR RNA（pre-CRISPR RNA，pre-crRNA），隨后CRISPR轉錄產生的tracrRNA（trans- activating crRNA）與pre-crRNA形成RNA異二聚體，在Cas蛋白的作用下，pre-crRNA被加工成crRNA。③對外源DNA的切割[64]。成熟的crRNA、tracrRNA及Cas9結合形成一個三元的沉默復合物。而后在crRNA的引導下由Cas9蛋白對目的基因進行切割。在切割時Cas9蛋白的HNH能夠特異性識別與crRNA互補配對的模板鏈并對其切割，切割位點位于PAM上游3 nt處；RuvC-1ike參與另一條鏈特定位點的切割，切割位點位于PAM上游3～8 nt處（NGG位點）[65]。Cas9蛋白對外源DNA進行切割后也會產生DSB切口，并通過NHEJ和HR的方式進行修復[66]（圖4）。因此，通過設計不同的crRNA可以使CRISPR-Cas9剪切不同的DNA序列。Jinek等[67]將成熟的crRNA和tracrRNA這兩種RNA構建成一個向導RNA（single-guide RNA，sgRNA）與Cas9融合，發現由sgRNA和Cas9蛋白構成的新CRISPR-Cas系統仍可對目的基因進行切割。所以，可將CRISPR-Cas9系統簡化成Cas9蛋白與sgRNA。
5.2 CRISPR-Cas系統的應用
目前，CRISPR-Cas系統的應用仍處在初級階段，但在基因功能的研究、模式生物的構建、遺傳育種等方面得到廣泛應用。①在基因功能研究中的應用。與傳統的基因敲除技術相比，CRISPR-Cas系統能夠對多種細胞及生物體的目的基因進行高效快速的敲除，是研究基因功能的重要工具。Shalem等[68]構建了一個含有65 000種sgRNA的文庫，這些sgRNA可以靶向人類基因組中18 080種基因，幾乎涵蓋了每個已知的基因。并將編碼這些sgRNA的基因和編碼Cas9蛋白的基因一起轉運到人類細胞中，從而篩選出具有特定功能的基因。②動物模型的構建。2013年Wang等[69]在小鼠的胚胎干細胞中使用CRISPR-Cas9系統，對Tet1、Tet2、Tet3、Sry和Uty-8這5個基因進行同時編輯，產生了基因敲除新個體。這為研究基因家族成員的功能相關性提供新方法。③新品種的改良與培育方面的應用。Shan等[70]利用CRISPR-Cas9技術去掉了一個小麥基因，得到了耐白粉病的小麥新品種。還利用CRISPR-Cas9技術定點突變了水稻和小麥兩種作物的OsPDS和TaMLO基因，發現原生質體中基因突變效率為14.5%～38.0%，水稻轉基因植物中突變效率4.0%～9.4%，并且在T0代獲得了水稻純合PDS突變體，呈現預期的白化和矮小表型。
5.3 CRISPR-Cas系統的優缺點
作為第三代人工合成的核酸酶，與ZFN技術和TALEN技術相比具有明顯的優勢。主要表現在：①CRISPR-Cas系統的切割能力更強。CRISPR-Cas系統可以切割一些ZFN和TALEN不能接近的位點[71]。②操作更為簡便，試驗周期更短，成本更低。突變不同的靶位點只需設計與靶位點互補的sgRNA，然后將sgRNA克隆到表達質粒上即可。③CRISPR-Cas系統可以同時對多個靶基因進行定點修飾，因此大大提高了修飾效率。
CRISPR-Cas系統的應用仍處于初級階段，存在許多不足：①5′-GN19NGG-3′的結構有時會出現限制性，會對靶位點以外的序列進行編輯，產生多余的DNA突變[72]。②CRISPR-Cas系統識別靶序列的長度較短，不能根據需求進行調節。③仍存在脫靶現象。
6 展望
基因功能缺失技術已經在生物學各個領域得到廣泛應用，成為了研究基因的主要方法。隨著基因功能缺失技術的不斷更新，已從反義RNA技術發展到了CRISPR-Cas技術，并且其應用范圍越來越廣泛，對目的基因的編輯效率越來越高，操作越來越簡便。目前基因功能缺失技g仍存在許多不足，限制了其發展。隨著研究的不斷深入與發展，基因功能缺失技術必將得到不斷改進和完善，也一定會對基因功能方面的研究做出更大的貢獻。
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中國的情況更為嚴重。
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對于大多數需要器官移植的患者來說，最糟的不是病情越來越重甚至死亡，而是漫長的等待。
科學家們試圖打通一條解決器官供體短缺的道路――異種移植，即從動物身上獲取健康的器官、組織或細胞，將其移植到患者體內發揮功能。以動物為供體的器官移植，需邁過三道坎，即生理功能、人體排異反應和動物自身攜帶的病毒風險。
最理想的技術路徑有兩條，通過基因工程方法改造動物器官，或者在動物體內培育人體器官（即人源化）。后者相當于人自己的器官，排異反應更小，更符合人的生理功能。然而，后者所涉倫理問題更嚴于前者，全球多數實驗室還僅處于理論證明階段。而前者已經積累了大量的研究案例，距離應用更近。
豬是生理指標和人體最接近的動物之一，且實驗成本較低，所以全球大批實驗室都選用豬作為實驗供體。近期，美國哈佛大學和生物技術公司eGenesis的聯合研究團隊在《科學》上發表了一項成果，利用基因組編輯技術，敲除了豬基因組中可能有害的病毒基因。
這傳達出一個信息，一批站在前沿的研究團隊正在努力啟動異種移植的臨床研究，將給全世界急需器官移植的患者點亮希望。 最艱難的一步
排斥反應，不僅是器官移植的最大障礙，更是異種器官移植的珠穆朗瑪峰。
世界上第一例異種移植手術發生于1905年。當時，法國醫生布蘭斯多（Princeteau）將家兔的腎臟移植給一個腎衰竭的兒童，術后移植腎排尿良好。但16天后，患兒死于肺部感染。
此后，法、德、美等國的研究者先后加入到異種移植器官研究中，試驗對象包括兔、狗、羊、猴等物種。
將豬的心瓣膜等組織用于人體治療已有數十年歷史。但這些移植物大多為處理后的結構組織支架，原有的豬細胞被去除。真正的異種器官移植，是提供有活力的豬器官和細胞，在臨床移植到人體后，它們能繼續保持生理功能，且能克服免疫排斥反應。
最著名的異種器官移植案例發生在美國南加利福尼亞州。1984年10月，女嬰費伊誕生。不幸的是，她的心臟存在缺陷，供血能力不足，只能維持幾周生命。為了拯救費伊，醫生將一顆七個月大的狒狒的心臟移植入她的胸膛。遺憾的是，費伊在21天后死于排斥反應。
異種器官移植的免疫排斥反應非常復雜，會發生超急性排斥反應、急性血管排斥反應、急（慢）性細胞性排斥反應等。最為兇險的超急性排斥反應，源自豬體內物質半乳糖分子（α-GAL）與人體體內抗體和補體聯合產生的劇烈排斥反應。一旦發生，被移植的豬器官往往會在幾分鐘至數小時內，出現血栓、水腫等現象，并最終壞死。
近兩年大熱的基因組編輯技術解決了這個問題，直接、徹底地敲除豬基因組中的α-GT基因，使得被移植的豬器官中不含α-GAL。異種移植最大的突破就是通過基因組編輯，提高了豬組織移植后的免疫保護，降低了免疫排斥。
豬的基因組包含30億個堿基對，基因修改就像打靶一樣。江蘇省異種移植重點實驗室主任、南京醫科大學特聘教授戴一凡對《財經》記者說：“利用這個技術做免疫排除研究，比傳統手段要快很多。”
基因操作已經在幾代動物中證實穩定。目前基本上不受超急性、急性細胞性排斥反應的限制，但其他問題仍突出，如移植體內會發生血栓性微血管病或受體內發生系統性消耗性凝血病，這有待進一步的研究去解決。 剪除病毒
其實，在動物實驗中，科學家們首先想到的是人類的近親靈長目動物，猴子、狒狒、猩猩等作為器官提供者似乎順理成章。很快，他們發現靈長目動物每胎產仔少，成熟周期長，不夠用，實驗成本高。
更要命的是，靈長目動物體內可能攜帶危險的病毒。
北京大學醫學部實驗動物科學部主任鄭振輝告訴《財經》記者，一個物種的進化程度越接近于人類，其傳播疾病的危險就越大。像艾滋病就是靈長目動物傳給人的。基于倫理和安全考慮，靈長目動物被禁止作為異種器官移植的供體。于是，科學家的聚光燈逐漸集中到豬的身上。
豬具有多重優勢，其器官與人體器官形狀、大小相似，生理性質相近，而且繁殖能力強，生長周期短。
在20世紀90年代初，豬的神經元細胞被植入帕金森病人的大腦，至今這些被治愈的患者中還有人在健康地生活，沒有帕金森的癥狀。
但好景不長，科學家在豬的基因組中發現了內源性逆轉錄病毒（PERV）。其傳播途徑是通過遺傳，而不是豬與豬之間的接觸。所有的豬都含有PERV，這對豬本身無害，但令人擔憂的是，當進行以豬為供體的異種移植時，PERV會不會從豬的基因組“跳”到人的基因組中，成為一種新的異種病毒在人群中傳播？相關研究也不能給出確定性答案。實驗表明，在接受過豬器官移植的小鼠體內發現了PERV的感染，但在狒狒體內又沒有發現類似情況。
“國外過去20年一直在研究，國外有些實驗室收集了幾百例豬細胞移植案例病人的血樣，實驗發現沒有病毒傳播，可以基本得出結論這個病毒不重要，對患者沒有危害。”戴一凡說。
不過，也有研究者建議對異種移植持謹慎態度，畢竟病毒感染有潛伏期和體內突變的可能性。
中國社會科學院研究員、生命倫理學家邱仁宗告訴《財經》記者，“首先應該用動物實驗證明安全有效，并經過專家鑒定，確認動物實驗有效度，才可能考慮制訂臨床試驗的計劃，臨床試驗首先應在沒有人器官來源，不移植就要死亡的病例上做，并事先征得病人同意。”
2005年4月，世界衛生組織（WHO）在日內瓦異種移植咨詢性磋商會的聲明稱，迄今為止，沒有跡象顯示利用諸如豬類的其他動物進行的異體移植發生感染的情況。然而，異體移植具有在某時發生這類疾病的潛在危險。
基因組編輯技術或許能敲除豬基因組中可能有害的病毒基因。“我們在過去的一年內，證明了技術上的可能性。”哈佛大學醫學院遺傳學系博士后楊璐菡告訴《財經》記者。
楊璐菡的團隊掌握了一把“剪刀”――CRISPR技術。作為基因組編輯三大利器之一，CRISPR技術2012年由加州和歐洲的科學家共同發現，并在短期內迅速強大。在不到兩年時間里，CRISPR技術從一個不太確定有用的想法，變成一項幾乎所有生物學畢業生都要掌握的技能，并被寄希望可能獲得諾貝爾獎。
此前，大多數的基因組改造都是一個基因層面的修改，不能實現多個基因的敲除、插入。CRISPR技術使一切變得簡單而高效，能同時作用于多個靶位點。
楊璐菡團隊利用CRISPR-Cas9將豬細胞中的62個PERV基因拷貝進行修改，并且保持了基因組的完整性。之前這一技術的最高紀錄也就是一次改造6個基因拷貝。要打靶62個基因，意味著要將打靶的效率提高近兩個數量級;而且還必須打得準，不能把別的地方給破壞了，否則會影響豬的生長發育或帶來其他不可預測的風險。2015年10月11日《科學》網站刊登了這一研究結果。 臨床實驗還有多遠
許多發達國家政府和大公司競相投巨資開展器官移植用豬的研究，并描繪出一幅美麗的圖景，未來的“器官農場”中會有充足的供體，向病人們提供腎、心臟、脾、胰、肝等異種器官。
鄭振輝分析，異種器官移植不但能解決器官短缺，優點還在于，移植的器官可以提前預定，總處于新鮮狀態;醫生有了足夠的時間，可按計劃對患者進行充分的預處理;對豬進行遺傳或生化操作，除了降低排斥反應的危險，甚至可以表達一些新的基因或生化過程來滿足患者的需要。
獲得這些新鮮器官最理想的方法是，把一個人的誘導性多功能干細胞打到豬體內，定向培育出與干細胞提供者完全匹配的人體器官。但還有太多的未知，人的細胞在豬的胚胎發育時，能否順利發育成器官還不確定。目前，戴一凡團隊已經做出了沒有肺的豬胚胎，然后會將人體干細胞注入進去，希望能長出人類的肺。美國薩克生物研究所（Salk Institute for biological studies）、斯坦福大學也已展開類似研究。
這類研究涉及的倫理問題實在太多了。比如人的器官長在豬的神經系統會不會有人的思維，人的干細胞長在豬的生殖系統會不會產生人的、卵子等。
因此，科學界的火力還是集中在異種移植研究。已有的大動物實驗顯示，異種移植到靈長目動物的豬器官和細胞，最長存活期依次是：微囊包裹的胰島、神經元、胰島、角膜、肝細胞、異位心臟、腎臟、原位心臟、肝臟、肺。其中，肺、小腸和心臟的移植還不成熟，已有的實驗不是原位移植。如心臟實驗中，是把豬的心臟放到猴子肚子里，只看有沒有排斥反應，不計功能。
“現在只是解決了排斥反應問題，下一步要解決功能問題，在功能性得到解決以前還不能做臨床研究。”戴一凡說。
進展快速的首推豬胰島移植。戴一凡的團隊用經基因改造的豬胰島在猴子身上進行試驗，胰島在猴子體內存活了400天，還使得猴子血糖回歸到正常數值，不再依賴胰島素。
用于實驗的豬通常為克隆豬。基因組編輯技術降低了供體豬培育的費用，將效率提升幾十倍。2014年戴一凡團隊培育了100多頭克隆豬，成本約250萬-300萬元。100多頭豬并不是用于一次實驗，根據不同的課題，可以移植不同的細胞類型，敲除基因和插入基因不同，同一種細胞要重復做六次到八次實驗。
看上去一切都已就緒，理論上，當人體排異障礙被掃清后，就可以做臨床實驗。可至今沒有一個實驗室走到臨床階段，都還在大動物實驗上嘗試。原因在于美國FDA盯得很緊，除了人體排異反應，還有超潔凈的養殖環境。
超潔凈環境牽涉到外源性感染，FDA明確列出了一些豬攜帶的有害病毒和細菌，移植的器官在用于人體之前，需要檢測供體豬，不能攜帶這些病毒和細菌。目前，各實驗室的養殖豬的環境僅比普通豬養殖環境略好。
保有一個超潔凈的養殖基地需一筆巨大的投資，不是一個實驗室能夠承擔的，這讓各個研究組撓頭不已。前期投資特大，風險也大，企業也還在猶豫。
戴一凡分析，大動物實驗很多實驗室已經完成，大規模臨床研究就等企業來承擔和推動，目前最有希望投資臨床研究的是從事生物技術的美國聯合治療公司（United Therapeutics Corp），可是它此前沒有做最有希望獲臨床批文的胰島、心臟、腎臟等的移植研究，主攻方向是肺，而豬的肺幾乎沒有希望上臨床，排異反應很嚴重。
在中國，如果地方政府有意愿，可能起到實驗室跟企業之間的中介作用。深圳市政府認為這是一個新興的領域，于是通過2010年10月推出的引進高級人才計劃――“孔雀計劃”來直接支持引進生物領域人才，深圳市政府也有意愿幫助建小型的實驗用豬舍，之后，產業化階段引入企業。
問：編輯同志，您好。最近社會上尤其是互聯網上對轉基因食品的安全性比較關注，爭論也很激烈。請介紹一下什么是轉基因食品，國外是如何管理轉基因食品的？
廣東讀者：張輝
張輝同志：
您好！隨著生物技術的不斷進步，轉基因食品的種類和數量不斷增加，轉基因食品的安全性也備受關注。
所謂轉基因食品 ， 是指利用現代分子生物技術， 將某些生物的基因轉移到其他物種中去， 改造生物遺傳特性， 使其在形狀、營養、品質等方面向人們所需目標轉變的食品。換句話說，就是以轉基因生物為直接食品， 或為原料加工生產的食品就是轉基因食品。轉基因作為一種新興的生物技術手段，它的不成熟和不確定性，使得轉基因食品的安全性成為人們關注的焦點。對于轉基因食品的安全問題， 科學家無法給出確定的答案， 各國的管理也是基于國內政治、 經濟、科技、文化等不同因素而呈現出不同的模式。
目前，國外對轉基因食品的管理大體可分為美國和歐盟兩種模式。美國被認為是世界上最大的轉基因食品生產國。美國主張，只要在科學上無法證明轉基因食品的危險性，就不應該限制，因而美國對轉基因食品的管理相對寬松。歐洲國家對轉基因食品可能危害健康和環境的擔憂比較強烈，認為只要不能否定轉基因食品的危險性，就應該加以限制。因此，歐盟對轉基因食品的管理比較嚴格、復雜，法律體系較為完備。
美國對轉基因食品的管理是以產品為基礎， 認為轉基因生物與非轉基因生物沒有本質的區別， 監控管理的對象是生物技術產品， 而不是生物技術本身。美國農業部動植物健康檢驗局負責管理轉基因植物的開發和田間試驗；美國環保局負責對轉基因植物的環境影響進行評估，而食品與藥品管理局則負責轉基因食品和飼料的安全性評估。美國最初對轉基因食品采取開放式管理， 如1992 年食品與藥品管理局有關轉基因植物作為食物的法律提到，相關產品不需作市場前評價， 除非它引起新的安全問題。但自星聯玉米事件后，美國政府開始采取謹慎態度， 并于2001 年1 月出臺了轉基因食品管理草案。此后， 為監測和控制轉基因食品的安全性， 美國政府制定了一系列管理條例。
歐盟實行以工藝過程為基礎的管理模式， 即重組基因技術有潛在危險， 不論是何種基因、哪類生物， 只要是通過重組技術獲得的轉基因生物， 都要接受安全性評價和監控。歐盟的轉基因食品管理機構是歐盟食品安全局， 在對食品安全有直接或間接影響的所有領域內， 提供獨立、科學的建議。
總的來說，歐盟支持風險預防原則， 美國采用轉基因食品和非轉基因食品實質等同原則； 在上市制度方面， 歐盟采用嚴格審批制度， 美國則是自愿咨詢制度； 在標簽制度上， 歐盟采用強制標簽制度， 而美國堅持自愿標識制度。上述差異形成的原因主要是歐美轉基因產業發展不同， 政府與消費者對轉基因食品風險的認識和接受度不同， 各陣營利益集團立法博弈力量不同。
轉基因技術是個新事物，人們存在疑慮是可以理解的，在加強監管的同時，各國也都比較重視人們的知情權和參與權，即讓人們明白哪些是轉基因食品，吃與不吃人們可以自愿選擇。隨著生物技術的發展和管理的改進，人們和轉基因食品的和諧相處應該是可以預期的。
日前，中國中山大學基因工程教育部重點實驗室副教授黃軍就等人，在《蛋白質與細胞》雜志上，發表了他們的課題組利用CRISPR/Cas9系統對人類胚胎基因組改造的研究結果，由此也引發了新一輪的倫理學爭論。
倫理問題想避也避不開 研究人員利用了一種“不能存活”的受精卵來進行研究。這種受精卵含有一個卵細胞和兩個的三個細胞核，從而不能正常發育成嬰兒。研究人員使用一種最近很火的叫做“CRISPR/Cas9”的生殖細胞系剪接技術，來剪切受精卵中人的HBB基因，因為HBB基因突變會導致β地中海貧血癥，該疾病會導致血液失調，造成患者死亡。
黃軍就認為，他們的研究是一個很有意義的模型，一個比動物模型或者成體細胞更接近正常人類胚胎的模型。“我們想讓全世界的人都知道這種模型真正發生了什么，而不是在沒有數據的前提下，口頭討論會發生什么。”課題組為了避免倫理爭論，一開始就設計了“不能存活”的三核受精卵來進行研究，但還是引來了一系列的爭論。
一些人認為，基因編輯胚胎研究具有光明的未來，因為它能在孩子出生之前來消除嚴重的遺傳性疾病。而另一些人認為這種研究跨越了倫理底線，因為這種胚胎修飾是可遺傳的，可能會對未來帶來意想不到的后果。還有人擔心，因為這種技術的簡單易操作，會有人進行不安全或者不道德的應用。
技術上不成熟停止研究 研究人員指出，在對人體胚胎使用“CRISPR/Cas9”生殖細胞系剪接技術出現了“嚴重的障礙”。非靶向突變的出現也說明這一技術存在一定的問題，因為這些非靶向的突變通常都是有害的。
黃軍就表示，他們只檢測了一段基因組，所以只發現了一部分非靶向突變。如果做全基因組測序，會發現更多的非靶向基因被修飾了。雖然黃軍就認為造成這一結果的原因可能是“不正常”的三核受精卵，因為在利用該技術研究動物胚胎和人類正常體細胞的時候，并沒有這么糟糕的結果。但是，鑒于從來沒有對“正常”的人類胚胎進行這方面的研究，誰也不知道結果會怎么樣。最終，黃軍就認為如果想在醫學上應用“CRISPR/Cas9”技術，還需要改進該技術的準確性和保真性。
黃軍就說：“如果要對正常人類胚胎進行實驗，成功率必須接近100%，這就是為什么我們要停止研究，當前我們認為這項研究過于不成熟。”
美國《技術評論》雜志稱，目前全球有多個類似實驗已經計劃好或正在進行，實驗的目的是促進基因療法的發展，比如或許可以在癌癥和艾滋病的治療上找到突破口。
工信部：2018年將繼續推動全面取消二手車限遷政策，加快修訂《二手車流通管理辦法》，推進二手車信息和信用體系建設，帶動汽配、維修、保險等相關服務業發展。
河南省政府工作報告提出，推進河南自貿試驗區建設，賦予各片區更大改革自主權，全面落實160項改革試點任務，積極申建自由貿易港。
據消息人士稱，中國計劃加強對國內公司在海外創立的私募股權基金的監管，包括披露投資人身份，以降低金融風險，并密切關注新一波海外融資潮。
據美國國立衛生研究院(NIH)官網23日宣布，該機構將拿出1.9億美元資助基因組編輯研究項目——“體細胞基因組編輯”計劃，旨在開發安全有效的人類基因組編輯工具，消除將這項革命性技術應用于治療人類患者的障礙。
據財經報道，快手正在進行新一輪10億美元的融資，投后估值在180億美元，騰訊、紅杉將繼續跟進。
海航回應：上市公司集中停牌與流動性無關，去年新增銀行授信逾1900億。
新一代車用鋰電池明年商用、鈦鈮材料成就顛覆性技術
據媒體報道，東芝官方近期宣布已成功研發新一代車用鋰離子電池，有望在2019年商用。該電池采用鈦鈮氧化物陽極材料，相對目前三元、磷酸鐵鋰等技術，實現了一個顛覆性的進步。新電池具備能量密度高、充電效率快等優點，只需充電6分鐘就能達到90%的電量，在日本JC08測試標準下，可行駛320公里。目前鋰電池平均需要30分鐘才能充至80%電量。同時，該電池在充放電5000次之后，仍能保持90%以上的電池容量，損耗率極低。而且在零下10度的低溫環境中也能實現快充，在零下30度仍可正常使用。照此計算，如果每天充電一次，該電池可使用近14年。
業內認為，鈦鈮電池的正式商用，相關金屬材料的需求有望大幅提升。
東方鉭業（000962）是國內最大的鈮產品生產基地，是國內科技先導型的鉭鈮研究中心；
青少年高校科學營西部營首次開營
為推動高端科研資源科普化，服務區域青少年科學素質提升，中國科學院昆明分院組織系統科研單位（昆明植物所、昆明動物所、版納植物園、地球化學所、云南天文臺）科研人員，立足天文科學、生命科學、地球科學的學科優勢、科研資源和區域特色，組織編寫了近40個近探究性科研實踐課程和特色科普教育活動，經過遴選和專家論證，六個探究性科研實踐課程在西部營期間試點啟動。讓青少年走進中科院，走進實驗室，與科研人員一起一起探索熱點、前沿科學問題。
此次活動前期得到了云南省科技廳、團省委、省科協、省教育廳、共青團云南省委、云南大學等多家政府職能部門、高校以及中科院的領導和專家的指導、支持。
在開營儀式上，中科院科研人員代表課程指導團隊――昆明植物所植物化學與西部植物資源持續利用國家重點實驗室、昆明動物所遺傳資源與進化國家重點實驗室、云南天文臺中國科學院天體結構與演化重點實驗室，現場了六個探究性科研實踐課程，歡迎小小科學家的到來。
六個探究性科研實踐課程
3天，中學生營員與中科院科研人員一起泡實驗室、查文獻、寫報告、成果答辯……讓營員了解科學研究的真實過程，感受科學研究的苦與樂，激發探索自然的好奇心。
一、血管保衛戰
――抗血小板聚集化合物活性檢測
課程指導團隊：中國科學院昆明植物研究所天然藥物活性篩選中心植物化學與西部植物資源持續利用國家重點實驗室
冠心病、心肌梗塞、肺栓塞、缺血性腦卒中……這些血栓性疾病無論在我國還是在西方國家都已成為人口死亡與致殘的首因，其發病率高居各類疾病之首，嚴重威脅人類的生命健康，近年來仍有漸增之勢，是當代醫學研究的重點、熱點之一。目前臨床上抗血栓主要用抗凝藥物和抗血小板凝集藥物，后者的應用更為廣泛。
本課程帶領營員走進天然藥物活性篩選中心，建立抗血小板凝集檢測模型，對不同植物天然產物的抗血栓活性進行評價，探討具有抗血小板治療作用的化合物對抗血栓藥物研發的科學意義。
二、受人青睞的天然抗氧化劑
――不同植物抗氧化活性評價及活性成分追蹤
課程指導團隊：中國科學院昆明植物研究所植物化學與西部植物資源持續利用國家重點實驗室
自由基與多種疾病的關系已愈來愈引起人們的重視，而抗氧化劑則能幫助捕獲并中和自由基，從而祛除自由基對人體的損害，有抗癌防癌、抗衰老、調節免疫等多種功效。此外，天然抗氧化劑在食品添加劑中的使用能防止或延緩食品氧化，提高食品穩定性，延長食品儲存期，給我們提供更好的食品安全。通過測定天然產物的抗氧化能力來篩選生物活性物質成為生物化學和醫藥學的研究熱點。
從尋找生活中具有抗氧化的植物活性成分入手，通過化學方法進行抗氧化活性成分的分離及鑒別，通過生物學方法進行抗氧化活性的定性定量分析并指導進一步的活性成分追蹤，最終完成對不同植物的抗氧化活性評價及有效成分的獲得。
本課程帶領營員走進中國一流的天然藥物化學研究平臺，親自動手，應用化學和生物學方法探究身邊那些具有抗氧化植物的活性成分之謎。
三、基因重組技術
――“剪切”、“拼接”的大腸桿菌會發光
指導團隊：中國科學院昆明動物所遺傳資源與進化國家重點實驗室（進化基因組學與基因起源研究組）
大腸桿菌是人和動物腸道中最著名的一種細菌，也是食品檢測的重要指標。同時，大腸桿菌也是一種常用的基因工程菌，它作為外源基因表達的宿主，遺傳背景清楚，技術操作簡單，培養條件簡單，大規模發酵經濟，備受遺傳工程專家的重視。在自然界，很多生物都可以發光，但只能被少部分的幸運兒觀賞到。
本課程帶領營員走進國家重點實驗室，采用基因重組技術，制造一種可以自己發光，又易于培養的大腸桿菌品種（生物工程用菌株），探究基因重組技術的科學意義與魅力。
四、CRISPR-Cas9“魔法剪刀”
――柑橘鳳蝶CRISPR-Cas9基因編輯實驗
指導團隊：中國科學院昆明動物研究所遺傳資源與進化國家重點實驗室（進化基因組學與基因起源研究組）
蝴蝶是自然界中最美麗的會飛的花朵，以其翅膀的美麗和多樣化而著稱，不僅在物種之間，在種群、性別、甚至季節間都存在差異。其翅膀之所以非常多變，是因為它們具有多種功能，與保護色、警戒色、擬態、溫度調節和擇偶等作用有關。
此外，蝴蝶在行為、生物地理學、細胞生物學和生物化學幾乎所有方面都很多樣化。這些特點使蝴蝶成為探索遺傳學、進化、形態多樣性及物種形成的一個有前景的系統。
CRISPR/Cas9是最近發展起來的高效基因編輯技術：簡單、高效（命中率高），首次在蝴蝶上成功實現了該技術。
CRISPR/Cas9技術被譽為基因編輯的“神器”，本課程帶領營員走進國家重點實驗室，采用CRISPR/Cas9基因編輯技術，揭開美麗蝴蝶身上的各個謎團。
五、“百變星君”
――探尋小行星的前世今生
指導團隊：云南天文臺-中國科學院天體結構與演化重點實驗室（系外行星研究團組）
科學家最新研究發現，在大約6600多萬年前的史前白堊紀，小行星撞擊地球的威力原比人們想象中的更為強大，它導致恐龍滅絕的同時，也讓93%的哺乳動物遭遇滅頂之災。近年來，科學家關于小行星沖撞地球預測的報道屢見不鮮，令人們不禁聯想到《世界末日》、《天地大沖撞》等眾多科幻影片中的場景。
本課程帶領營員利用望遠鏡的“巨目”，探秘小行星物理性質的特征，揭開太陽系形成伊始物質狀態的朦朧面紗，以及那波瀾壯闊的太陽系演化歷史。
六、“外星人”發來的信號？
――探尋神秘的脈沖星
指導團隊：中國科學院云南天文臺天體結構與演化重點實驗室（系外行星研究團組）
1967年，英國劍橋大學一位女研究生貝爾本想通過天體閃爍來研究類星體，卻無意間發現狐貍星座有一顆星會發出一種快速的有規律的周期性脈沖信號。一開始，人們對此相當困惑，甚至有人認為這可能是外星人在向我們發電報聯系。到1968年終于證實，這是一種未知天體發出的電磁脈沖信號，并把它命名為脈沖星。脈沖星是高速旋轉的磁化中子星，其脈沖周期就是自轉周期。
本課程帶領營員，利用云南天文臺40米射電望遠鏡觀測脈沖星，根據獲取的觀測數據分析推算脈沖星的位置、周期、密度、色散，以及由星際介質引起的脈沖隨時間和頻率變化的動態譜。
四個特色科普教育活動
實地考察，親手制作，親口品嘗，妙趣橫生的活動，帶領中學生營員們在科學殿堂趣味翱翔……
一、“滇池古董”的回家之路
――滇池金線的熒光標記及放流
指導團隊：昆明動物所
滇池金線，又名金線魚，國家II 級保護動物，瀕危物種，長于滇池形成時的320萬年前，云南傳統四大名魚之首，到1986年已在滇池湖體中消失，僅在湖周少數支流的溪流和泉池中保存有少量個體。從2000年起，昆明動物所科研人員開展了保護、種群恢復、繁殖和可持續利用等一系列的保育研究，實現了滇池金線的人工繁殖、增殖、放流、監測以及野外種群的恢復，為保護和恢復魚類資源和滇池水生生態做出了突出貢獻。
本次活動中，昆明動物所科研人員帶領營員學習魚類野外監測的方法，動手參與到生物多樣性保護的行動中。
二、味蕾與植物的完美邂逅
――美味植物的探秘之旅
指導團隊：昆明植物所
“你隨風飄揚的笑，有迷迭香的味道，語帶薄荷味的撒嬌，對我發出戀愛的訊號……”一首周杰倫的《迷迭香》，用植物特有的香氣描寫出戀愛微妙的氣氛。迷迭香、薄荷、紫蘇、薰衣草、藿香、羅勒、留蘭香、百里香……這些大名鼎鼎的植物同屬唇形科，這個龐大的家族以富含多種芳香油而著稱，其中有很多著名的食藥兩用植物。紫蘇干燒魚、紫蘇鴨、紫蘇炒田螺、蘇鹽貼餅、紫蘇百合炒羊肉、薄荷葉煎蛋、薄荷雞、薄荷茶、迷迭香烤牛排、香草冰激凌……這些使人“唇齒留香”的美味背后又有著哪些不為人知的故事呢？
昆明植物所科研人員帶領營員一起聊起藥用植物和美食植物的科學八卦，生動有趣，他們還一起動手創造舌尖上的植物美食，來一場“美食+知識”的趣味之旅。
三、當科學遇見藝術
――自然筆記
指導團隊：版納植物園
自然筆記是一種目前國內外社會流行的自然體驗方式，通過深入到自然環境中近距離地與自然界的萬事萬物進行親密接觸和細致觀察，運用圖畫和文字等的方式來描繪記錄者所觀察到的動植物及其之間的相互聯系，記錄其中的變化和有趣故事，感受大自然的神奇魅力。
版納植物園科普專家帶領營員走進昆明植物園，用畫筆和心智，為自然寫日記。
四、參訪國立西南聯合大學舊址
國立西南聯合大學是一所與相始終的戰時大學，在昆8年，大師云集、名家薈萃，在極度簡陋和艱苦的環境中，一批名師巨匠鼎立治學研究，堅持為國育才，無數從這里走出的學生成為中國乃至世界的棟梁之才。至今，中國兩院院士中有聯大師生173位。
對參加高校科學營的高中生們而言，科學營不僅可以探索科學奧秘，近距離感受科學與科技的魅力，還收獲了純真的友誼，播種了希望的夢想。
七天相聚的時間很短，離別總是那么難舍，聯大的校歌仍在耳旁回響，青中國夢已經起航……
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全國青少年高校科學營
青少年高校科學營由中國科協、教育部共同主辦，中國科學院為支持單位，由中國科協提供經費支持。為落實《國家中長期教育改革和發展規劃綱要》精神，旨在充分利用重點大學的科技教育資源，激發青少年對科學的興趣，培養青少年的科學精神、創新意識和實踐能力。
2012年首屆全國青少年高校科學營承辦高校總數為41所，以清華大學和北京大學為首，均為全國重點大學。四年來，高校科學營活動共招募全國31個省（自治區、直轄市）和新疆生產建設兵團，以及港澳臺地區的營員37315名，承辦高校也增加到51所。
一個是打假斗士，一個是著名主持，一個代表著公眾對轉基因的普遍焦慮，一個代表著部分人士推進轉基因的決心。一場始于微博的論戰，最終竟然走向法院，事情的發展出乎人們的預料，由此引發的全民關注也可想而知。1月16日，記者在百度中輸入“方舟子崔永元”，搜索出的網頁高達59萬個，連英國BBC中文網都對這一事件進行了報道。而由騰訊網發起的“轉基因食品調查”，人氣值更是高達51.9萬。
從樂觀的角度看，“方崔之爭”已成為一場向廣大網民普及轉基因知識的公開課。
緣起：20余名網友品嘗轉基因玉米
2013年9月7日上午，20多名主動報名的網友參加中國農業大學玉米試驗基地的活動，現場采摘轉基因玉米并煮熟品嘗。作為活動的發起人之一，方舟子表示：“品嘗轉基因玉米雖無科學研究價值，但有科普價值，應當創造條件讓國人可以天天吃轉基因食品。”
此言一出，引發網上熱議。崔永元也轉發了微博“轉基因食品，你吃嗎？你可以選擇吃，我可以選擇不吃。你可以說你懂科學，我有理由有權利質疑你懂的科學到底科學不科學。你可以說我，我也可以說你白吃。”
對此，方舟子在微博中回應稱：“你當然可以選擇不吃，但是不要傳謠阻礙中國農業技術發展。我科普的是各國際權威科學機構認可的科學，你根本不懂，有何資格質疑？”
由此，一場論戰在兩人之間開啟并持續發酵，直到4個多月后的現在，結果仍未見分曉。
方舟子：無需恐慌，學會接受轉基因
作為“挺轉”的中堅力量，方舟子在接受英國BBC網站記者采訪時說，自己在轉基因技術方面寫過兩本書，發表過100多篇文章。他認為，中國轉基因問題的辯論已經超出了技術和專業知識的層面，涉及很多方方面面的問題。
方舟子分析說，在中國，主要有這么幾類人反對轉基因：一類是環保人士和綠色和平組織，這些人一直都在反對轉基因；還有一些不了解情況的人因為不懂轉基因，再加上所謂“陰謀論”的影響，因而也反對轉基因……
方舟子認為，中國科學界的大部分人都是支持轉基因的，只有個別科學家質疑轉基因食品的安全性，因而反對轉基因，但是他們數量不多且也不能代表其研究機構。
針對網上熱議的“西方國家都反對轉基因，只有中國推廣轉基因主糧，中國只是美國的試驗田”，方舟子回應稱，這種說法完全是一種無知。現在世界上種植轉基因主糧面積最大的國家是美國，而歐盟國家總體上也是支持轉基因作物的，只有法國反對，亞洲國家的韓國、日本，也是反對轉基因的。
在方舟子看來，這些國家之所以反對轉基因，主要是因為一些國家基于政治、經濟、文化和的考慮，認為轉基因作物破壞了作物自然屬性，他們反對非自然產品，因而反對轉基因；另一些國家則擔心美國產品占領其國內市場，于是以反對轉基因為借口，設置貿易壁壘，與美國打貿易戰。
實際上，反對轉基因的不僅有國家，還有為數眾多的各國民眾。2011年8月9日“滾出印度日”這一天，印度民間社會組織與相關人士舉行了1000多項活動，數千人參加活動并高呼“孟山都滾出印度”、“禁止轉基因作物試驗”。2012年3月，美國反基因人士在加州、華盛頓州等30多個城市掀起反基因、反孟山都行動，并得到多國反基因人士響應。
在中國，由騰訊網發起的“轉基因食品調查”中，近23.2萬人認為轉基因食品不安全，24.4萬余人不支持轉基因糧食在中國商業化種植，分別占受調查總人數的89.3%和94.1%。
對于這一現象的產生，方舟子認為，主要是由于人們不了解轉基因技術和相關科學方法。例如，有人要求證明轉基因食品絕對沒有隱患才能上市，但這是不可能的。對于任何食品，沒有人能證明它是絕對沒有隱患的。而和其他技術一樣，轉基因技術用不好也可能會出問題或意外，但大家不應因為這種顧慮就反對它。總之，目前已經上市的轉基因食品都經過理論論證和實驗驗證，都是安全的，沒有經得起推敲的理由和證據，就不能懷疑它們的安全性。即使從長遠來看，也是如此。
在方舟子看來，在今天，人們想要完全避開轉基因食品幾乎是不可能的。國內市場上絕大部分大豆油和調和油、幾乎所有的木瓜以及相當一部分西紅柿，都是轉基因的。即使你刻意不在市場上購買轉基因產品，上餐館用餐時也難以避免。轉基因食品早巳進入人們的生活，而且只會越來越多，因此無需恐慌，而應學會接受它。
崔永元：推廣宜謹慎，應設商場專柜
自2013年12月崔永元自費50萬前往日本、美國等地調查轉基因產品后，他開始被網友視為新的“反轉”代表。
崔永元認為，轉基因問題橫跨多個領域，涉及農業、醫學、環境、定價等相關部門，因此轉基因作物的產業化不應由農業部一家說了算。比如，日本通常是由農林水產省和環境省進行轉基因作物生物多樣性影響的審查，由農林水產省進行飼料安全審查，由厚生勞動省進行食品安全的審查，多個部門共同監管相互制衡。
對于被方舟子質疑為“外行”，崔永元認為，轉基因新技術涉及方方面面，每個人都有發言權。日本政府在認可轉基因農作物前，都要聽取國民的意見，鼓勵民眾參與投票，并在做鑒定的同時公開向全社會征集消費者的意見和建議。
為什么中國政府發了轉基因水稻安全證書，但大家仍不相信其安全？崔永元指出，轉基因宣傳特別需要公信力，美國FDA（食品和藥物管理局）、日本厚生省都有一個共同特點，就是有公信力，要推行新的產品時大部分民眾都選擇相信。
崔永元表示，中國應加大對轉基因技術的研究力度，這涉及到糧食安全、知識產權等，因此要堅決支持中國發展自己的轉基因技術，研究上“一天都不要停”。但轉基因作物商業化種植一定要謹慎，尤其是轉基因主糧產業化一定要慎之又慎。
增強免疫細胞戰斗力
白血病又被稱作血癌，也就是血液和骨髓的癌癥。急性淋巴細胞白血病是兒童最常患的白血病。正常的骨髓會制造成熟的血細胞，而急性淋巴細胞白血病患者的骨髓因為被癌細胞抑制，只能制造不成熟的血細胞，而且發展迅速。治療一般會用化療、放療來殺死患者體內的癌細胞，然后再用干細胞移植來幫助患者重新建立健康的造血系統。不過，化療和放療會大規模殺死健康細胞，干細胞移植會帶來嚴重的排異反應。
現在白血病的治療又有新的方向――基因治療。具體來說，是改變T細胞的基因。T細胞是一種重要的免疫細胞，它們在我們的身體里不停巡邏，其表面的蛋白質受體就像探測器，一旦發現異常細胞，例如被感染的細胞或者癌化的細胞時就會將它們殺死。可以說，T細胞是我們身體對抗癌癥的先鋒戰士。然而，癌細胞十分狡猾，它們會通過進化來躲開T細胞。例如，T細胞表面有一種名為PD1的受體，其作用就像是一個開關，一旦被觸碰就會讓T細胞停止下來，本來是為了預防T細胞過激的反應。進化了的癌細胞會去觸碰這個開關，讓想要掃清它們的T細胞變得緩慢或者停止下來。有了這種能力的癌細胞十分危險。
如果能夠避免T細胞被“關掉”，那么免疫系統的戰斗力無疑能夠得到提升，可以殺死更多進化了的癌細胞。現在有一種新興藥物――PD1抑制劑，就能避免T細胞被關閉。聯合其他治療方法，這種藥物已經在癌癥治療中顯示出了不錯的效果，包括白血病。
修改T細胞的基因
在增強T細胞能力這方面，除了抑制PD1受體，另一種令人激動的方法是，通過修改T細胞的基因，使其能夠更好地找到和殺死癌細胞。癌細胞表面的蛋白與正常的細胞有區別，T細胞通過基因改造，其表面的受體如同針對癌細胞表面的蛋白定制的一樣，這種被改造的受體叫嵌合抗原受體（CARs）。受體就如同探測器，那么嵌合抗原受體就是癌細胞的專屬探測器。關于嵌合抗原受體的研究從20世紀80年代就開始了，但從前幾年才開始人類臨床試驗，并且展現出了驚人的結果。
在一次諾華制藥公司贊助的CARs T細胞的臨床試驗中，一名1歲的女孩兒Layla獲得了很好的療效。傳統的治療方法對Layla都失敗了，實驗性的CARs T細胞療法挽救了她的生命。在治療中，醫生本來需要先將T細胞移出患者體外，然后用基因技術將其改造為CARs T細胞，最后再放回患者體內。不過，由于Layla太小了，而且病得很重，醫生無法從她體內獲取足夠多的T細胞用于基因改造，所以只能使用捐贈者的T細胞。由于排異反應，當捐贈者的T細胞進入到Layla體內后，會將她自身的細胞當作入侵物來攻擊。因此，在治療Layla的時候，除了需要修改T細胞的CAR基因，還要修改其他基因讓T細胞不會攻擊Layla的正常細胞。
不斷完善基因治療
以往的基因治療只能添加基因，而現在修改基因的技術提供了更多的可能性。經過基因改造后的CARs T細胞能夠治療很多疾病。為了讓更多的人獲益，研究者們還在不斷地改進這種療法。首先，如果使用捐贈者的T細胞，那就必須解決排異反應的問題。雖然T細胞經過基因修改不會攻擊患者的其他細胞，但是患者的免疫系統卻會攻擊外來的T細胞。還好的是，Layla之前接受的傳統治療方法已經讓她的免疫系統停止了工作。對于其他患者，有什么辦法可以不用事先摧毀他們的免疫系統嗎？
美國賓夕法尼亞大學的研究團隊就利用CRISPR基因編輯技術關閉了患者的一個基因，讓他的免疫系統不會將捐贈者的T細胞視作入侵者，降低了捐贈者的T細胞受到攻擊的幾率。
賓夕法尼亞大學的研究團隊還關閉了CARs T細胞上的PD1受體基因。也就是說，CARs T細胞上的“開關”被拿掉了，這樣一來癌細胞也就無法把CARs T細胞關掉了。這種更加優越的CARs T細胞已經在治療小鼠的白血病實驗中取得了成功。有可能在未來的幾年內，這種治療方法就可以運用于臨床。當然，這種療法并非完美無缺。例如，修改基因時很有可能“誤傷”到其他不需要修改的基因，這有可能造成其他細胞癌變。還有，癌細胞可能會往別的方向進化，例如消除表面會被T細胞識別的蛋白質，這樣CARs T細胞就無能為力了。而最大的問題是，CARs T細胞有沒有可能對付實體腫瘤。在目前的實驗中，CARs T細胞還無法單獨消除實體腫瘤，只能作為其他治療的輔助方法使用。
摘要:新時代新要求,各種創新被擺在了重要位置。加強教學創新,必先審視教育自身,科學發展在日新月異而我們的教學內容卻不能與時俱進,新酒仍用舊瓶裝的現象,制約了教學創新的又好又快發展。加強教學方法創新的同時不要忽視教學內容的更新,兩手都要抓,兩手都要硬,本文結合教學體會進行舉證。
關鍵詞:新課改 教材更新 教學創新
新世紀已拉開它那千年帷幕,展現出科技化、信息化的時代特征,競爭核心也轉移到層次更高的創新能力競爭上。它呼喚有求異思維、創新能力、實踐精神的復合型人才。審視我們的教育不難發現在科學與教學上雙軌不同速;從小學開始便一步到位,進校就是拿出書本,學習現成的理論。知識更新慢,獲取途徑單一;中間缺少了質疑、假想、實踐等知識的發現、發掘環節。這種現狀下要實現知識的再發現、技術的再革新可以說是緣木求魚,要得渠清如許,須源頭有活水。
隨著新課程改革如火如荼地進行,一個教材版本一統天下的局面被打破。試點地區有了相對的選擇權,能夠根據自己地區的特點、實際編寫和選擇不同版本的教材。百家爭鳴才能異彩紛呈,原本不錯的設想實施起來卻是很不容易,不同版本教材的優、缺點逐漸呈現出來:有的版本注重知識的完整性,強調“再現知識的發現過程”,知識的系統性得到了保障,但受容量所限,在知識點的深刻性和完整性上必有取舍。有的版本在知識點上注重完整性、深刻性,而知識的系統性被割裂,魚和熊掌確實難得。試驗教材在編寫時過分突出自己的特點,大有和原來教材徹底決裂的趨勢,找不準傳承和創新的結合點。一些地方是必須要改動的,但一些該統一的內容必須要統一。“甘薯”在不同的地方可以叫“地瓜”、“紅薯”等,但它的學名只有一個。一些概念、名詞統一起來未嘗不是好事,尤其是對初學者,對他們將來學業的發展也是有幫助的。
教材知識在各學段的銜接不到位。有些知識重復,有些后學段用到了而以前卻沒有學習體驗。分子遺傳學內容較深奧、突兀,學生接受起來困難很大。高中教材在知識的延續性、概念的內涵和外延上有些地方做得欠缺:過于尊重知識的發現過程,沒有很好地利用初中所學,也沒有很好地結合時展和科技進步。如“基因”這個詞在學完分離規律后才出現,授課時老師一會兒“遺傳因子”一會兒“基因”,給教學帶來很大麻煩。學生已經知道這個概念而且耳熟能詳,也知道孟德爾豌豆實驗中“遺傳因子”就是通常所說的“基因”,教材完全可以稍事說明就直接用基因這個概念了。
即使同一教材需要改進的地方也有很多,有了創新的教學內容,才有創新的教學行為。多年來我們一直高喊教學創新,但是很多工作淺嘗輒止,口頭上的東西多,落實在行動上的少。不是缺乏創新土壤,而是缺乏創新的種子。教學內容更新的滯后,禁錮了創新思維的發展。甲型h1n1流感病毒攜帶有禽流感、豬流感和人流感三種流感病毒的脫氧核糖核酸基因片斷,同時擁有亞洲豬流感和非洲豬流感病毒特征。這些就很難用教材中的內容來解釋。(1)最初對基因的定義是“有遺傳效應的dna片段”,流感病毒的核酸是rna,從最初的定義來看h1n1病毒的遺傳物質不能叫“基因”。(2)由于病毒沒有染色體,其變異方式肯定不是染色體變異,同時它又不能進行有性生殖,不符合通常所說的基因重組。一般來說病毒的變異方式只有基因突變,而且這種突變是點突變—— 只是堿基對的改變,應該不會有其他病毒的基因片段,這顯然有悖于現實,因此我們應該以發展的眼光看問題,不能再拘泥于成規。甲型h1n1的最初來源應是基因重組,就像格里菲斯所做的“肺炎雙球菌轉化”實驗那樣,發生了非真核生物之間的基因重組。只是人、豬、家禽共處的時間已很長,該病毒出現的如此突然,變異的幅度如此之大是人們始料未及的。當前令人恐懼的超級細菌的產生可能正是這方面的原因。“基因”、“基因重組”等概念也應該與時具進作出相應的調整了。
生命科學密切聯系生活實際,與學生的生活休戚相關,不缺乏興奮點和創新的切入點。教學內容應時時、事事孕育創新,存在質疑的地方要加強討論,形成共識,給出明確的結論或說明。目前對水的跨膜運輸方式的共識是“自由擴散”,但是學生具備了相應的知識儲備后提出:生物膜的支架是磷脂雙分子層,根據相似相溶原理,水分是不能自由擴散的。這樣通過分子間隙的水量應該很少而且速度也不會很快。“單純的自由擴散”是很難用課本上的內容來解釋的。這樣的問題已經存在了很多年,也困擾了師生很多年。即使2003年peter agre教授因發現水通道蛋白(aquaporin)而獲得諾貝爾化學獎,“膜內在蛋白質”,“形成的專門輸送水穿膜通道,存在于紅細胞和腎組織中,極大地增加膜的水通透性。”這些知識教材
編輯整理本文。
中提及的很少,原本公認淺顯的內容反而成為知識障礙。
在普及和傳承科學知識時嚴謹性不能大而化之,深、廣度的定位不但要符合學生的認知,而且也要遵循知識自身的內在規律。2008年高考山東卷—— 理綜第一題從細胞膜上提取了某種成分,用非酶法處理后, 加入雙縮脲試劑出現紫色;若加入斐林或班氏并加熱,出現磚紅色。該成分是:(1)糖脂;(2)磷脂;(3)糖蛋白;(4)脂蛋白。“用非酶法處理”給出信息:不考慮外加物質(蛋白質)影響,雙縮脲試劑顏色反應檢測蛋白質;斐林(或班氏)試劑檢測可溶性還原糖,蛋白質+糖選出c選項“糖蛋白”。本題在命題立意上屬于容易層次,但是程度好、思維縝密的考生會發現糖蛋白上的糖不是可溶性還原糖,糖蛋白(glycoprotein)是分支的寡糖鏈與多肽鏈共價相連所構成的復合糖,這與他們掌握的“多糖不具有還原性”相矛盾。送分題送不出去,這些現象直接影響學生的學習情緒,同一問題從不同角度考慮可能有不同說法,使學生大多認為生物學難學。在教和學中學科特點要尊重,但是其科學性質和地位是不能打折的。“怎樣教”是我們刻意鉆研的,“教什么”同樣需要深入研究。
“工欲善其事,必先利其器”。我們在大談方法革新時,不妨考慮除了技術上的改進,還有原材料選擇上的革新,用兩條腿小跑總比單腿跳得快！加強教學方法創新的同時不要忽視教學內容的更新,兩手都要抓,兩手都要硬。
參考文獻
[1] 全國高考題真題匯編[z].
