時(shí)間：2023-05-29 17:45:35
開篇：寫作不僅是一種記錄，更是一種創(chuàng)造，它讓我們能夠捕捉那些稍縱即逝的靈感，將它們永久地定格在紙上。下面是小編精心整理的12篇熱休克蛋白，希望這些內(nèi)容能成為您創(chuàng)作過程中的良師益友，陪伴您不斷探索和進(jìn)步。
關(guān)鍵詞:熱休克蛋白;結(jié)構(gòu);功能;針灸;中藥
中圖分類號:R456 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A 文章編號:1673-7717(2010)04-0718-03
Comparison of Different Heat Shock Proteins and Their Relationship with the Chinese Medicine
HUANG Yun,Advisor:LING Yaping
(Department of Acu-moxibustion and Massage,Hunan College of Chinese Medicine,Changsha 410208,Hunan,China)
Abstract:Heat shock protein is a group of highly conserved protein molecules family who has important physiological functions. Physiology, pathology and environmental factors can be induced by heat shock protein production, it is also known as stress proteins. According to molecular size and degree of homology, HSPs can be divided into HSP110, HSP90, HSP70, HSP60, small molecular HSP family of five major. Current,We studied HSP90, HSP70 most, but few on the HSP110. HSPs have much in common, but each HSP family has a unique structure and function. HSPs can protect the body , so try to find a no toxic side effects of HSPs induction agent or method has become an active area of research at home and abroad. Acupuncture and Chinese medicine of Traditional Chinese Medicine can affect the expression of HSPs.We make a review aboutthe structure、function of the HSPs and the relationship with Chinese medicine.
Key words:heat shock protein ; structure; function ; acupuncture Chinese medicine
收稿日期:2009-11-11
基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30772707 )國家教育部博士點(diǎn)科研基金資助項(xiàng)目(20070541003)
作者簡介:黃蕓(1984-),女,湖南耒陽人,碩士研究生,研究方向:經(jīng)脈臟腑相關(guān)機(jī)理研究。
通訊作者:林亞平(1956-),女,湖南長沙人,教授,碩士研究生導(dǎo)師,研究方向:經(jīng)脈臟腑相關(guān)機(jī)理研究。
熱休克蛋白(heat shock proteins, HSPs)是Ritossa在1962年首先發(fā)現(xiàn)的,當(dāng)時(shí)在研究果蠅唾液腺染色體時(shí)發(fā)現(xiàn)一種在細(xì)胞高溫應(yīng)激時(shí)能產(chǎn)生對細(xì)胞有保護(hù)作用而且高度保守的蛋白質(zhì)[1]。HSPs每個家族針對不同的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)都有組成性和誘導(dǎo)性表達(dá),如HSP60和HSP90在哺乳動物中為組成性表達(dá),而HSP70和HSP27在受到高熱、氧化應(yīng)激或抗癌藥物刺激時(shí)的高表達(dá)為誘導(dǎo)性表達(dá)。
HSPs的功能[2]主要有 :①維持細(xì)胞蛋白自穩(wěn)。②“分子伴侶”作用。③提高細(xì)胞對應(yīng)激原的耐受性。④參與免疫調(diào)節(jié),增強(qiáng)免疫功能。⑤既有直接的神經(jīng)元保護(hù)作用,又可誘導(dǎo)其他保護(hù)性機(jī)制的產(chǎn)生,直接或間接參與神經(jīng)元的自身保護(hù)。⑥參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)。
HSPs的分子生物學(xué)特性[3]:①生物界的普遍性。自然界所有的原核和真核生物都有HSP。②高度保守性。不同物種有同源性很高的HSP,其中氨基酸序列有50%～90%的一致性, 但不同家族HSPs之間則無明顯序列同源性。③非特異性。除熱環(huán)境以外,其他的物理、化學(xué)及生物應(yīng)激原,如缺血、缺氧、感染、創(chuàng)傷、重金屬離子、氧自由基等均可誘導(dǎo)HSPs的產(chǎn)生。④交叉耐受性。是指一種應(yīng)激刺激誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生HSPs后,不僅使細(xì)胞對該刺激的耐受性增加,也增加了細(xì)胞對其他應(yīng)激原刺激的耐受性。⑤模擬性。指能以分子模擬宿主自身抗原,兼具迷惑宿主與致病的兩重性。⑥雙重性。指有自身抗原和特異抗原,能引起抗感染免疫及腫瘤防護(hù),又能誘導(dǎo)多種自身免疫病及感染炎癥。
除了上述的共同特點(diǎn)外,各個熱休克蛋白家族又有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)、功能及生物學(xué)特性。
HSP90:HSP90家族成員主要有HSP90α、HSP90β和gp96(Grp94)。HSP90 在胞漿內(nèi)主要以同源二聚體的形式存在,每個同源二聚體又由2 個單體構(gòu)成。HSP90 單體包括3 個主要的結(jié)構(gòu)域:由1個保守的25×103的N 末端結(jié)構(gòu)域和1個55×103的C末端結(jié)構(gòu)域和1個中間結(jié)構(gòu)域[4]。其N端結(jié)構(gòu)域是結(jié)合底物蛋白結(jié)構(gòu)域,類似蛋白酶結(jié)合底物口袋,C端為寡聚化結(jié)構(gòu)域[5]。HSP90是胞漿蛋白,它通過與靶蛋白的活集團(tuán)的結(jié)合,使其維持所謂“無活性穩(wěn)態(tài)”。HSP90通?？赡嫘缘亟Y(jié)合并穩(wěn)定胞漿中受體分子的活性結(jié)合位點(diǎn),從而避免這些結(jié)構(gòu)與胞漿中的其它生物分子形成聚合體而失活[6]。在抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞存活上,HSP90主要作用于抑制IκB降解的各個通路上。HSP90能直接與Akt相互作用,抑制它的去磷酸化。磷酸化的Akt能使Bcl-2家族的Bad和caspase-9磷酸化,使它們的活性受到抑制,促進(jìn)細(xì)胞存活。
HSP90作為HSPs 重要成員之一,在腫瘤中研究和應(yīng)用最多。HSP90在腫瘤細(xì)胞中主要處于活化態(tài),而在正常細(xì)胞中則主要處于靜默態(tài)。pp60v2src 是第一個被發(fā)現(xiàn)能與HSP90 作用的原癌基因,它能夠與HSP90 形成HSP902pp60v2src復(fù)合體。P53基因突變是至今已知的與人類癌癥相關(guān)的最普遍的基因異常, HSP90 也能夠和突變型p53 特異性結(jié)合,導(dǎo)致突變型p53 復(fù)合體的積聚和半衰期的延長[7]。HSP90 還參與腫瘤血管的生長、侵襲及轉(zhuǎn)移。研究表明抑制HSP90 的功能可對腫瘤達(dá)到“多點(diǎn)攻擊”,達(dá)到抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。HSP90抑制劑可以通過特異性抑制HSP90 阻斷腫瘤生長轉(zhuǎn)移信號網(wǎng)絡(luò)通路中的多個靶點(diǎn),還能逆轉(zhuǎn)腫瘤的耐藥性,使腫瘤對化療藥物敏感性增加。HSP90及其抑制劑是目前抗腫瘤研究的熱點(diǎn)和前沿[8]。
HSP70:HSP70家族包括GRP75,GRP78,BIP,HSP68,HSP72,HSC70等。根據(jù)表達(dá)形式的不同可分為結(jié)構(gòu)型和誘導(dǎo)型兩種:HSC70固定表達(dá)存在于胞液與細(xì)胞核中,被稱為結(jié)構(gòu)型HSP70;誘導(dǎo)型HSP70(又稱為HSP72或HSP70)為高度應(yīng)激所誘導(dǎo)。通常所指的HSP70即誘導(dǎo)型HSP70[9]。HSP70蛋白由兩部分組成,即ATP酶區(qū)(AT-Pase domain)和底物識別區(qū)或叫多肽結(jié)合區(qū)(pep-tide-binding domain)[10]。HSP70是膜結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白,其生物學(xué)作用主要是結(jié)合靶蛋白的疏水片斷而防止肽鏈的錯誤盤繞。在細(xì)胞受到環(huán)境變化和有害刺激時(shí),細(xì)胞的一部分結(jié)構(gòu)和功能蛋白發(fā)生變性,在正常狀態(tài)下處于分子內(nèi)部的疏水片斷暴露“外化”,而形成不穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)。HSP70則通過與這些疏水片斷的結(jié)合而穩(wěn)定其結(jié)構(gòu),并通過復(fù)雜的分子間相互作用,利用水解ATP的能量,協(xié)助變性蛋白的復(fù)性[11]。在控制細(xì)胞凋亡中,HSP70高表達(dá)能抑制caspase的激活、線粒體的損傷和核斷裂。可以通過直接或間接地抑制MEK激酶抑制JNK的磷酸化,還可作為天然的抑制蛋白結(jié)合到JNK,抑制其活性,從而抑制JNK細(xì)胞凋亡通路。
HSP70是HSPs中反應(yīng)最為敏感研究最多最深入的。在臨床上,HSP70與癲癇、心腦缺血、多發(fā)性硬化、感染、腫瘤等多種疾病關(guān)系密切。在腦血管病和心血管病中對心肌細(xì)胞和腦細(xì)胞有顯著的保護(hù)作用,減少細(xì)胞缺血壞死范圍,修復(fù)損傷蛋白質(zhì),提高細(xì)胞對缺血的耐受性[9,12]。急性腦創(chuàng)傷后在易受損傷區(qū)域的神經(jīng)元HSP70的轉(zhuǎn)錄表達(dá),能減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡,有助于延遲神經(jīng)細(xì)胞的死亡,與神經(jīng)保護(hù)關(guān)系最為密切[13-14]。HSP70可與突變型P53形成穩(wěn)定復(fù)合物,從而使核內(nèi)P53轉(zhuǎn)移到胞漿中,喪失了控制細(xì)胞增殖的能力。HSP70可以激發(fā)抗腫瘤細(xì)胞的特異性反應(yīng),結(jié)合細(xì)胞內(nèi)的全部異常肽庫,因此HSP70 - 肽疫苗可以是多價(jià)的,這有利于防止免疫逃逸從而增強(qiáng)免疫效果,為腫瘤疫苗開發(fā)提供了新的思路。
HSP60:真核生物的HSP60主要位于線粒體內(nèi)(約70～80%),另有小部分位于胞漿。此外, HSP60存在于某些細(xì)胞的分泌顆粒中,例如胰島的β細(xì)胞。HSP60是線粒體內(nèi)最主要的分子伴侶蛋白之一,它與HSP10組成的高分子量聚合物被形容為“巨型呼吸器”,是線粒體基質(zhì)蛋白折疊和修復(fù)系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分。人類HSP60與其分子伴侶HSP10的基因頭對頭位于2號染色體上,兩個基因之間有雙向啟動子,啟動子中則含有熱休克元件,接受熱休克轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控[15]。正常條件下,HSP60以穩(wěn)定狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)和線粒體基質(zhì)中,維護(hù)抗凋亡因子的正常構(gòu)象和功能;應(yīng)激條件下,HSP60迅速從胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移到線粒體基質(zhì)以修復(fù)線粒體基質(zhì)中的變性蛋白,對促凋亡因子產(chǎn)生保護(hù)和協(xié)同作用[16]。因此,HSP60有抗凋亡和促凋亡的雙向調(diào)整作用。它的這種抑制或者促進(jìn)作用可能與細(xì)胞種類、所受刺激類型、細(xì)胞狀態(tài)、HSP60含量和活性等多種因素有關(guān)。HSP60 是一種T細(xì)胞信號,壓抑或禁止化學(xué)反應(yīng),其中Peptide (p277) 是它的一個24個氨基酸片段,首先在非肥胖型糖尿病大鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種抗原,p277能阻止先天的或適應(yīng)性T細(xì)胞受體對B 細(xì)胞的損害,從而對1型糖尿病有治療作用[17]。
sHSP:小熱休克蛋白(small heat shock protein,sHSP)幾乎存在于所有生物體中,其主要結(jié)構(gòu)是由N端域和C端域2個部分組成,C端域含有一個相當(dāng)保守的α晶體蛋白(α-crystallin)結(jié)構(gòu)域,由約90個氨基酸殘基組成,與其相鄰的是可變的N端域。小熱休克蛋白家族成員的共同特點(diǎn)是特殊絲氨酸殘基上的磷酸化,磷酸化作用會導(dǎo)致sHSP低聚體狀態(tài)發(fā)生改變,從而使sHSP的生物學(xué)功能得以發(fā)揮[18]。目前研究最多的sHSP有HSP47和HSP27。 HSP47是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)唯一的一種熱休克蛋白,它是一種能與多種類型膠原和前膠原特異性結(jié)合的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留蛋白。在膠原合成及纖維化病理過程中發(fā)揮重要作用。國外有多項(xiàng)研究證實(shí),抑制HSP47的表達(dá),可抑制膠原合成,減弱纖維化程度[19-20]。HSP27為ATP非依賴性分子伴侶,其功能主要是防止蛋白質(zhì)聚集. HSP27既可以維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)又可以維持線粒體的穩(wěn)定性,結(jié)合和穩(wěn)定肌動蛋白維持肌動蛋白網(wǎng)狀系統(tǒng)的完整性,防止凋亡因子如激活的Bid進(jìn)入線粒體膜。
HSPs與針灸、中藥。HSPs對機(jī)體具有保護(hù)作用,故設(shè)法尋找一種沒有毒副反應(yīng)的HSPs誘導(dǎo)劑或方法,誘導(dǎo)HSPs合成,增加機(jī)體對細(xì)胞的保護(hù)過程,已成為國內(nèi)外研究的活躍領(lǐng)域。中醫(yī)中的針灸和中藥能影響HSPs的表達(dá)。在機(jī)體受到疾病損傷時(shí),用對機(jī)體沒有損傷的針灸和中藥誘導(dǎo)HSPs的表達(dá),對機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)作用。
祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為針刺作為一種刺激,作用于腧穴,通過經(jīng)絡(luò)系統(tǒng)的傳導(dǎo),調(diào)節(jié)機(jī)體臟腑功能,具有溫通經(jīng)絡(luò),消瘀散結(jié),祛散陰寒,益氣升陷,回陽救逆及保健強(qiáng)身,預(yù)防疾病等作用,已得到國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界的公認(rèn)[21]。臨床上,刺血療法治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎具有鎮(zhèn)痛和瀉熱作用顯著的特點(diǎn),用三棱針在大鼠患側(cè)“昆侖”穴刺血,這種物理性刺激可以直接刺激機(jī)體促進(jìn)HSP70的產(chǎn)生,增強(qiáng)HSP70表達(dá)。HSP70的增高又抑制炎癥細(xì)胞因子如IL-1、PGE2的轉(zhuǎn)錄,使之減少分泌并降低循環(huán)中的含量[22]。對心臟手術(shù)者取雙側(cè)內(nèi)關(guān)、列缺、云門穴位針刺,發(fā)現(xiàn)針刺對心肌細(xì)胞HSPmRNA基因表達(dá)有一定的增強(qiáng)作用,表明針刺對心臟手術(shù)者的心肌缺血有一定保護(hù)作用。劉志彬等對慢性脊髓損傷大鼠模型使用電針治療后,通過增加HSP70的表達(dá)能量顯著降低iNOS的活性,保護(hù)脊髓神細(xì)胞并減輕繼發(fā)性脊髓損傷[23]。
艾灸是將艾葉點(diǎn)燃后放置在腧穴或病變部位進(jìn)行燒灼和熏熨,借其溫?zé)岽碳ぜ八幬镒饔靡苑乐渭膊〉囊环N外治方法。艾灸具有鎮(zhèn)痛、改善血循環(huán)、調(diào)整代謝紊亂、調(diào)節(jié)免疫功能和調(diào)整臟腑功能等作用?！夺t(yī)學(xué)入門》說:“虛者灸之使火氣以助元?dú)庖?實(shí)者灸之使實(shí)部隨火氣發(fā)散也,寒者灸之使其氣復(fù)溫也,熱者灸之引郁熱外發(fā)”。易受鄉(xiāng)等[24-26]對應(yīng)激性胃潰瘍大鼠艾灸“足三里”“梁門”穴。研究結(jié)果顯示,與艾灸非穴對照點(diǎn)組比較,艾灸足三里、梁門穴組大鼠胃黏膜的HSP70家族的表達(dá)均明顯增強(qiáng)、MDA含量明顯減少胃黏膜損傷程度明顯減輕,顯著降低了應(yīng)激性潰瘍指數(shù)和潰瘍面積比,并使應(yīng)激模型大鼠的死亡率降低。
中藥復(fù)方或單味藥物的提取物能提高HSPs在機(jī)體的表達(dá)。于澤等[27]用三七五參湯作用與心肌缺血損傷的試驗(yàn)中,Western和免疫組化結(jié)果顯示三七五參湯組大鼠心肌組織中HSP70的表達(dá)較正常組和模型組明顯為高,心肌損傷程度明顯減輕,說明三七五參湯對缺血心肌的保護(hù)作用可能與其誘發(fā)HSP70表達(dá)有關(guān)。涂勝豪等[28]觀察雷公藤甲素對膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),雷公藤甲素可以有效地下調(diào)模型大鼠關(guān)節(jié)滑膜和軟骨細(xì)胞異常表達(dá)的HSP60、HSP70和MHC-Ⅰ類分子。在腦缺血再灌注中,分別用補(bǔ)陽還五湯、黃芪、川芎嗪、葛根素、丹參、復(fù)方阿魏酸來誘導(dǎo)HSP70,結(jié)果顯示,雖然這些藥物的作用機(jī)理不同,但是都使HSP70mRNA及蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng),對腦缺血損傷有保護(hù)作用。補(bǔ)陽還五湯可明顯抑制HSP70的轉(zhuǎn)錄,而黃芪則除了可明顯抑制其轉(zhuǎn)錄外,還可輕度降低HSP70的翻譯[29]。
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[中圖分類號]R622 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A [文章編號]1008-6455(2010)05-0691-04
Heat shock protein 90 promotes wound healing in the diabetic rats
REN Jing,ZENG Hai-feng,XIA Wei,LIU Bei,LI Yong
(Institute of Plastic Surgery of People's Liberation Army,Xijing Hospitol,the Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,Shaanxi,China)
Abstract:ObjectiveHeat shock protein 90 (HSP90) could promote human epidermal cell migration in hypoxia which is the essential processes for skin wound healing. These processes are often disrupted in diabetic chronic wounds, causing patients morbidity and fatality. So we want to find out whether HSP90 could promote the epidermal cell migeration in the diabetic wound. Methods A d=2cm-sized stented wound were created in 80 streptozotocin-induced rats. A total of 100 diabetic wounds were studied in 5 groups (n = 20). The group B is blank Vaseline, the group C is 1μg/ml HSP90 plus Vaseline, the group D is 30μg/ml insulin plus Vaseline, the group E is 1μg/ml HSP90 and 30ug/ml insulin plus Vaseline. And we set group A as control group that is normal rats without treatment. We rubbed these kinds of Vaseline into the diabetic rat's wounds for 2 days. We used a group of normal rats without therapy as controls. The state of the wound healing was observed, and the percent of wound healing determined by measuring its size and by performing a histopathologic study. The statistical analyses were performed by t-test, using SPSS 14.0 software. On the 3th, 5th,7th, 10th, 14th and 21th, we tested the wound tissues by immunohistochemical staining and calculated integrated optical density (IOD) and density mean(DM)by image pro plus 6.0 software. Results On the 21th day, the wound closure rates of the group C(85.9%),D (86.8%)and E(96.8%) is significantly higher than group B(79.7%) (P
Key words: heat shock protein90(HSP90);diabetic wound;wound healing;diabetes
糖尿病造成的難愈創(chuàng)面已成為目前臨床治療的一大難題,研究表明,高糖會抑制人表皮細(xì)胞的遷移,從而導(dǎo)致創(chuàng)面上皮化延遲[1-2]。近來,Li.W的研究發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白90(heat shock protein 90,HSP90)能夠有效促進(jìn)人表皮細(xì)胞的遷移[3],而關(guān)于其是否能夠有效促進(jìn)糖尿病性難愈創(chuàng)面的研究并未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在將HSP90應(yīng)用于糖尿病性難愈創(chuàng)面,并輔以胰島素作為參照,以觀察不同時(shí)期各組創(chuàng)面的愈合程度及創(chuàng)面中HSP90的表達(dá)含量。
1材料和方法
1.1動物及分組:選用健康清潔級雄性SD大鼠100只,由第四軍醫(yī)大學(xué)動物試驗(yàn)中心提供,體重(200±3)g,分為A、B、C、D、E五組,每組20只。A組為正常創(chuàng)面但不予以任何治療,即對照組;B組為糖尿病大鼠難愈創(chuàng)面給予空白凡士林藥膏治療組,即空白組;C組為糖尿病大鼠難愈創(chuàng)面給予含有HSP90的凡士林藥膏治療組,即HSP90組(HSP90濃度:1μg/ml);D組為糖尿病大鼠難愈創(chuàng)面給予含有胰島素的凡士林藥膏治療組(胰島素濃度:30μg/ml)E組為糖尿病大鼠難愈創(chuàng)面給予含有HSP90及胰島素的凡士林藥膏治療組,即聯(lián)合用藥組(E組,HSP90濃度:1μg/ml,胰島素濃度:30μg/ml)。每組n=(5n1+n2)=20只,共100只大鼠,
1.1.1 構(gòu)建2型糖尿病難愈創(chuàng)面模型:采用鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)法誘導(dǎo)2型糖尿病造模。各組提前4周高脂高糖飲食,饑餓12h后以40mg/kg腹腔注射STZ并維持高脂高糖飲食,并于注射后48h用強(qiáng)生穩(wěn)步血糖儀檢測空腹血糖(fasting blood glucose,FBG),FBG值>16.7mmol/L,體重明顯下降(>50g)為造模成功[4]。三天后補(bǔ)注STZ(以10～20mg/kg體重劑量腹腔注射),并測量FBG值。切取全層皮膚暴露肉膜為準(zhǔn)后以d=2cm的金屬環(huán)間斷縫合固定于創(chuàng)緣,防止創(chuàng)面攣縮。
1.1.2 給藥及分組:A組不涂抹任何藥物;B組為空白藥膏;C組為含有濃度1μg/ml HSP90的藥膏;D組為含有濃度30μg/ml胰島素的藥膏;E組為含有1μg/ml HSP90及30μg/ml胰島素的藥膏。各給藥組均以外用涂抹局部給藥,藥膏均勻覆蓋整個創(chuàng)面(約1g/次)為準(zhǔn)(含有藥物的藥膏均委托金花生物制藥集團(tuán)有限公司完成)。HSP90的濃度為我們參考了Li.W試驗(yàn)中用于正常創(chuàng)面的治療濃度后[3],并以15只糖尿病大鼠給予1μg/ml,5μg/ml,10μg/ml進(jìn)行了簡單的預(yù)實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)三種濃度的效果并無顯著差異,所以取最小濃度。
6941,
2實(shí)驗(yàn)過程及觀察設(shè)計(jì)
在創(chuàng)面形成后即時(shí)給予難愈創(chuàng)面藥物治療持續(xù)2天,A組則不治療,動物創(chuàng)面予以暴露。創(chuàng)面的固定環(huán)會于創(chuàng)面形成后的第10天予以摘除,因?yàn)榇藭r(shí)皮膚攣縮力量較大,會導(dǎo)致縫合線斷裂,為統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)予以摘除。并創(chuàng)面形成后第3天、第5天、第7天、第10天、第14天及第21天進(jìn)行大體觀察及活體取材做常規(guī)病理學(xué)觀察,在第3天、第5天、第7天、第10天及第14天5個時(shí)間點(diǎn)各取n1=3個標(biāo)本,而在第21天取n2=5個標(biāo)本,各標(biāo)本取材時(shí)取全層厚皮膚,保留創(chuàng)緣約1～2mm的正常皮膚。
2.1 大體觀察指標(biāo):分別于用藥后第3、5、7、10、14、21 進(jìn)行大體拍照觀察并采用ADOBE photoshop cs4 計(jì)算各時(shí)期的創(chuàng)面愈合率;
2.2 鏡下觀察指標(biāo):并于3、5、7、10、14、21天取創(chuàng)面標(biāo)本,3、5、7、10、14天每組各時(shí)間點(diǎn)3只,21天時(shí)每組5只。皮膚標(biāo)本剪成橫斷面,標(biāo)本均用1%中爾馬林固定,石蠟包埋,連續(xù)切片,分別進(jìn)行HE染色、并使用ABC法進(jìn)行HSP90的免疫組化染色。并采用image pro plus 6.0彩色圖像分析系統(tǒng), 每張切片選取5個有代表性的200倍視野,測量每個標(biāo)本HSP90陽性表達(dá)密度及積分光密度IOD值的均值并記錄。
2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì):所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS11。文中數(shù)據(jù)以均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差(x±s) 表示,并且對創(chuàng)面愈合率采用兩個獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。
3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
3.1 大鼠創(chuàng)面愈合率差異比較:各組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面愈合率比較見表1。由表可見,單獨(dú)使用HSP90(C組)及單獨(dú)使用胰島素(D組)均能夠提高創(chuàng)面的愈合率(與同期B組相比,P
3.2 各組創(chuàng)面第10天時(shí)HSP90的免疫組化對比:見圖1～5。由圖可見,聯(lián)合用藥組及正常創(chuàng)面對照組創(chuàng)面中,HSP90的陽性表達(dá)較為強(qiáng)烈。
3.3 HSP90陽性表達(dá)的比較:為更加客觀的反應(yīng)HSP90在創(chuàng)面中的陽性表達(dá)狀況我們選取平均陽性率及積分光密度作為指標(biāo)[5-6]。各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)HSP90平均陽性率(Density Mean,DM)值的比較見圖6。各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面中HSP90的平均積分光密度(Identical Optical density,IOD)的比較見圖7。
由圖6、圖7我們發(fā)現(xiàn):①在糖尿病大鼠創(chuàng)面中,HSP90的表達(dá)明顯下調(diào)(同期對照組相比,P
4討論
美國創(chuàng)面愈合協(xié)會的資料顯示大約有66%的難愈性創(chuàng)面即使經(jīng)過6個月的治療護(hù)理仍無法治愈[7],僅處理創(chuàng)面的材料每年就花費(fèi)90億美元[8]。糖尿病創(chuàng)面的治療一直是難題,表皮細(xì)胞遷移遲緩也是其發(fā)生機(jī)制的一個重要特點(diǎn)。 在糖尿病創(chuàng)面的臨床治療中,胰島素的局部應(yīng)用的療效及作用機(jī)制均得到了驗(yàn)證,這一方法也成為了臨床治療糖尿病創(chuàng)面的經(jīng)典方法。而其作用機(jī)制主要在于降低創(chuàng)面組織血糖濃度,加快糖尿病創(chuàng)面的新生毛細(xì)血管形成,促進(jìn)上皮細(xì)胞的增殖與遷移[9-10]。
2007年DR. Woodley等發(fā)現(xiàn)人表皮細(xì)胞受到缺氧刺激后,會大量分泌HSP90α,在胞外的HSP90α能夠有效促進(jìn)人表皮細(xì)胞的遷移,并將其應(yīng)用于正常創(chuàng)面,發(fā)現(xiàn)HSP90α能夠加速創(chuàng)面的再上皮化過程[3,11]。在此之前,人們對于HSP90的關(guān)注了解更多的集中在癌癥領(lǐng)域,作為重要的分子伴侶,它介導(dǎo)了多條調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、遷移的信號通路[12],并保護(hù)細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng),抵抗各類損傷帶給機(jī)體的不可逆性傷害[13]
在本實(shí)驗(yàn)中我們主要為了研究HSP90是否能夠促進(jìn)糖尿病性難愈創(chuàng)面的愈合,并觀察HSP90在糖尿病性難愈創(chuàng)面中的表達(dá),探索HSP90在創(chuàng)面中的表達(dá)是否與創(chuàng)面的愈合速率有關(guān)聯(lián)。我們的研究發(fā)現(xiàn):在大體觀察下,①外源性給予糖尿病性難愈創(chuàng)面HSP90,同期的創(chuàng)面愈合率有所提高(與同期空白組相比,P0.05)。僅從大體實(shí)驗(yàn)的觀察結(jié)果我們認(rèn)為,創(chuàng)面中HSP90的表達(dá)與糖尿病難愈創(chuàng)面的愈合是存在相關(guān)性的。在鏡下觀察,我們發(fā)現(xiàn):①糖尿病性難愈創(chuàng)面的高糖微環(huán)境明顯抑制了HSP90的表達(dá)(空白組與同期對照組相比,P
分析結(jié)果我們認(rèn)為,高糖環(huán)境會降低HSP90在創(chuàng)面中的表達(dá),減弱HSP90對細(xì)胞的保護(hù)作用。并且創(chuàng)面中HSP90的表達(dá)高低與創(chuàng)面的愈合速率具有相關(guān)性。雖然無論是局部給予胰島素改善高糖微環(huán)境,還是局部應(yīng)用HSP90提高創(chuàng)面中HSP90的表達(dá),均能夠提高糖尿病性難愈創(chuàng)面的愈合率,但是我們發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應(yīng)用后糖尿病性難愈創(chuàng)面的愈合效果最好。據(jù)此我們認(rèn)為,胰島素改善了糖尿病性難愈創(chuàng)面的局部微環(huán)境,有利于創(chuàng)面中HSP90的表達(dá)提高,進(jìn)一步局部給予HSP90,提高創(chuàng)面中HSP90的含量,從而激活部分HSP90參與調(diào)控的信號通路,提高創(chuàng)面中各類生長因子的表達(dá),促進(jìn)了糖尿病性難愈創(chuàng)面的愈合。
然而,我們的研究尚屬淺顯,對于HSP90在糖尿病創(chuàng)面愈合過程中的作用機(jī)制也未進(jìn)行研究。但是,依然為我們尋找糖尿病創(chuàng)面的治療方向提供了一個具有臨床應(yīng)用意義的思路。下一步,我們會對HSP90在糖尿病性難愈創(chuàng)面的作用機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的研究,探索HSP90在糖尿病性難愈創(chuàng)面中所調(diào)控的與創(chuàng)面愈合密切相關(guān)的生長因子與細(xì)胞外基質(zhì)的變化。并且HSP90的提取目前還很昂貴,所以進(jìn)一步尋找到其穩(wěn)定的上游信號分子或?qū)ふ乙环N能夠有效且廉價(jià)的提取HSP90的方法會成為我們今后的研究方向。
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【關(guān)鍵詞】 子宮內(nèi)膜
關(guān)鍵詞: 子宮內(nèi)膜;熱休克蛋白;免疫組織化學(xué);圖像分析
摘 要:目的 探討不同子宮內(nèi)膜中熱休克蛋白（HSP）70和90表達(dá)與ER表達(dá)的關(guān)系. 方法 用免疫組化Envision法和圖像分析儀檢測了30例正常子宮內(nèi)膜、30例增生過長子宮內(nèi)膜和53例子宮內(nèi)膜癌中HSP70、HSP90和雌激素受體（ER）的表達(dá). 結(jié)果 增生期內(nèi)膜中HSP90和ER的表達(dá)（62.1±6.0）%和（67.80±4.2）%，明顯強(qiáng)于分泌期內(nèi)膜（42.0±5.2）%和（40.2±7.8）%，P
Keywords:endometrial carcinoma;heat shock protein;im-munohistochemistry;imaging analysis system
Abstract:AIM To investigate the expression of heat shock protein70，90in different endometrium and the correlation between HSP70，90and ER status.METHODS Thirty sam-ples of normal endometrium，30samples of endometrial hy-perplasia and53samples of endometrial carcinoma taken from Xijing Hospital were examined for HSP70，90and ER expres-sion by using Envision immunohistochemical analysis and computerized imaging analysis system.RESULTS Expres-sion of HSP90and ER in proliferative phase（62.1±6.0）%，and（67.8±4.2）%is stronger than in secretory phase of normal endometrium（42.0±5.3）%and（40.2±7.8）%，P
0 引言
子宮內(nèi)膜增生過長和子宮內(nèi)膜癌常見，但其分子病理學(xué)改變卻知之甚少.熱休克蛋白（HSP）是一組高度保守的伴侶蛋白，HSP70，HSP90在人類子宮內(nèi)膜中均有表達(dá)，受甾體激素調(diào)節(jié)，與甾體激素受體如雌激素受體（ER）及孕激素受體（PR）表達(dá)有關(guān).我們采用免疫組化法和圖像分析法探討不同子宮內(nèi)膜中HSP70，90表達(dá)與ER表達(dá)的關(guān)系.
1 材料和方法
1.1 材料 1999-01/2001-12西京醫(yī)院病理科子宮切除和內(nèi)膜刮除正常內(nèi)膜30例（增生、分泌期各15例），增生過長內(nèi)膜30例（簡單型20例，復(fù)雜型10例），子宮內(nèi)膜樣癌53例（病理分級:Ⅰ級30例，Ⅱ級14例，Ⅲ級9例;組織學(xué)類型:內(nèi)膜樣腺癌39例，非內(nèi)膜樣腺癌14例;臨床分期:Ⅰ/Ⅱ期42例，Ⅲ/Ⅳ期11例），所有標(biāo)本診斷均經(jīng)組織病理學(xué)證實(shí).標(biāo)本蠟塊，連續(xù)切片，厚5μm.兔抗人HSP70，HSP90多克隆抗體為美國Maxin Biotech Inc產(chǎn)品，小鼠抗人ER單克隆抗體為美國Antibody Diagnostica Inc產(chǎn)品，山羊抗兔Envision二抗為美國Dako公司產(chǎn)品.
1.2 方法 石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇致水，磷酸鹽緩沖生理鹽水（PBS，pH=7.2）沖洗.微波爐0.01mol?L-1 枸櫞酸鈉緩沖液（pH=6.0）行抗原修復(fù)（5min×2次），自然冷卻.30g?L-1 過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶，室溫，30min.正常山羊血清封閉非特異性抗原，室溫，10min，濾紙吸去封閉血清.兔抗人HSP70，90抗體，小鼠抗人ER抗體，37℃，120min.山羊抗兔Envision二抗，37℃，30min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染、脫水、透明、樹膠封片.陽性對照采用已知陽性結(jié)果的肝癌切片，陰性對照用PBS代替一抗.用Leica Q500Mc圖像分析儀測陽性結(jié)果的相對染色強(qiáng)度，每張片子選5個高倍視野（×200），以顏色為標(biāo)準(zhǔn)作圖像分割，測陽性結(jié)果的相對不透光度（%）.結(jié)果用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件處理.
2 結(jié)果
2.1 子宮內(nèi)膜HSP，ER的表達(dá) HSPs陽性信號為上皮和基質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)和/或胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，ER陽性信號為上皮和/或基質(zhì)細(xì)胞的胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，陽性細(xì)胞呈局灶性或彌漫性分布（Fig1）.增生期內(nèi)膜中HSP90，ER表達(dá)（62.1±6.0）%和（67.80±4.2）%，明顯強(qiáng)于分泌期內(nèi)膜（42.0±5.2）%和（40.2±7.8）%，P
2.2 子宮內(nèi)膜癌中HSPs表達(dá)與臨床病理學(xué)指標(biāo)的關(guān)系 內(nèi)膜癌中HSP70表達(dá)隨病理分級升高而表達(dá)增強(qiáng)（48.2±5.0）%，（62.7±4.3）%和（75.2±2.8）%，P
3 討論
HSPs是一組具有重要生理功能高度保守的糖蛋白超基因家族，生理、病理及環(huán)境因素均可誘導(dǎo)HSPs的產(chǎn)生，對細(xì)胞的生存起保護(hù)作用［1-4］ .研究表明，HSPs與細(xì)胞的增生、分化、瘤變及凋亡等生長過程有關(guān)［5-9］ .有關(guān)子宮內(nèi)膜中HSPs與ER表達(dá)關(guān)系的研究國內(nèi)外報(bào)道不多.有報(bào)道指出:HSP90可促進(jìn)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞增生，子宮內(nèi)膜癌中HSP70，90表達(dá)與內(nèi)膜癌組織學(xué)類型和性激素受體表達(dá)顯著相關(guān)［10］ .我們的研究表明，HSP70，90在增生期、分泌期子宮內(nèi)膜中都有表達(dá)，增生期子宮內(nèi)膜中HSP90表達(dá)強(qiáng)于分泌期內(nèi)膜，增生過長內(nèi)膜中表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)，分泌期內(nèi)膜中HSP70表達(dá)強(qiáng)于增生期內(nèi)膜.說明HSP70，90在子宮內(nèi)膜的增生分泌中均起一定作用，HSP90可能促進(jìn)子宮內(nèi)膜增生，HSP70主要與子宮內(nèi)膜的分泌活動有關(guān).
圖1 略
內(nèi)膜癌中HSP70，90表達(dá)有明顯變化，內(nèi)膜癌中HSP90表達(dá)較正常內(nèi)膜和增生過長內(nèi)膜減弱，HSP70表達(dá)反而增強(qiáng)，說明HSP70可能對內(nèi)膜癌變有促進(jìn)作用，而HSP90對內(nèi)膜癌變有一定的保護(hù)作用.內(nèi)膜癌中HSP90隨腫瘤分級升高而減弱，HSP70隨腫瘤分級升高而增強(qiáng)，內(nèi)膜樣癌中HSP70表達(dá)較非內(nèi)膜樣癌中弱，而HSP90較非內(nèi)膜樣癌強(qiáng).腫瘤細(xì)胞分級及組織學(xué)類型和患者的預(yù)后是密切相關(guān)的:子宮內(nèi)膜癌患者5a存活率隨腫瘤細(xì)胞分級升高而明顯降低，腺鱗癌、透亮細(xì)胞癌和漿液性狀腺癌等較內(nèi)膜樣癌預(yù)后差［11］ ，說明預(yù)后差的腫瘤中HSP70表達(dá)強(qiáng)，HSP90表達(dá)弱.預(yù)后差的腫瘤細(xì)胞生長速度快而凋亡少，細(xì)胞分化程度低，說明HSP70過表達(dá)對癌細(xì)胞分化和凋亡有抑制作用，HSP90作用可能相反.113例子宮內(nèi)膜HSP70，90與ER表達(dá)的相關(guān)性分析表明，HSP90表達(dá)與ER表達(dá)成正相關(guān)，HSP70表達(dá)與ER表達(dá)成負(fù)相關(guān).子宮內(nèi)膜增生過長和內(nèi)膜癌的發(fā)生及內(nèi)分泌治療效果與雌激素作用和ER表達(dá)有關(guān).故研究子宮內(nèi)膜中HSPs表達(dá)對探討內(nèi)膜生長規(guī)律及病變機(jī)制、改善治療措施及治療效果等方面將有很大的指導(dǎo)意義.
圖2 － 圖4 略
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[主題詞] 電針;心臟外科手術(shù);熱休克蛋白質(zhì)類/代謝;RNA,信使/代謝
Effects of Electroacupuncture on Myocardial Cellular HSP70mRNA Gene Expression in Patients Undergoing Cardiac Surgery
Wang Xiangrui1,Zhang Tengfei2,Ma Shuliang1,et al(1. Renji Hospital Affiliated to Shanghai Second Medical University,Shanghai 200127;2. Teaching and Research Section of Biochemistry,Shanghai Second Medical University)
[Abstract] Purpose To observe the effect of electroacupuncture on myocardial cellular HSP70mRNA gene expression in patients undergoing cardiac surgery(ASD).Methods 28 ASD patients were randomly divided into 3 groups,i,e,acupuncture anesthesia group(groupⅠ,n=6),acupuncture combined with general anesthesia group(group Ⅱ,n=10) and general anesthesia group(groupⅢ,n=9).The sample from left atrium at 10 min before CPB,stopping CPB,30 min and 1 h after stopping CPB.Extration of total RNA from myocardial tissue using Reagent Kit.The concentration of mRNA was measured through RTPCR and CKMB was detected.Results After CPB CKMB in the three groups was significantly higher than the value of 10 min before CPB,and CKMB in the group Ⅲ was remarkedly higher than the group Ⅰ and Ⅱ;HSP70mRNA expression was found to be higher in the group Ⅰ than that of group Ⅲ at 30 min and 1 h after stopping CPB.Conclusion Electroacupuncture can induce the expression of HSP70mRNA in ischemic myocardial tissue of patients undergoing cardiac surgery.
[Key words] Electroacupuncture;Heart Surgery;RNA,Massenger/metab;HeatShock Proteins/metab;Myocardium/metab
體外循環(huán)心臟手術(shù)術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生率與術(shù)中心肌缺血、缺氧的保護(hù)有明顯關(guān)系[1]。除采用低溫、不同成份灌注液的冠脈灌注等方法外,近年發(fā)現(xiàn)機(jī)體有自身的保護(hù)機(jī)制,心肌缺血、缺氧后誘導(dǎo)心肌內(nèi)應(yīng)激蛋白增加,從而增強(qiáng)機(jī)體抗御缺血的能力。筆者發(fā)現(xiàn)針刺麻醉病人術(shù)后恢復(fù)快,并發(fā)癥少。為探討針刺對心臟功能的調(diào)節(jié)作用[2],本文觀察針刺對心臟手術(shù)病人心肌細(xì)胞熱休克蛋白mRNA基因表達(dá)的影響,初步分析兩者之間的相互關(guān)系。
1 資料和方法
1.1 一般資料
隨機(jī)選擇房間隔缺損修補(bǔ)術(shù)(ASD)28例,分針麻組(組 Ⅰ)6例,男 女各3例,年齡26.0±5.3歲;針刺加全麻組(組 Ⅱ)10例,男4例,女6例,年齡27.1±7.4 歲;全麻組(組 Ⅲ)9例,男5例,女4例,年齡26.8±5.4歲。各組病人術(shù)前心功能 Ⅰ ～Ⅱ級。
1.2 麻醉方法
針刺穴位取雙側(cè)內(nèi)關(guān)、列缺、云門,進(jìn)針后接G 6805針麻刺激儀,脈沖頻率為3～4 Hz,電流量以病人舒適為度,誘導(dǎo)時(shí)間20～30 min,體外循環(huán)肝素化時(shí),留針停止刺激,待魚精蛋白中和肝素后恢復(fù)刺激。
全麻組病人術(shù)前用藥為肌注苯巴比妥鈉0.1 g,哌替啶50 mg,東莨菪堿0.3 mg,麻醉誘導(dǎo)安定0.1 mg/kg,維庫溴銨0.25 mg/kg,依托咪酯0.2 mg/kg,芬太尼5 μg/kg,麻醉維持吸入異氟醚,間斷靜注芬太尼和維庫溴銨。
1.3 標(biāo)本采集
上腔靜脈插管前(轉(zhuǎn)流前10 min),停心肺轉(zhuǎn)流機(jī)和停機(jī)后30 min,1 h分別自右心耳剪下1 mm×1 mm×1 mm標(biāo)本。體外循環(huán)機(jī)最大轉(zhuǎn)速4 L/min,最低溫度針麻組26.02±0.12 ℃,針刺加全麻組23.41±1.52 ℃,全麻組 22.92±1.65 ℃。
1.4 HSP70mRNA的分離提取
應(yīng)用Reagent抽取組織總RNA,通過勻漿化、分離、洗滌、溶解、沉淀分離總RNA,紫外分光光度儀測定RNA濃度,加入隨機(jī)引物和探針,經(jīng)RTPCR擴(kuò)增后,溴芬蘭染色在0.8%膠走電泳,以123 Mark標(biāo)記分子量。顯色后斑點(diǎn)雜交膜用密度掃描儀(島津CS920型)對HSP70mRNA進(jìn)行定量。
1.5 心肌酶譜CKMB測定
自右頸內(nèi)靜脈導(dǎo)管抽取近右心房處血標(biāo)本,采用日立7150全自動分析儀測定肌酸磷酸激酶同功酶(CKMB)。
1.6 術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生率
術(shù)后低血壓、循環(huán)功能不穩(wěn)定者所應(yīng)用血管活性藥物發(fā)生率和每人平均用量;神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥,包括腦栓塞、腦出血、意識功能障礙;腎功能不全監(jiān)測、少尿、無尿及術(shù)中知曉發(fā)生率。
1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
各時(shí)點(diǎn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。各數(shù)值輸入SAS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。組內(nèi)各數(shù)據(jù)采用配對t檢驗(yàn),組間各數(shù)據(jù)采用方差分析。
2 結(jié)果
2.1 3組病人體外循環(huán)轉(zhuǎn)流前后CKMB的變化
3組病人停轉(zhuǎn)流和轉(zhuǎn)流后1 h CKMB均較轉(zhuǎn)流前明顯增高(P
2.2 3組HSP70mRNA含量的比較
通過斑點(diǎn)切跡雜交顯色,可見針刺組HSP70mRNA表達(dá)高于對照組,斑點(diǎn)切跡經(jīng)薄層掃描儀定量,其密度值見表2。
2.3 CKMB與HSP70mRNA含量之間的關(guān)系
停轉(zhuǎn)流1 h時(shí),組ⅠHSP70mRNA增高39.7%, CKMB增高272.7%,組ⅢHSP70mRNA增高10.3%,CKMB增高696.6%,HSP70mRNA基因表達(dá)率增加與CKMB增加的幅度相關(guān),HSP70mRNA明顯增加,CKMB的增幅明顯下降。
2.4 術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生率
組Ⅲ術(shù)后1天循環(huán)功能不穩(wěn)定需用血管活性藥物5例,占總數(shù)31.0%;神經(jīng)意識障礙、腦栓塞2例,占14.4%;平均術(shù)后恢復(fù)天數(shù)5.41±0.82天,均明顯高于組Ⅰ和組Ⅱ(P
3 討論
當(dāng)機(jī)體受到應(yīng)激因子刺激,組織細(xì)胞可產(chǎn)生應(yīng)激蛋白,對機(jī)體產(chǎn)生自身保護(hù)作用,熱休克蛋白屬一類應(yīng)激蛋白,包括HSP90,HSP70,HSP60和HSP27等類型,參與組織蛋白質(zhì)折疊和復(fù)合物的形成[3]。
近年對HSP70的研究較為詳細(xì),HSP70家族至少包括4種同分異構(gòu)體,HSP75,78為葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白,前者存在于線粒體,后者存在于肌漿網(wǎng),HSP為存在于胞漿中的非應(yīng)激蛋白,HSP72在非應(yīng)激狀態(tài)下不存在于細(xì)胞中,而在各種引起細(xì)胞蛋白損傷因素(缺血、熱、缺氧、代謝抑制、乙醇、蛋白變性等)存在時(shí)迅速合成。減輕心肌缺血再灌注損傷,提高缺血后心臟的機(jī)械功能,有利于ATP的保存和保護(hù)線粒體功能[4],心功能的恢復(fù)與HSPmRNA表達(dá)和HSP70的含量有關(guān)[5]。
心肌缺血再灌注損傷的主要原因之一是氧自由基產(chǎn)生,損傷細(xì)胞膜,破壞細(xì)胞核和核糖蛋白,抑制細(xì)胞酶系統(tǒng),影響細(xì)胞功能[6,7]。熱休克蛋白能減少氧自由基釋放,穩(wěn)定細(xì)胞膜和溶酶體膜,防止蛋白質(zhì)變性,減輕心肌的缺血再灌注損傷。
本研究結(jié)果表明針麻組和針刺加全麻組停心肺轉(zhuǎn)流和停轉(zhuǎn)流后1 h HSP70mRNA基因和HSP70含量高于單純?nèi)榻M病人。因而針刺對心肌細(xì)胞熱休克蛋白mRNA基因表達(dá)有一定的增強(qiáng)作用。分析3組病例熱休克蛋白mRNA基因表達(dá)與反映心肌缺血酶指標(biāo)之間的關(guān)系可見,針刺組和針刺加全麻組,轉(zhuǎn)流后熱休克蛋白mRNA表達(dá)高于全麻組,而CKMB指標(biāo)的增高幅度則小于全麻組,表明針刺對心臟手術(shù)病人的心肌缺血有一定保護(hù)作用。其中增強(qiáng)術(shù)中熱休克蛋白的基因表達(dá),減少氧自由基生成可能是針刺增加心肌對缺血心肌的保護(hù)作用機(jī)制之一。在心臟外科領(lǐng)域,如能通過不同方法誘導(dǎo)心肌HSP70mRNA的表達(dá),對于減輕心肌的缺血再灌注損傷,改善心臟手術(shù)的預(yù)后具有一定的臨床意義。
術(shù)后并發(fā)癥的統(tǒng)計(jì)表明,全麻組術(shù)后2天以內(nèi),由于循環(huán)功能不穩(wěn)定者需用血管活性藥物占31.0%,精神神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥占14.4%,全麻輔助針刺和針麻病人術(shù)后均未應(yīng)用血管活性藥物,未見神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥。雖然針麻體外循環(huán)病人轉(zhuǎn)流中最低溫度較其它兩組要高,但術(shù)中心臟全部自動復(fù)跳,明顯高于全麻組病人,表明針刺有助于減輕全麻藥對循環(huán)系統(tǒng)的抑制作用,通過內(nèi)在的調(diào)節(jié)機(jī)制增強(qiáng)心肌對缺血缺氧的耐受性。
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【關(guān)鍵詞】 心肌間質(zhì)
Effects of heat shock protein 70 on immature myocardium and myocardial interstitium in rabbits
【Abstract】 AIM: To investigate the protective effects of heat shock protein 70 (HSP70) on immature myocardium and myocardial interstitium. METHODS: Isolated working rabbit heart model was used in this study. Twelve rabbits (aged 14-21 days) were randomly pided into 2 groups: Control group (C) undergoing 45 min ischemia followed by 45 min reperfusion after distilled water was injected by intraperitoneum 24 h later， and experimental group (E) undergoing 45 min ischemia followed by 45 min reperfusion after norepinephrine was injected by intraperitoneum 24 h later. The HSP70 content， lactate dehydrogenase (LDH) and creatine kinase (CK) leakage， adenosine triphosphate (ATP) and malondialdehyde (MDA) content， superoxide dismutase (SOD) activity， hydroxyproline (HP) and endothelin (ET) content， myocardial cell Ca2+ content， Ca2+ATPase activity of mitothondia (［Ca2+ATPase］m) and its Ca2+ content (［Ca2+］m)， synthesizing ATP activity of mitochondria(［ATP］m) and myocardial ultrastructure were tested. RESULTS: The cardiac function recovery was better in E group than C group (P
【Keywords】 heat shock protein 70; immature myocardium; myocardial interstitium; cardioprotection
【摘要】 目的: 探討熱休克蛋白70(HSP70)對未成熟心肌和心肌間質(zhì)的影響. 方法：健康新生長耳大白兔12只隨機(jī)分為2組. 對照組(C組)：ip生理鹽水0.4 mL，24 h后取離體心臟，常規(guī)建立Langendorff離體心臟灌注模型，灌注15 min轉(zhuǎn)為工作心15 min后停灌45 min，恢復(fù)灌注15 min改為工作心30 min；實(shí)驗(yàn)組(E組)：ip去甲腎上腺素， 24 h后取離體心臟，方法同對照組. 測定心肌細(xì)胞中HSP70含量、血流動力學(xué)指標(biāo)、心肌含水量（MWC）、心肌肌酸激酶（CK）和乳酸脫氫酶（LDH）漏出率、三磷酸腺苷(ATP)含量、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛(MDA)含量、心肌組織羥脯氨酸（HP）含量、內(nèi)皮素(ET) 含量、心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量、心肌線粒體Ca2+ATPase活性及其Ca2+含量、心肌線粒體合成ATP能力［ATP］m，心肌超微結(jié)構(gòu). 結(jié)果：E組HSP70含量明顯高于C組(P
【關(guān)鍵詞】 熱休克蛋白70;未成熟心肌;心肌間質(zhì);心肌保護(hù)
0引言
1988年Currie等［1］證實(shí)在某些非致死性應(yīng)激（如高溫，缺血再灌注）條件下能誘導(dǎo)合成熱休克蛋白（heat shock proteins， HSP）能提高對應(yīng)激的耐受力，其中HSP70家族倍受重視. 在成熟心肌中，人們通過各種方式能誘導(dǎo)HSP70表達(dá)增強(qiáng)了心肌的抗損傷能力. 然而在未成熟中，人們對心肌HSP70表達(dá)及抗損傷能力并不清楚. 我們觀察ip重酒石酸去甲腎上腺素誘導(dǎo)HSP70在未成熟心肌中的表達(dá)對缺血再灌注時(shí)心肌的影響.
1材料和方法
1.1材料
出生14~21 d的健康新生長耳大白兔12只，隨機(jī)等分為2組：實(shí)驗(yàn)組(E組)和對照組（C組）. 對照組ip生理鹽水0.4 mL后24 h取離體心臟，常規(guī)建立Langendorff模型，灌注15 min轉(zhuǎn)為工作心15 min后停灌45 min，恢復(fù)灌注15 min改為工作心30 min；實(shí)驗(yàn)組，重酒石酸去甲腎上腺素(溶于生理鹽水中)3.1 μmol/kg (0.53 mg/kg) ip后24 h取離體心臟，方法同對照組.
1.2方法
兔心臟跳動穩(wěn)定后，記錄心率(heart rate， HR)、主動脈流量(aortic flow， AF)、冠狀動脈流量(coronary flow， CF)、心排出量(cardiac output， CO)、左心室收縮壓(left ventricular systolic pressure， LVSP)、左心室舒張末壓(left ventricular enddiastolic pressure， LVEDP)、左心室內(nèi)壓上升最大速率(+dp/dtmax)、左心室內(nèi)壓下降最大速率(-dp/dtmax)等，以持續(xù)停灌前工作心基礎(chǔ)水平為100%，比較復(fù)灌末心功能恢復(fù)的百分率. 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取標(biāo)本測心肌含水量(myocardial water content， MWC)、心肌肌酸激酶(creatine kinase， CK)和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase， LDH) 15 min漏出率、心肌組織三磷酸腺苷（ATP）含量(熒光素酶法)、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛(MDA)含量 (化學(xué)比色法，試劑盒購自南京聚力生物工程研究所)、心肌組織羥脯氨酸（hydroxyproline， HP）含量、內(nèi)皮素(endothelin， ET) 含量、心肌線粒體Ca2+ATPase活性及其Ca2+含量、心肌線粒體合成ATP能力［ATP］m、心肌超微結(jié)構(gòu)等. 采用Western blot法測定心肌細(xì)胞中HSP70含量. 用2×SDS樣品緩沖液裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞蛋白質(zhì)，經(jīng)SDSPAGE分離后迅速轉(zhuǎn)移至尼龍膜，按文獻(xiàn)［2］加入抗HSP70 mAb（1∶1000）及堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗小鼠IgG（1∶1000），用硝基藍(lán)四氮唑/溴氯吲哚磷酸鹽（NBT/BCIP）顯色.
統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有數(shù)據(jù)以x±s表示，采用t檢驗(yàn). P
2結(jié)果
2.1血流動力學(xué)指標(biāo)E組與C組比較，HR，AF恢復(fù)率差異無顯著性，CF，CO，LVSP，LVEDP，+dp/dtmax和-dp/dtmax差異有顯著性(P
2.2生化指標(biāo)E組MWC低于C組(P
表4心肌線粒體Ca2+ATPase活性、Ca2+含量及合成ATP能力（略）
轉(zhuǎn)貼于
2.3心肌超微結(jié)構(gòu)C組：線粒體腫脹明顯，部分呈空泡狀融合并溢出細(xì)胞外，線粒體嵴溶解明顯；肌絲排列紊亂、溶解(Fig 2A). E組：線粒體輕度腫脹，偶有線粒體呈空泡狀，線粒體嵴排列尚整齊、密度無增高；肌絲排列整齊(Fig 2B).
3討論
HSPs有多個家族，其中HSP70家族（Mr 66 000~78 000）是最豐富的HSPs，HSP70家族是一類最保守和最重要的熱休克蛋白家族，在心肌保護(hù)中起重要作用. HSP70參與蛋白質(zhì)的折疊和伸展、多聚復(fù)合物的裝配以及蛋白質(zhì)在胞質(zhì)與細(xì)胞器之間的移位等. 已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)HSP70誘導(dǎo)總量（或表達(dá)）與心肌缺血、壞死的范圍及程度呈負(fù)相關(guān)［3］. HSP70具有幫助蛋白質(zhì)完成細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移的功能(分子伴侶功能)［4］. 在應(yīng)激狀態(tài)下HSP穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)變性的蛋白質(zhì)，有利于它們的消除和修復(fù)，從而在應(yīng)激狀態(tài)下起到保護(hù)和恢復(fù)細(xì)胞功能的作用，其解離過程需要ATP參與. HSP70也是一種類固醇激素受體結(jié)合蛋白［5］，類固醇激素受體可以與HSP70結(jié)合，結(jié)合后HSP70將此受體由胞質(zhì)運(yùn)送到細(xì)胞核中，發(fā)揮受體的作用.
在心肌組織，熱休克處理后，無論成熟的或未成熟的心肌細(xì)胞都能合成HSP70 ［6］. 許多應(yīng)激原如缺血、缺氧、壓力或容量負(fù)荷、重金屬、藥物［7］等和熱應(yīng)激一樣，在心肌細(xì)胞中都能誘導(dǎo)HSP70表達(dá)，對抗缺血后再灌注損傷. 在冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞同樣也可以誘導(dǎo)HSP70的表達(dá)［8］，發(fā)揮心肌抗缺血后再灌注損傷作用. 研究證實(shí)，5′核苷酸酶活性增強(qiáng)在心肌HSP70抗缺血后再灌注損傷中起重要作用［9］，經(jīng)過熱預(yù)處理或缺血預(yù)處理的心肌同樣表達(dá)HSP70，與缺血預(yù)處理一樣具有心肌保護(hù)作用［10］. 近來研究表明，HSP70的表達(dá)與蛋白激酶C(protein kinase C， PKC)激活密切有關(guān)［11］，心肌保護(hù)作用與HSP70減少線粒體損傷相關(guān)［12］. 我們的實(shí)驗(yàn)通過ip重酒石酸去甲腎上腺素誘導(dǎo)心肌HSP70表達(dá). 結(jié)果顯示，ip 24 h后HSP70蛋白表達(dá)明顯增多. 離體心臟實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與C組比較，E組在再灌注期間，左室的舒縮功能明顯改善，LDH， CK和ET的漏出率及MDA含量減少，心肌水腫減輕，ATP， HP含量及SOD活性增高，E組心肌細(xì)胞內(nèi)、線粒體內(nèi)Ca2+明顯含量減少，線粒體ATP合成能力和心肌線粒體Ca2+ATPase活性較C組明顯增加，心肌超微結(jié)構(gòu)損傷明顯輕于C組，證實(shí)HSP70的表達(dá)對缺血再灌注未成熟心肌功能和形態(tài)具有明顯的保護(hù)效應(yīng).
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方法 搜集2013年7月至2015年8月經(jīng)病理證實(shí)為HCC的患者62例，所有病例術(shù)前行CT平掃及3期增強(qiáng)掃描，通過對比患者術(shù)前CT表現(xiàn)與術(shù)后癌組織GPC-3，HSP70的表達(dá)水平、病理分級，統(tǒng)計(jì)分析其是否存在相關(guān)關(guān)系。
結(jié)果 本研究62例HCC患者中肝癌的大小、動脈期血管強(qiáng)化及肝癌的供血類型與GPC-3表達(dá)水平存在相關(guān)性，不同供血類型的肝癌HSP70的表達(dá)水平存在差異；肝癌的大小、邊緣、瘤內(nèi)出血壞死與其病理分化程度相關(guān)；肝癌的病理分化程度越低GPC-3及HSP70的表達(dá)水平越高。
結(jié)論 肝癌的CT征象可在一定程度上反映癌組織GPC-3及HSP70的表達(dá)情況及肝癌的病理分化程度，GPC-3和HSP70表達(dá)水平與肝癌的病理分級相關(guān)。
【關(guān)鍵詞】 肝細(xì)胞肝癌； 病理分級； 磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3； 熱休克蛋白70
中圖分類號：R735.7 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2017.03.005
【Abstract】 Objective To investigate the correlation of preoperative CT findings between expressions and pathological grade of postoperative glypican-3（GPC-3） and heat shock proteins 70（HSP70） protein in hepatocellular carcinoma（HCC）.
Methods A total of 62 cases who were pathologically proved with HCC from July，2013 to August，2015 were enrolled in this study.All cases underwent CT plain scan and 3 phase enhanced scanning before operation.And by comparing preoperative CT findings and the expression levels of postoperative GPC-3，HSP70 and pathological grade，whether there was a correlation between them was counted and analyzed.
Results In this study，the size of liver cancer，arterial blood vessels and blood supply type of liver cancer were correlated with GPC-3 expression levels in 62 cases of HCC patients，and the expression level of HSP70 in HCC with different blood supply types was different.The size，margin，intratumoral hemorrhage and necrosis of HCC were correlated with the degree of pathological differentiation.In addition，the lower the degree of pathological differentiation，the higher the expression level of GPC-3 and HSP70.
Conclusion CT findings of HCC can reflect the expression of GPC-3，HSP70 and liver pathological differentiation in a certain extent，and the expression level of GPC-3 and HSP70 were correlated with HCC pathological grading.
【Key words】 HCC；pathological grade；GPC-3；HSP70
肝胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）在我國發(fā)病率較高，最新統(tǒng)計(jì)資料顯示，肝癌發(fā)病率位于肺癌和胃癌后排第三位，而其所致的男性惡性腫瘤死亡率僅次于肺癌[1]。CT是目前肝癌診斷的重要影像學(xué)方法，不僅可以觀察肝癌的形態(tài)、大小及其對周圍鄰近組織的關(guān)系，更能通過增強(qiáng)掃描的方法來觀察肝癌的血供狀況，對肝癌的檢出、定性、分期及治療后復(fù)查具有重要意義[2]。病理學(xué)檢查是診斷肝癌的金標(biāo)準(zhǔn)，而免疫組織化學(xué)是診斷肝癌的重要輔助手段。磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3 （Glypican-3， GPC-3）及熱休克蛋白70（Heat shock proteins 70， HSP70）是肝癌診斷的代表性免疫組織化學(xué)標(biāo)志物之一，近些年來，多個研究結(jié)果都表明GPC-3及HSP70在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中都扮演了重要的角色[3～5]。筆者擬通過研究HCC的CT表現(xiàn)與癌組織中GPC-3、HSP70表達(dá)及病理分級的關(guān)系，為肝癌的診斷、治療及預(yù)后評估提供更多信息。
1 資料與方法
1.1 一般資料
搜集右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2013年7月至2015年8月病理科確診為HCC的患者62例，其中男性52例，女性10例，年齡22～76歲，平均年齡49.74歲。所有病例術(shù)前行CT平掃及3期增強(qiáng)掃描，未接受放化療、腫瘤靶向治療等非手術(shù)治療，粒子植入、碘油栓塞等介入治療。術(shù)后用免疫組織化學(xué)法分析癌組織GPC-3及HSP70表達(dá)情況。本研究所有病例均有完整的隨訪資料。
1.2 CT檢查及征象判斷方法
CT檢查方法：采用GE Highspeed N x/I或西門子Definite AS 128層螺旋CT掃描儀。常規(guī)進(jìn)行胃腸道準(zhǔn)備，先平掃，增強(qiáng)掃描對比劑用優(yōu)維顯（300 mgI/ml）80～100 ml，注射速率3～3.5 ml/s，注射對比劑后分別行動脈期（30 s）、門靜脈期（65 s）和平衡期掃描（120 s）。CT征象判斷方法：參照陸玉敏等[6]的標(biāo)準(zhǔn)對腫瘤直徑分為小肝癌組（≤3 cm）和大肝癌組（>3 cm）。腫瘤邊緣分為清楚和模糊兩組。根據(jù)腫瘤內(nèi)是否有平掃低或高密度、增強(qiáng)或無強(qiáng)化改變分為有出血壞死和無出血壞死兩組。肝內(nèi)或肝外侵襲轉(zhuǎn)移分為有侵襲轉(zhuǎn)移組和無侵襲轉(zhuǎn)移組。結(jié)合黃娟等人[7]的研究將其分為：肝動脈供血型、門靜脈供血型、肝動脈及門靜}雙重供血型和少血供型。
1.3 病理檢查及判斷方法
將所有62例標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，切片厚度3 μm，行S-P法免疫組織化學(xué)染色，鼠抗人GPC-3及HSP70抗體即用型，所用試劑盒購自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司，染色步驟按說明書進(jìn)行。陽性結(jié)果的判讀：綜合考慮免疫組化染色強(qiáng)度和細(xì)胞染色陽性率，每張染色切片隨機(jī)選取 5 個染色均勻的高倍視野（×400），取平均數(shù)。判定標(biāo)準(zhǔn)：染色強(qiáng)度按無色、淡黃色、棕黃色、棕褐色分別計(jì)為0分、1分、2分、3分；陽性細(xì)胞按無陽性細(xì)胞、陽性細(xì)胞比例≤25%、26%～50%、51%～75%、>75% 分別計(jì)為0分、1分、2分、3分、4分。染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比的乘積3且≤6者（+），>6且≤9者（++），>9且≤12者（+++）。HCC的病理分級采用國際上常用的Edmondson-Steiner分級法：I級：癌細(xì)胞形態(tài)似正常肝細(xì)胞，核圓而規(guī)則，核仁明顯，核分裂象少，核漿比例接近正常；Ⅱ級：癌細(xì)胞略異型，胞質(zhì)嗜酸性和顆粒性強(qiáng)，胞核較大，核著色深淺不一，核仁明顯，核漿比例接近正常或略增大；Ⅲ級：癌細(xì)胞異形明顯，胞質(zhì)呈嗜堿性著色，核大而不規(guī)則，核染色質(zhì)粗，著色不一致，核仁明顯，核分裂象多；Ⅳ級：癌細(xì)胞形態(tài)變異大，可呈梭形或多形性巨細(xì)胞或小細(xì)胞，核大，核仁不規(guī)則，核漿比例明顯增大。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料組間比較用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較用卡方檢驗(yàn)，等級資料比較用秩和檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05， 雙側(cè)檢驗(yàn)。
2 結(jié) 果
2.1 肝癌CT表現(xiàn)及病理分級與GPC-3、HSP70表達(dá)的關(guān)系 本組62例HCC患者CT表現(xiàn)中，小肝癌組10例，大肝癌組52例；邊緣清楚者32例，邊緣模糊者（圖1A）30例；有壞死者41例，無壞死者20例，腫瘤內(nèi)出血者1例；有侵襲轉(zhuǎn)移8例，無侵襲轉(zhuǎn)移54例，有動脈期血管強(qiáng)化者（圖1B）37例，無動脈期血管強(qiáng)化者25例。動脈供血型（圖1A-D）52例，雙重供血型及門靜脈供血型10例。GPC-3陽性表達(dá)者30例占48.4%，HSP70陽性表達(dá)者45例占72.6%（圖1E-F）。HCC>3 cm、動脈期有血管強(qiáng)化、供血類型為動脈型者GPC-3表達(dá)明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P
2.2 肝癌的CT表現(xiàn)與病理分級的關(guān)系
本組62例HCC，Edmondson-Steiner分級Ⅰ～Ⅱ級39例，Ⅲ～Ⅳ級23例；肝癌的Edmondson-Steiner級別越高，腫瘤越大、邊緣越不清楚、瘤內(nèi)越容易出血壞死，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P
3 討 論
肝癌在世界范圍內(nèi)是最常見的惡性腫瘤，HCC占原發(fā)性肝癌的80%以上。在2012年全世界估計(jì)有782 500例新發(fā)肝癌患者和745 500例肝癌死亡患者。而其中約一半的新發(fā)病例和死亡患者都發(fā)生在中國[8]，我國肝癌的診療形勢嚴(yán)峻。對于術(shù)前肝癌的診斷臨床常通過影像圖像結(jié)合患者血清AFP升高水平和/或穿刺活檢進(jìn)行判定。臨床上對不同時(shí)期肝癌的治療方法差別很大，早期肝癌患者可以通過手術(shù)完全切除，患者能獲得較長的無復(fù)發(fā)生存期，晚期肝癌患者常通過部分切除、射頻消融、動脈化療栓塞、放射性粒子植入再結(jié)合放化療等姑息性治療延長患者的生存時(shí)間。如果能通過CT圖像對肝癌患者進(jìn)行一個較為準(zhǔn)確的初期評估，對患者的進(jìn)一步檢查、治療及預(yù)后的判斷都將有非常重要的意義。
通常認(rèn)為，肝癌的病理分級越高，惡性程度越高；肝癌直徑越大，其向惡性轉(zhuǎn)變越明顯。有研究顯示，當(dāng)肝癌直徑生長至3 cm時(shí)，是其生物學(xué)行為由相對良性向高度惡性轉(zhuǎn)變的重要時(shí)期，小于3 cm肝癌多表現(xiàn)為分化好，膨脹性生長、微血管浸潤和衛(wèi)星結(jié)節(jié)發(fā)生率低等相對溫和的生物學(xué)行為，具有根治性治療的病理學(xué)基礎(chǔ)；大于3 cm肝癌發(fā)生微血管浸潤、衛(wèi)星結(jié)節(jié)及不良預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加，而且總的生存期及無復(fù)發(fā)生存期也明顯低于小于3 cm肝癌患者[9]。早期肝癌向周圍浸潤少，常表現(xiàn)為邊緣清楚，在HCC與癌旁組織之間沒有或者有不完整的纖維性包膜。隨著肝癌的進(jìn)展，腫瘤逐漸由門靜脈供血轉(zhuǎn)變?yōu)楦蝿用}供血，門靜脈供血不斷下降，表現(xiàn)為增強(qiáng)掃描動脈期明顯強(qiáng)化，門靜脈及平衡期強(qiáng)化程度低于肝實(shí)質(zhì)的“洗脫”樣表現(xiàn)，這是診斷肝癌的最重要的影像學(xué)征象。由于進(jìn)展期肝癌呈惡性克隆性增殖，需要大量血供提供細(xì)胞增殖所需的營養(yǎng)物質(zhì)，腫瘤周圍可出現(xiàn)迂曲增粗、增多的異常供血血管，在影像上表現(xiàn)為瘤周或瘤內(nèi)迂曲走形的動脈期血管強(qiáng)化影。但是當(dāng)腫瘤生長速度與腫瘤供血不匹配時(shí)，瘤內(nèi)病灶可出現(xiàn)缺血性壞死。由于腫瘤血管結(jié)構(gòu)的不完整性和/或腫瘤對血管的浸潤破壞，也可表現(xiàn)為腫瘤內(nèi)的出血。包膜是進(jìn)展期肝癌的征象之一，其組織成分可以為富含纖維組織的真包膜，也可為纖維組織和擴(kuò)張的肝血竇組成的假包膜[10]。完整的腫瘤包膜可以限制肝癌向外擴(kuò)散轉(zhuǎn)移，當(dāng)進(jìn)展期肝癌突破包膜向外生長時(shí)，表現(xiàn)為包膜不完整或者在影像上表現(xiàn)為腫瘤邊緣不清楚。
GPC-3是分子量為60 kDa的硫酸乙酰肝素蛋白多糖，通過糖基化磷脂酰肌醇錨定在細(xì)胞膜表面，其在胎兒肝臟中表達(dá)豐富，在成人肝臟中不表達(dá)，當(dāng)肝癌發(fā)生時(shí)，可被激活并通過整合素、胰島素樣生長因子-Ⅱ和Wnt信號通路等傳導(dǎo)通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長[3]。本研究顯示當(dāng)HCC直徑大于3 cm時(shí)，其GPC-3表達(dá)率升高，在動脈期血管強(qiáng)化組和動脈供血型中，GPC-3的表達(dá)也高于對照組，這表明肝癌的CT表現(xiàn)能夠在一定程度上反映GPC-3的表達(dá)水平。病理對照顯示肝癌組織的病理分級越高GPC-3表達(dá)水平越高。本研究結(jié)果與Bin Yan等[11]的研究結(jié)果基本一致，其結(jié)果顯示GPC-3過表達(dá)和HCC的病理分級、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)，GPC-3陽性表達(dá)者HCC的腫瘤更大，而與是否有腫瘤包膜無關(guān)。本研究結(jié)果顯示HCC中總的GPC-3表達(dá)率為48.4%，低于Bin Yan等[11]的研究結(jié)果（65%），@可能與本研究所納入的病例較少有關(guān)。
熱休克蛋白（Heat shock proteins，HSPs）為高度保守的蛋白，在正常情況下低表達(dá)，在休克、缺血、遺傳毒性藥物、營養(yǎng)物質(zhì)缺乏和腫瘤蛋白高表達(dá)等細(xì)胞應(yīng)力條件下表達(dá)升高。熱休克蛋白依據(jù)其分子量的大小，可分為HSP27， HSP70 和HSP90等，其都與惡性腫瘤密切相關(guān)，HSP70在細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)，HCC細(xì)胞移行和生成中扮演重要的角色[4～5]。本研究顯示，肝癌動脈供血型中HSP70表達(dá)高于門靜脈及雙重供血型，但與肝癌的大小、邊緣、瘤內(nèi)出血壞死、動脈期血管強(qiáng)化無關(guān)；病理高級別的HCC中HSP70表達(dá)高于低級別。Shin E等[12]研究認(rèn)為HSP70與腫瘤大小、Edmonson-Steiner分級及腫瘤是否有包膜相關(guān)，瘤體越大、病理分級越高，HSP70表達(dá)越明顯，腫瘤有包膜者比無包膜者HSP70表達(dá)要低，HSP70還可以作為鑒別HCC是否轉(zhuǎn)移的指標(biāo)， HSP70表達(dá)水平和血管浸潤有關(guān)。本研究中HSP70的表達(dá)率為72.6%，與其研究結(jié)果（71.9%）趨同。
僅通過肝癌CT表現(xiàn)能不能準(zhǔn)確反映肝癌的病理分化級別？筆者檢索國內(nèi)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)該研究鮮有報(bào)道，而做病理對照的較多。黃娟等人[7]將肝癌的血供特點(diǎn)與其病理分化程度作了對比，認(rèn)為HCC分化程度較好時(shí)（Edmondson Ⅰ～Ⅱ級）腫瘤可以接受肝動脈、門靜脈或雙重供血，隨著HCC分化程度的降低（EdmondsonⅢ～Ⅳ級）病變則以肝動脈供血為主。本研究結(jié)果顯示HCC的血供特點(diǎn)與其病理分化程度并無相關(guān)性，但是HCC的大小、邊緣、瘤內(nèi)出血壞死與其病理分級密切相關(guān)，即HCC直徑較大、邊緣不清、瘤內(nèi)出血壞死者Edmondson-Steiner分級較高，提示肝癌的CT表現(xiàn)對肝癌病理分化的評估有一定意義。
總之，我們認(rèn)為HCC的CT征象能在一定程度上反映肝癌的病理分化程度和GPC3、HSP70表達(dá)水平，可以豐富肝癌的臨床診斷信息，增加臨床醫(yī)生的診斷信心。但是本研究納入的病例數(shù)較少，其結(jié)果可能存在一定的偏倚，需要更大樣本的研究結(jié)果加以確認(rèn)和補(bǔ)充。
參 考 文 獻(xiàn)
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作者單位：241000 皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院
通訊作者：徐祝軍
【摘要】 目的 通過對損傷的大鼠脊髓早期不同時(shí)機(jī)減壓后測定脊髓組織中熱休克蛋白（HSP）70的表達(dá)及其與神經(jīng)細(xì)胞凋亡的相關(guān)性研究，評價(jià)早期減壓的療效。方法 采用環(huán)扎法建立大鼠脊髓損傷模型，隨機(jī)將大鼠分為4組，對照組、8 h脊髓減壓組（實(shí)驗(yàn)B組）、72 h脊髓減壓組（實(shí)驗(yàn)C組）和不減壓組（實(shí)驗(yàn)D組），并分別在1 d、3 d、7 d、14 d和21 d處死后取各組大鼠受損脊髓進(jìn)行HE染色，免疫組化法、光密度測量法觀察脊髓細(xì)胞HSP70的表達(dá)，TUNEL法觀察神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組HSP70、TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)及HSP70積分光密度各組組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P
【關(guān)鍵詞】 脊髓損傷； 減壓時(shí)機(jī)； 光密度； 熱休克蛋白70； 細(xì)胞凋亡
The research of relationship between HSP70 and neuronal apoptosis measured by optical density in rats treated with Cerclage spinal cord injury and decompression at different early time GU Wen-hao,HU Lan-xiang,XU Zhu-jun,et al.Yijishan Hospital of Wannan Medical College，Wuhu 24100，China
【Abstract】 Objective To investigate relationship between HSP70 and neuronal apoptosis measured by optical density in rats treated with cerclage spinal cord injury and decompression at different early time,and to evaluate the efficacy of early decompression.Methods Cerclage rat model of spinal cord injury, rats were randomly divided into four groups,divided into control group,eight hours of spinal cord decompression group,72 hours spinal decompression group and non-decompression group,in 1 d,3 d,7 d,14 d and 21 d of each group were killed after spinal cord damage in rats with HE staining, immunohistochemistry,optical density measurement of spinal cord cells, the expression of HSP70,TUNEL apoptosis of nerve cells was observed. SPSS 17.0 statistical software for data analysis.Results Experimental group HSP70,TUNEL-positive cells and HSP70 integrated optical density were significantly different, each group P
【Key words】 Spinal cord injury; Decompression time; Optical density; Heat shock protein70; Cell apoptosis
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2012.02.005
脊髓損傷（SCI）的發(fā)病率隨著現(xiàn)代交通業(yè)的發(fā)展而升高，手術(shù)減壓治療急性SCI是一種切實(shí)可行的治療方法，但是在對SCI選擇傷后干預(yù)性手術(shù)治療時(shí)間點(diǎn)上，各臨床治療中心尚沒有達(dá)成共識[1]。為探討早期不同時(shí)機(jī)減壓療效，本實(shí)驗(yàn)采用環(huán)扎法建立大鼠脊髓損傷模型，對損傷的脊髓早期減壓，應(yīng)用免疫組化法觀察HSP70的表達(dá)及TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)，光密度測量脊髓細(xì)胞的HSP70表達(dá)陽性面積，觀察HSP70表達(dá)與神經(jīng)細(xì)胞凋亡的關(guān)系，觀察早期減壓療效。
1 材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組 84只雄性、13周齡、清潔級Sprague-Dawley大鼠，體重270～320 g，平均290.5 g。由浙江省實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號：SCXK(浙)20080033。使用隨機(jī)數(shù)字表、安全隨機(jī)法，分為4組。對照組即A組：僅行椎板切除，n=12，實(shí)驗(yàn)組分為B組：8 h脊髓減壓，n=24；C組：72 h脊髓減壓，n=24；D組：環(huán)扎術(shù)后不行脊髓減壓術(shù)，n=24。分別于手術(shù)后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d處死后取出脊髓標(biāo)本。
1.2 主要試劑 （1）Rabbit Anti-Hsp70；（2）即用型SABC試劑盒；（3）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；（4）0.01PBS(PH7.2-7.4)；（5）0.01枸櫞酸緩沖液（PH6.0）；（6）DAB顯色試劑盒；（7）胃蛋白酶消化液(北京中杉金橋生物有限公司)；（8）4%甲醛(皖醫(yī)弋磯山醫(yī)院實(shí)驗(yàn)外科)。
1.3 動物模型建立 采用環(huán)扎法建立大鼠脊髓損傷模型[2]。以5-0普通白色絲線環(huán)扎大鼠胸腰段硬脊膜囊建立大鼠急性脊髓損傷壓迫模型。1%戊巴比妥鈉，30～40 mg/kg，大鼠腹腔內(nèi)給藥麻醉，以T13棘突為中心，取后入路，咬除T13椎板。10倍顯微鏡下，用測量線環(huán)形測量硬脊膜囊周長，測出硬脊膜囊周長(C1)，經(jīng)代數(shù)運(yùn)算(C2=C1×0.7)獲得將硬脊膜囊截面壓縮至原截面積70%的周長(C2)，將原測量平面將硬脊膜囊環(huán)扎至原截面積的70%。結(jié)扎后依層縫合。B組8 h脊髓減壓，取出環(huán)扎線；C組72 h脊髓減壓，取出環(huán)扎線。D組保留環(huán)扎線。術(shù)后常規(guī)護(hù)理。
1.4 標(biāo)本采集、制備與HE染色 大鼠模型分別在手術(shù)減壓后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d五個時(shí)間，將對照組和脊髓損傷組的大鼠經(jīng)心臟灌注取材，灌注后脊髓已被多聚甲醛固定變硬，以環(huán)扎損傷部位為中心、取出其上下段共1.5 cm脊髓組織，浸泡于相同甲醛溶液中后固定72 h。損傷下端0.5 cm以4 μm厚度切片，脊髓取冠狀面，撈片于涂有多聚賴氨酸的載玻片上，標(biāo)簽晾干玻片分別行HE染色。
1.5 免疫組織化學(xué)染色 分別取脊髓損傷下端組織切片用Rabbit Anti-Hsp70抗體進(jìn)行SABC免疫組織化學(xué)染色，使用DAB顯色試劑盒，TUNEL法觀察神經(jīng)細(xì)胞的凋亡水平，使用DAB顯色試劑盒染色檢測，所有實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照該試劑的標(biāo)準(zhǔn)和流程進(jìn)行。使用數(shù)碼相機(jī)（NIKON-4300日本)對顯色的圖片攝像。
1.6 光密度測量 在普通光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）下觀察每組不同時(shí)間下染色特點(diǎn)。每一染色切片隨機(jī)取5個高倍視野(10×40)進(jìn)行顯微攝影(Nikon Eclipse 80i顯微成像系統(tǒng))獲取圖像，調(diào)試完成后，維持采集的各項(xiàng)設(shè)置不變，一次性采集出所有樣本的圖像，每張切片至少隨機(jī)采集5個視野。使用圖像分析軟件（Image－Pro Plus 6.0美國）對每張切片進(jìn)行光密度測定。積分光密度(IOD)可反映所測結(jié)構(gòu)的光密度與面積的綜合變化，IOD與物質(zhì)的質(zhì)量成正比，其數(shù)值反映物質(zhì)的相對含量 [3，4]。
1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各組數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，四組數(shù)據(jù)均呈正態(tài)分布，方差齊性檢驗(yàn)采用比較均值單因素方差同性檢驗(yàn)，組內(nèi)組間比較采用一般線性模型單變量方差檢驗(yàn)，HSP70陽性細(xì)胞數(shù)與神經(jīng)細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)相關(guān)性采用直線相關(guān)分析。以P
2 結(jié)果
2.1 HSP70積分光密度 使用圖像分析軟件（Image－Pro Plus 6.0美國）對每張切片進(jìn)行光密度測定，在400倍每張切片至少隨機(jī)采集5個視野。A組偶見陽性面積，各時(shí)間點(diǎn)無顯著差異。陽性面積D組高于C組，C組高于B組，實(shí)驗(yàn)組術(shù)后1 d陽性面積增加，術(shù)后3 d到達(dá)高峰，術(shù)后7 d有所降，術(shù)后21 d仍然有所表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P
2.2 HSP70免疫組化陽性細(xì)胞數(shù)結(jié)果 光鏡下分別觀察各組各時(shí)間點(diǎn)脊髓損傷下端的組織變化，以細(xì)胞漿和（或）核棕黃色著色為陽性細(xì)胞，在400倍視野下每張切片于灰質(zhì)取5個視野，分別計(jì)數(shù)每個視野的陽性細(xì)胞數(shù)。A組偶見免疫陽性細(xì)胞，各時(shí)間點(diǎn)無顯著差異（見圖1：A）。陽性細(xì)胞數(shù)，D組高于C組，C組高于B組，實(shí)驗(yàn)組術(shù)后1 d免疫陽性細(xì)胞增加，術(shù)后3 d到達(dá)高峰，術(shù)后7 d有所降，術(shù)后21 d仍然有所表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組圖片見圖1:B、C、D、E、F。實(shí)驗(yàn)組組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P
2.3 Tunel凋亡細(xì)胞 凋亡細(xì)胞呈棕褐色和棕黃色，胞核固縮顆粒深染，形態(tài)不規(guī)則，為散在和彌散性分布于損傷區(qū)域及周圍。在400倍視野下每張切片于灰質(zhì)取5個視野，分別計(jì)數(shù)每個視野的陽性細(xì)胞數(shù)。對照組少見凋亡細(xì)胞。凋亡細(xì)胞數(shù)，D組高于C組，C組高于B組，實(shí)驗(yàn)各組術(shù)后1 d出現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞，術(shù)后3 d達(dá)到高峰，術(shù)后7 d、14 d、21 d凋亡細(xì)胞逐日減少。各組組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P
2.4 HSP70陽性細(xì)胞與Tunel細(xì)胞凋亡的相關(guān)性分析 實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間點(diǎn)熱休克蛋白70陽性細(xì)胞、tunel陽性細(xì)胞數(shù)比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩者線性相關(guān)系數(shù)r=0.685～0.971，對r值進(jìn)行t檢驗(yàn)的假設(shè)檢驗(yàn)，P
3 討論
目前治療脊柱脊髓損傷的主要方法是及時(shí)徹底地減壓和恢復(fù)脊柱穩(wěn)定性，減少繼發(fā)性損傷[1]。目前認(rèn)為細(xì)胞凋亡是繼發(fā)性脊髓損傷的重要組成部分，繼發(fā)性脊髓損傷中出現(xiàn)的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞死亡都是繼發(fā)細(xì)胞凋亡的結(jié)果[5]。
注：A：空白對照組；B：8 h減壓術(shù)后3 d；C：8 h減壓術(shù)后21 d；D：72 h減壓術(shù)后3 d；E：72 h減壓術(shù)后21 d；F：未減壓術(shù)后3 d
當(dāng)發(fā)生脊髓損傷后局部熱休克蛋白（HSPs）的表達(dá)增加，可對抗脊髓繼發(fā)性損傷神經(jīng)細(xì)胞凋亡是脊髓繼發(fā)性損傷的主要機(jī)制之一，HSPs可通過以下機(jī)制抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡：抑制內(nèi)源性（線粒體內(nèi)caspase依賴的）凋亡途徑，抑制外源性（受體介導(dǎo)的）凋亡途徑，調(diào)節(jié)Bcl-2家族成員的活性促進(jìn)核轉(zhuǎn)錄因子的活化，抑制一氧化氮(NO)的大量產(chǎn)生減少自由基的毒性作用[6]。其中HSP70屬于誘導(dǎo)型HSP70，其在正常細(xì)胞中不表達(dá)或表達(dá)量很少，但在應(yīng)激源刺激下，表達(dá)量顯著增加[7]。實(shí)驗(yàn)證實(shí)HSP70對細(xì)胞保護(hù)作用，其誘導(dǎo)的數(shù)量與保護(hù)作用的強(qiáng)弱呈正相關(guān)[8]。邵將等[9]實(shí)驗(yàn)顯示，HSP70表達(dá)隨時(shí)間的延長逐漸增強(qiáng)，損傷后24～48 h達(dá)到頂峰，在此期間組織內(nèi)所有細(xì)胞均可見HSP70的陽性表達(dá)，這種表達(dá)一直持續(xù)到損傷后72 h。與本次實(shí)驗(yàn)HSP70表達(dá)的高峰期較為接近。由于HSP70屬于誘導(dǎo)型HSP，其誘導(dǎo)的機(jī)制尚不完全清楚，所以單純手術(shù)干預(yù)不能誘導(dǎo)其表達(dá)增加。因此在今后的研究中，對損傷的脊髓早期減壓的同時(shí)，短時(shí)間誘導(dǎo)出大量HSPs，達(dá)到更好地抗脊髓繼發(fā)性損傷神經(jīng)細(xì)胞凋亡，將是未來治療脊髓損傷的新路徑。
參 考 文 獻(xiàn)
［1］ 楊民,徐祝軍,黨耕町.外科干預(yù)性手術(shù)治療時(shí)間的選擇對急性脊髓損傷預(yù)后影響的研究進(jìn)展［J］.中國脊柱脊髓雜志,2009,19(4):310-313.
［2］ 徐祝軍,王兵,楊民.環(huán)扎法致大鼠脊髓損傷后早期不同時(shí)段減壓療效的評價(jià)［J］.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2011,28(7):1191-1192.
［3］ 李濤,范好,劉芳.免疫組織化學(xué)圖像光密度分析的標(biāo)準(zhǔn)化方法［J］.解剖學(xué)雜志,2008,31(5):727-728.
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［8］ Sale hi AH,Morris SJ,Ho WC,et al.AEG3482 is an antiapoptotic compound that inhibits Jun kinase activity and cell deathth rough induced expression of heat shock protein70［J］.ChemBio,2006,13(2):213-223.
一、心肌預(yù)缺血現(xiàn)象
心肌預(yù)缺血保護(hù)是指預(yù)先使心肌經(jīng)歷數(shù)次短暫缺血(不至造成不可逆的損傷)，可使其對隨后較長時(shí)間的缺血和再灌注造成的損傷產(chǎn)生抵抗作用。這一適應(yīng)性的保護(hù)反應(yīng)首先由Murry等［3］發(fā)現(xiàn)并報(bào)道。實(shí)驗(yàn)犬心肌局部經(jīng)歷數(shù)次短暫重復(fù)的缺血，預(yù)想將造成累積性的ATP消耗。但結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)歷首次缺血后，心肌ATP含量并沒有隨著后面數(shù)次缺血進(jìn)一步減少，7條犬中6條沒發(fā)生心肌梗死。這一結(jié)果與當(dāng)時(shí)普遍接受的觀點(diǎn)相矛盾，即重復(fù)缺血可造成心肌梗死。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，阻塞犬冠狀動脈分支5分鐘，接著開放5分鐘，重復(fù)4次，然后經(jīng)歷40分鐘缺血，結(jié)果心肌梗死面積只有對照組(沒有經(jīng)歷4次預(yù)缺血)的25%。在實(shí)驗(yàn)動物上引發(fā)預(yù)缺血保護(hù)，理想的預(yù)缺血時(shí)間是2～5分鐘，間隔同樣或長一倍的時(shí)間，如此重復(fù)2～5次，可達(dá)到最佳保護(hù)效果，又不會造成心肌梗死和室顫［4］。預(yù)缺血使心肌在幾分鐘之內(nèi)產(chǎn)生保護(hù)作用，但持續(xù)時(shí)間很短，2～4小時(shí)后大部分喪失，這一快速適應(yīng)性保護(hù)稱早期預(yù)缺血保護(hù)［5］。隨后的研究發(fā)現(xiàn)另外存在一種緩慢產(chǎn)生的保護(hù)，稱延遲預(yù)缺血保護(hù)，在預(yù)缺血24小時(shí)后效果明顯，持續(xù)到72小時(shí)以后［4］。隨著研究的深入，預(yù)缺血的含義被擴(kuò)大了，引發(fā)預(yù)缺血保護(hù)的方法包括：離體心臟低氧灌注，快速心臟起搏，熱刺激，內(nèi)毒素和基因轉(zhuǎn)移。預(yù)缺血保護(hù)不但在許多動物如大鼠、兔、犬、豬，而且在人類心臟上也被證實(shí)。
二、心肌預(yù)缺血保護(hù)的機(jī)制
近年來學(xué)者們對心肌預(yù)缺血保護(hù)的機(jī)制做了大量研究，認(rèn)為早期預(yù)缺血通過受體激活細(xì)胞內(nèi)信息傳遞鏈，激活蛋白激酶，而后使ATP依賴性鉀通道(KATP)開放產(chǎn)生保護(hù)作用［6］。延遲預(yù)缺血保護(hù)的機(jī)制尚不清楚。但許多作者認(rèn)為與細(xì)胞內(nèi)信息傳遞鏈激活和蛋白合成有關(guān)［7］。
1.早期心肌預(yù)缺血的保護(hù)機(jī)制有證據(jù)表明缺血時(shí)神經(jīng)內(nèi)分泌應(yīng)激激素如腺苷、去甲腎上腺素、緩激肽、內(nèi)皮素、血管緊張素Ⅱ、乙酰膽堿的釋放與早期預(yù)缺血保護(hù)有關(guān)，而蛋白質(zhì)的合成則與此保護(hù)無關(guān)［8］。有實(shí)驗(yàn)表明使用腺苷可使心肌產(chǎn)生預(yù)缺血樣保護(hù)，而在預(yù)缺血期或后缺血期使用腺苷受體拮抗劑或腺苷脫氫酶則可消除保護(hù)作用［9］。腺苷受體與G蛋白結(jié)合，腺苷與受體結(jié)合后，G蛋白從結(jié)合體中傳遞信息給效應(yīng)酶和離子通道［10］。預(yù)缺血也可以增加G蛋白的活性。其他應(yīng)激激素受體如α1腎上腺素能受體、血管緊張素受體、緩激肽受體、內(nèi)皮素受體、乙酰膽堿能受體均與G蛋白結(jié)合并通過其傳遞信息［11］。G蛋白傳遞信息給與它結(jié)合的磷脂酶C(phospholipaseC)使其激活，后者使細(xì)胞膜磷酸肌醇水解，產(chǎn)生兩種細(xì)胞內(nèi)第二信使，一種是三磷酸肌醇，可引起細(xì)胞內(nèi)非線粒體鈣釋放；另一種是二環(huán)甘油(diacylglycerol,DAG)。DAG可使本來處于細(xì)胞漿內(nèi)非激活狀態(tài)的蛋白激酶C(proteinKinaseC,PKC)移到細(xì)胞的雙層脂膜上，等待后缺血期激活［12］。蛋白激酶C有幾種異構(gòu)體，預(yù)缺血時(shí)誘導(dǎo)的是新型的鈣非依賴型酶。該酶在后缺血和再灌注期通過上述腺苷激活鏈被激活，它可激活KATP［13］，另外后缺血期心肌細(xì)胞內(nèi)ATP含量降低也可開放KATP。KATP激活后，鉀離子外流，心肌動作電位平臺期縮短，鈣離子內(nèi)流減少，在亞細(xì)胞水平維持鈣離子循環(huán)所需的高能磷酸鍵減少，心肌收縮功能減弱，能量需要減少，從而保護(hù)了心肌。鉀通道開放后亦可顯著減輕由白細(xì)胞釋放氧自由基引起的心肌損傷［14］。
2.延遲預(yù)缺血保護(hù)機(jī)制目前對延遲預(yù)缺血的保護(hù)機(jī)制研究處于初期階段，有學(xué)者認(rèn)為這一保護(hù)的激發(fā)因子和信息傳導(dǎo)鏈與早期保護(hù)相同。延遲預(yù)缺血與蛋白質(zhì)的基因轉(zhuǎn)錄、合成和降解在時(shí)間上相吻合，且使用蛋白合成抑制劑可消除延遲保護(hù)，故蛋白合成被認(rèn)為與這一保護(hù)機(jī)制有關(guān)。熱休克蛋白(heatshockprotein,HSP)和抗氧化酶在許多實(shí)驗(yàn)中被證實(shí)能產(chǎn)生延遲保護(hù)作用。預(yù)缺血后心肌延遲產(chǎn)生的抗氧化酶可清除后缺血和再灌注期產(chǎn)生的氧自由基。
熱休克蛋白是心肌遇熱刺激后產(chǎn)生的一種反應(yīng)性蛋白，正常心肌組織中含量較低，它可防止新合成的多肽鏈誤折和誤聚，使其穿過生物膜，并作為補(bǔ)體作用于新合成的多肽鏈?zhǔn)蛊溆袡C(jī)地折迭和組合。預(yù)缺血2小時(shí)后，免疫組化測定顯示HSP70mRNA含量增高，于24小時(shí)后回到正常水平，與此同時(shí)HSP明顯升高［4］，于72小時(shí)后開始下降，其含量與心肌保護(hù)作用的程度成正相關(guān)，被認(rèn)為是哺乳動物中作用最強(qiáng)的心肌保護(hù)蛋白。它可使損傷的蛋白質(zhì)多肽鏈解聚，以便重新折迭和組合，恢復(fù)活性。有作者［16］認(rèn)為熱休克蛋白可維持抗氧化酶的活性，增強(qiáng)其清除氧自由基作用。另外，有實(shí)驗(yàn)證明熱休克蛋白含量與心肌細(xì)胞凋亡(apoptosis)數(shù)量成反比，而與細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子(NF-kB)活性成反比，故提出熱休克蛋白通過抑制NF-kB的活性減少心肌細(xì)胞的凋亡［17］。
三、心肌預(yù)缺血保護(hù)的臨床價(jià)值
預(yù)缺血保護(hù)在臨床上也已得到證實(shí)和應(yīng)用。在心肌梗塞前有數(shù)次心絞痛發(fā)作(預(yù)缺血)的冠心病人與無心絞痛發(fā)作的病人相比，其梗死面積小，心源性休克及充血性心衰發(fā)生率低。心內(nèi)直視術(shù)中引進(jìn)預(yù)缺血，心肌保護(hù)明顯優(yōu)于單用冷晶體停跳液或氧合血停跳液者［18］。低溫亦可增強(qiáng)預(yù)缺血保護(hù)效果。對高危心臟手術(shù)病人引入這一內(nèi)源性的保護(hù)機(jī)制，可望達(dá)到理想效果。
四、研究展望
1.機(jī)制方面雖然腺苷-蛋白激酶C-KATP這一預(yù)缺血保護(hù)的激活途徑得到大多數(shù)學(xué)者認(rèn)可，但也有作者觀察到預(yù)缺血并不改變后缺血和再灌注對動作電位的影響；KATP作為最終作用因子亦受到有些學(xué)者懷疑。在延遲保護(hù)方面，信息傳遞鏈與熱休克蛋白和抗氧化酶合成的關(guān)系尚不明確。有實(shí)驗(yàn)提出在延遲保護(hù)實(shí)驗(yàn)中，熱休克蛋白和抗氧化酶并不升高。以上方面均需進(jìn)一步探討。
Proteomic analysis of human bone marrowderived mesenchymal stem cells induced to differentiate into osteoblasts
【Abstract】 AIM: To analyze the difference of protein profiles between human bone marrowderived mesenchymal stem cells (MSCs) and osteogenic differentiated MSCs by proteomic approach. METHODS: The MSCs were isolated primarily from bone marrow of adults and detected in cell purity by flow cytometry analyzing cell phenotypes and in cell function by multilineage potential test. The undifferentiated MSCs and osteogenic differentiated MSCs over a period of 14 d were collected and cell total proteins were extracted for finding out the differential expression by proteomic analysis including 2D gel electrophoresis and Peptide Mass Fingerprinting technology. RESULTS: Twentythree differentially expressed proteins were identified by MALDITOFMS analysis. CONCLUSION: Proteomic approach is a high throughput method to screen the key proteins which play important roles in MSCs osteogenic differentiation.
【Keywords】 proteomics; mesenchymal stem cells; protein expression
【摘要】 目的: 探討用蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）定向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化中細(xì)胞蛋白表達(dá)譜的改變. 方法: 從人骨髓細(xì)胞中分離獲得MSCs，經(jīng)細(xì)胞表型及多向分化能力測定鑒定MSCs的純度和功能后，采用定向成骨細(xì)胞分化誘導(dǎo)培養(yǎng)體系，于分化后14 d分別提取未分化細(xì)胞及分化后細(xì)胞的總蛋白，雙向電泳分析，確定蛋白差異點(diǎn)，經(jīng)酶切后行蛋白肽質(zhì)量指紋譜鑒定差異蛋白表達(dá). 結(jié)果: 雙向電泳找到38個蛋白差異點(diǎn)，質(zhì)譜分析鑒定出23個差異蛋白分子表達(dá). 結(jié)論: 用蛋白質(zhì)組學(xué)方法可高通量篩選與MSCs定向誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化相關(guān)的重要蛋白.
【關(guān)鍵詞】 蛋白質(zhì)組學(xué)；間質(zhì)干細(xì)胞；蛋白表達(dá)
0引言
間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells， MSCs)是一群具有向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化能力的干細(xì)胞，存在于成體的骨髓、骨、脂肪和肌肉等組織中. MSCs體外貼壁性使之易于分離純化，且體外培養(yǎng)的MSCs增殖能力強(qiáng)，是一種具有重要應(yīng)用價(jià)值的種子細(xì)胞［1］. 但有關(guān)MSCs定向分化的分子機(jī)制尚不清楚. 為探討MSCs定向成骨分化過程中細(xì)胞內(nèi)可能具有調(diào)控作用的蛋白分子的變化，我們首先從人骨髓單個核細(xì)胞中分離獲得MSCs，對所獲得的MSCs進(jìn)行了細(xì)胞表型及多向分化能力測定，在鑒定MSCs的純度和功能后，采用定向成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)體系誘導(dǎo)MSCs定向成骨細(xì)胞分化，對未分化MSCs及分化后細(xì)胞總蛋白進(jìn)行提取，經(jīng)雙向電泳比較蛋白差異點(diǎn)，選擇差異點(diǎn)蛋白，酶切后進(jìn)行蛋白點(diǎn)肽質(zhì)量指紋譜鑒定分析.
1材料和方法
1.1材料
骨髓取自食道癌手術(shù)患者，年齡56～67歲. 主要試劑Dulbeccos modified Eagles medium（DMEM）培養(yǎng)基為Gibco產(chǎn)品，胎牛血清為Stem cell產(chǎn)品，Percoll為Amersham Pharmacia產(chǎn)品，CD34，CD45，CD73，CD105，CD166單克隆抗體為BD公司產(chǎn)品，胰酶、地塞米松、β－甘油磷酸鈉、抗壞血酸、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase， ALP)染色試劑盒、CHAPS為Sigma產(chǎn)品，IPG干膠條(pH310，18 cm)為Amersham Pharmacia產(chǎn)品，碘乙酰胺為Fluka產(chǎn)品，標(biāo)準(zhǔn)蛋白BSA為Pierce產(chǎn)品，其他試劑由本室提供.
1.2方法
1.2.1人骨髓MSCs的分離培養(yǎng)Percoll分離人骨髓單個核細(xì)胞，2×105細(xì)胞/cm2密度接種于塑料培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)體系為含100 mL/L經(jīng)篩選胎牛血清的高糖DMEM，48 h后去除非貼壁細(xì)胞，每隔3 d換液，至貼壁細(xì)胞0.80融合時(shí)按3000細(xì)胞/cm2接種傳代.
1.2.2人骨髓MSCs的鑒定收集3代以后的細(xì)胞，按1 μL/1×106細(xì)胞分別加入PE或FITC直接標(biāo)記的抗CD34，CD45，CD73，CD105和CD166等單克隆抗體，室溫反應(yīng)20 min. PBS洗滌后，流式細(xì)胞儀檢測，每個反應(yīng)至少收集5000個點(diǎn)數(shù)據(jù). 以加入相應(yīng)同型抗體細(xì)胞作為陰性對照，應(yīng)用相關(guān)軟件分析［2-3］. 按照文獻(xiàn)方法［4］誘導(dǎo)MSCs向成骨細(xì)胞分化，用ALP染色鑒定；誘導(dǎo)MSCs向脂肪細(xì)胞分化，用油紅染色鑒定；誘導(dǎo)MSCs向成軟骨細(xì)胞分化，阿爾辛藍(lán)染色鑒定.
1.2.3雙向電泳
1.2.3.1雙向電泳蛋白質(zhì)樣品的制備收集3代以后的MSCs和向成骨誘導(dǎo)分化的細(xì)胞，用冷的PBS洗2遍后，加入細(xì)胞裂解液(8 mol/L尿素，40 g/L CHAPS，40 mmol/L Tris base)，混勻后用液氮反復(fù)凍融，再加入適量RNA酶和DNA酶，冰浴20 min. 4℃離心(14 000 g，30 min)，取上清，Bradford法定量，分裝，-70℃保存.
1.2.3.2第一向固相PH梯度等電聚焦（IEF）100 μg（銀染）或1 mg（考染）蛋白與重泡漲液（8 mol/L尿素，20 g/L CHAPS，5 μL/L IPG緩沖液，20 mmol/L DTT，痕量溴酚藍(lán)）混合，行等電聚焦，重泡漲與等電聚焦在16℃，以設(shè)定程序進(jìn)行，總電壓時(shí)間為80 000 V?h.
1.2.3.3平衡等電聚焦結(jié)束后，每根IPG膠條用8 mL含SDS的平衡液（50 mmol/L Tris?Cl (pH 8.8)，6 mmol/L尿素，300 mL/L甘油，20 g/L SDS，痕量溴酚藍(lán)）平衡兩次，每次15 min，第一次為還原過程，平衡液內(nèi)加20 mmol/L DTT；第二次平衡為烷基化過程，平衡液內(nèi)加100 mmol/L的碘乙酰胺.
1.2.3.4第二向垂直平板電泳（SDSPAGE）將平衡好的IPG膠條轉(zhuǎn)移至130 mL/L的丙烯酰胺膠上分離，堿性端旁置蛋白分子量Marker，行SDSPAGE.
1.2.3.5染色及凝膠圖像采集分析SDSPAGE膠在硝酸銀染色時(shí)須經(jīng)過固定、增敏、顯色三步；在考馬斯亮藍(lán)染色時(shí)，則須染色3 h，然后脫色. 染色后的雙向電泳凝膠用凝膠圖像掃描儀透射掃描，數(shù)字化圖象文件采用Amersham Pharmacia公司的二維電泳處理軟件（ImageMasterTM 2D Elite 3.01）分析，結(jié)合目視，從分子量、等電點(diǎn)等方面比對蛋白分子差異點(diǎn).
1.2.4蛋白點(diǎn)肽質(zhì)量指紋譜鑒定
1.2.4.1切膠、脫色、干燥將電泳后凝膠中蛋白質(zhì)點(diǎn)切出，用干凈的解剖刀將膠塊切成約1～2 mm3大小，去離子水沖洗，除盡殘留的SDS. 用含500 mL/L乙腈、25 mmol/L NH3HCO3的溶液100～200 μL，渦旋混合器震蕩約30 min，重復(fù)此操作直至膠塊中的藍(lán)色完全褪盡. 將膠塊在真空干燥器內(nèi)干燥約20 min.
1.2.4.2酶切及肽段提取在干燥好的膠塊上加入3～7 μL胰蛋白酶液（0.01 g/L，配于25 mmol/L NH4HCO3溶液內(nèi)），4℃放置15 min使酶液完全被吸收，補(bǔ)加5 μL 25 mmol/L的NH4HCO3溶液保濕，37℃溫育18～20 h. 收集酶切后的上清，在膠塊內(nèi)加50～100 μL 50 g/L三氟乙酸于40℃放置1 h，收集上清；再加入25 g/L三氟乙酸、500 mL/L乙腈50～100 μL于30℃放置1 h，收集上清；合并上清液離心干燥.
1.2.4.3肽混合物的PMF分析在干燥后的肽混合物內(nèi)加入3～7 μL 50 g/L三氟乙酸，混勻后，取0.5～1 μL溶液和等體積飽和基質(zhì)溶液混合，然后加至不銹鋼靶上，室溫干燥，裝靶測定：20 kV，陽離子模式下在Bruker REFLEX Ⅲ型MALDITOFMS(BrukerFranzen， Bremen， Germany)質(zhì)譜儀上獲取數(shù)據(jù)，用Mascot(matrixscience.cn)軟件在NCBInr數(shù)據(jù)庫內(nèi)進(jìn)行檢索.
2結(jié)果
2.1人骨髓MSCs形態(tài)骨髓單個核細(xì)胞于3 d左右開始伸出突起，2～6 d時(shí)細(xì)胞增殖較緩慢，逐漸長為梭形，7 d開始細(xì)胞增殖迅速，細(xì)胞呈旋渦狀生長，14 d左右逐漸達(dá)到完全融合(圖1).
2.2流式細(xì)胞學(xué)分析MSCs表型研究表明，MSCs具有多種標(biāo)志分子，有造血干細(xì)胞生長因子及間質(zhì)細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞抗原和細(xì)胞外基質(zhì)受體的表達(dá)， 但并不表達(dá)CD45，CD34等造血干祖細(xì)胞的表面標(biāo)志. 通過流式細(xì)胞學(xué)分析，培養(yǎng)的MSCs表達(dá)CD73，CD105，CD166，不表達(dá)CD34，CD45(圖2).
2.3MSCs功能鑒定ALP染色鑒定MSCs向成骨誘導(dǎo)分化，ALP染色MSCs陰性，成骨細(xì)胞陽性；油紅染色鑒定MSCs向成脂肪誘導(dǎo)分化，油紅染色MSCs陰性，成脂肪細(xì)胞陽性，可見脂滴堆積；阿爾辛藍(lán)染色鑒定MSCs向成軟骨誘導(dǎo)分化，成軟骨細(xì)胞陽性，存在大量蛋白聚糖基質(zhì). 通過MSCs表型和MSCs功能鑒定證實(shí)，我們獲得了從人骨髓單個核細(xì)胞分離培養(yǎng)的MSCs細(xì)胞(圖3).
2.4雙向電泳顯示蛋白質(zhì)差異點(diǎn)的變化MSCs與成骨細(xì)胞凝膠圖像存在多個蛋白差異點(diǎn)，選取38個差異點(diǎn)，切膠作質(zhì)譜分析. 經(jīng)過鑒定，共有23個差異點(diǎn)鑒定出差異蛋白(圖4).
2.5質(zhì)譜分析鑒定差異蛋白鑒定結(jié)果表明，大多數(shù)蛋白點(diǎn)的出峰情況較好［部分蛋白分子差異點(diǎn)的肽質(zhì)量指紋譜（PMF），圖5］. 用MALDITOF/MS結(jié)果進(jìn)行檢索就可以得到比較確定的鑒定結(jié)果. 質(zhì)譜鑒定MSCs和向成骨誘導(dǎo)細(xì)胞蛋白差異點(diǎn)的詳細(xì)情況見表1.表1質(zhì)譜鑒定的差異蛋白（略）
3討論
骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化潛能，研究證實(shí)MSCs可以分化為成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞，MSCs還可分化為神經(jīng)元細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞. 這些研究結(jié)果表明，間充質(zhì)干細(xì)胞已超越了傳統(tǒng)意義上只能分化為間質(zhì)組織的概念. 細(xì)胞分化的實(shí)質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)基因的選擇性表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞新的特異性的蛋白質(zhì)的合成，從而在生化、結(jié)構(gòu)及功能上發(fā)生變化. 對細(xì)胞內(nèi)基因的結(jié)構(gòu)與功能的研究最終需定位于細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的研究. 因此我們應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測MSCs定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞后蛋白表達(dá)的差異，期望發(fā)現(xiàn)對MSCs的誘導(dǎo)分化起作用的調(diào)控蛋白，從功能蛋白質(zhì)組學(xué)的高度闡述MSCs分化過程中其相關(guān)蛋白質(zhì)的含量與修飾的變化，以便更深入地闡明MSCs定向分化的分子機(jī)制. 我們經(jīng)過篩選，從38個蛋白差異點(diǎn)中鑒定出23個差異蛋白. 在這些差異蛋白中，微管蛋白和骨架蛋白占相當(dāng)大的比例，如Moesin，β微管蛋白、cofilin 1，平滑肌蛋白、SM22alpha. 由于MSCs誘導(dǎo)分化成成骨細(xì)胞，微管蛋白和骨架蛋白的表達(dá)必然增加. 我們也找到了2個感興趣的差異蛋白：熱休克蛋白27和KIAA0120. 熱休克蛋白27是熱休克蛋白家族中的一員，作為一種分子伴侶，它參與一系列細(xì)胞活動，包括細(xì)胞內(nèi)蛋白聚集的抑制、細(xì)胞骨架蛋白的動力學(xué)、細(xì)胞生長與細(xì)胞分化等. 熱休克蛋白27的誘導(dǎo)和表達(dá)與肌動蛋白和微管蛋白的結(jié)構(gòu)建造緊密相連，通過磷酸化作用穩(wěn)定細(xì)胞肌絲，從而在細(xì)胞保護(hù)方面發(fā)揮作用［5-6］. 近年來的研究證實(shí)，熱休克蛋白27通過幾種不同的機(jī)制參與細(xì)胞凋亡，有關(guān)熱休克蛋白27參與細(xì)胞凋亡的信號傳導(dǎo)通路已經(jīng)成為這一領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一. 熱休克蛋白27能維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原的動態(tài)平衡和線粒體的穩(wěn)定，通過與細(xì)胞色素C的相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞行使細(xì)胞凋亡功能［7］. 在以后的實(shí)驗(yàn)中，我們會圍繞熱休克蛋白27基因和蛋白作一些相關(guān)研究. 我們另一個感興趣的差異蛋白是KIAA0120. KIAA0120是KIAA家族中的一員. 目前對KIAA的研究主要集中于基因水平，對KIAA蛋白的結(jié)構(gòu)與功能所知不多［8-9］. 我們應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄PCR（RTPCR）方法觀察到MSCs定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞后，KIAA1077基因的表達(dá)上調(diào)（資料未顯示）. 對KIAA基因和蛋白的研究也是我們以后研究的重點(diǎn)之一.
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調(diào)節(jié)體溫 讓孩子適度出點(diǎn)汗，可幫助體內(nèi)排出多余的熱量，維持體溫的恒定，有效減少熱對酶和結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的傷害，增強(qiáng)免疫力，維護(hù)孩子的健康。
防范中暑 兒童是中暑的高發(fā)人群，這與有些孩子體內(nèi)的熱休克蛋白數(shù)量過低有關(guān)。熱休克蛋白是指細(xì)胞在應(yīng)激原特別是環(huán)境高溫誘導(dǎo)下所生成的一組蛋白質(zhì)。如果長期享受空調(diào)，怕熱怕流汗，不進(jìn)行耐熱鍛煉，體內(nèi)的熱休克蛋白數(shù)量就少。
抵御病菌 汗液中的乳酸與皮脂腺分泌的脂肪酸，是殺滅病原微生物的化學(xué)武器，可殺死皮膚表面大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌和白色念珠菌等致病菌，維持皮膚的生態(tài)平衡，防范癤癰等皮膚病。
幫助排毒 皮膚是最大的排泄器官，人體內(nèi)每天會產(chǎn)生大量的代謝廢物，并隨著汗水排泄出去，從而使人體內(nèi)環(huán)境保持潔凈，各臟器發(fā)揮正常的生理功能。
增進(jìn)食欲 孩子活動出汗后，促進(jìn)了身體的氣血運(yùn)行，胃腸道的蠕動和消化液的分泌正常，有利于對食物的消化吸收，胃口好，吃飯香。
出汗是夏天孩子保健的法寶，因此我們要注意維護(hù)好孩子的汗腺健康――
防止汗腺疲勞
汗腺分泌的汗液中99％是水分，其余是氯化鈉、氯化鉀、水溶性維生素及尿素等。夏季天氣炎熱，出汗過多會丟失眾多物質(zhì)，影響機(jī)體的健康。比如，鈉離子丟失太多就無力統(tǒng)帥“水兵”，汗腺會不停地分泌汗液，如不及時(shí)補(bǔ)充鹽分，時(shí)間一長，汗腺就會發(fā)生疲勞，影響排汗功能。體內(nèi)缺少鹽分，水分丟失過多，水和電解質(zhì)的平衡失調(diào)，體溫調(diào)節(jié)中樞失靈而導(dǎo)致中暑，嚴(yán)重者危及生命。
因此，夏天要注意孩子的飲食營養(yǎng)，合理調(diào)配膳食，平時(shí)常吃些新鮮蔬菜瓜果，補(bǔ)充維生素及礦物質(zhì)。孩子在外面跑跳玩耍時(shí)常會汗水淋漓，媽媽可讓孩子多次少量喝些淡鹽開水、綠豆湯或防暑的清熱飲料；西瓜是消暑佳品，享有“天然白虎湯”之美稱，每天吃點(diǎn)西瓜大有裨益。同時(shí)要給孩子創(chuàng)造一個溫濕度適宜、空氣清新的室內(nèi)環(huán)境，既避免了孩子出汗過多，又防止汗腺發(fā)生疲勞。
保持皮膚清潔
夏天孩子出汗多，如不注意衛(wèi)生，皮膚極易變臟，灰塵污垢會堵塞汗孔，影響汗液排泄，容易引起汗孔角質(zhì)層的炎癥，還會導(dǎo)致汗管破裂，形成痱子，如繼發(fā)細(xì)菌感染，會變成痱毒或癤癰，嚴(yán)重者引起毒血癥或敗血癥。
因此，夏天要天天給孩子沐浴洗澡，保持皮膚清潔，有利于汗腺導(dǎo)管通暢。但洗澡要講究科學(xué)，當(dāng)孩子在劇烈活動后一身大汗時(shí)，千萬不能帶孩子到池塘或河水中洗澡，更不可對著自來水猛沖身體，以免熱身子受到冷水的剌激后，皮下血管急劇收縮，汗孔閉塞，引發(fā)感冒、急性關(guān)節(jié)痛等病，嚴(yán)重者可導(dǎo)致肢體癱瘓。所以，運(yùn)動后要休息半小時(shí)，等汗干后再去洗澡。洗后及時(shí)擦干身體，穿好衣服。
芍藥苷（paeoniflorin，PF）是中藥芍藥的主要有效單體成分。芍藥Paeonia lactiflora Pall具有清熱涼血、散淤止痛、活血化淤、調(diào)節(jié)免疫之功能。既往研究證明芍藥苷有抗自由基損傷，抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載和抗神經(jīng)毒性等活性，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明其有降低血液黏度、抗血小板聚集、擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)、抗氧化、抗驚厥等作用?，F(xiàn)經(jīng)國內(nèi)外進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)其具有神經(jīng)保護(hù)作用。以下對芍藥苷的神經(jīng)保護(hù)作用的研究進(jìn)展作一綜述，為進(jìn)一步開發(fā)提供依據(jù)。
1 對腦缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用
腦缺血-再灌注損傷后由于腦缺血后腦細(xì)胞缺血缺氧，腦細(xì)胞膜上Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶失活，ATP含量迅速下降、功能衰竭，造成腦組織能量代謝障礙及自由基連鎖反應(yīng)，使生物膜的運(yùn)輸功能發(fā)生障礙，引起水和電解質(zhì)代謝紊亂，而導(dǎo)致腦細(xì)胞損傷、水腫。在動物腦缺血-再灌注損傷模型上觀察到芍藥苷有保護(hù)作用。
孫蓉等［1］觀察芍藥苷對大鼠腦缺血后再灌注期間血腦屏障及腦缺血神經(jīng)病理改變癥狀、腦血流量的影響，采用大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，以神?jīng)行為學(xué)、腦組織含水量、病理組織學(xué)檢查、血腦屏障通透性、腦血流量為指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與模型對照組比較，局灶性腦缺血1 h再復(fù)灌3 d后，應(yīng)用芍藥苷的各組動物的神經(jīng)行為學(xué)、腦組織含水量、組織病理學(xué)改變和血腦屏障通透性均得到改善，大腦局部血流量顯著增加，說明芍藥苷對腦缺血后腦水腫、血腦屏障、大腦局部血流量等具有保護(hù)作用；另外［2］，用沙土鼠雙側(cè)頸總動脈夾閉腦缺血再灌注模型，于再灌注后48 h取腦皮質(zhì)測定Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶、乳酸、NO和NOS水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)對照組比較，缺血再灌注后48 h腦組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶活性均降低，NO含量和NOS活性降低，而乳酸含量無明顯變化；與模型對照組比較，芍藥苷高、中、低劑量均可不同程度地防止缺血再灌注48 h后Na+-K+-ATP酶活性的降低，增加Ca2+-ATP酶和Mg2+-ATP酶活性，增加NO含量，提高NOS活性，結(jié)論認(rèn)為芍藥苷通過調(diào)節(jié)腦內(nèi)能量代謝和NO的生成而發(fā)揮抗腦缺血作用。
Chen DM等［3］在大腦中動脈閉塞再灌注模型上研究芍藥苷預(yù)處理誘導(dǎo)延緩神經(jīng)蛋白的作用機(jī)制，在鼠大腦中動脈閉塞后再灌注24 h的實(shí)驗(yàn)前48 h分別應(yīng)用20，40 mg/kg芍藥苷預(yù)處理能明顯降低死亡率，減少大腦梗塞面積，減少神經(jīng)細(xì)胞丟失。在大腦中動脈閉塞再灌注后24，48 h， 5 d予20 mg/kg芍藥苷也有相似作用；應(yīng)用比較蛋白組學(xué)鑒定芍藥苷預(yù)處理誘導(dǎo)的蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)芍藥苷預(yù)處理后相關(guān)蛋白表達(dá)水平改變，20種升高，另22種降低；一系列相關(guān)蛋白、分子包括NO系統(tǒng)、神經(jīng)損害標(biāo)記物、促分裂素蛋白酶等參與了芍藥苷預(yù)處理的作用機(jī)制。
Liu DZ等［4］在大鼠短暫性局部腦缺血模型（結(jié)扎大腦中動脈1.5 h）及持久局部腦缺血模型上，皮下注射芍藥苷2.5 mg·kg-1 及5mg·kg-1均能減少神經(jīng)細(xì)胞缺失及減少腦梗塞面積，且呈量-效關(guān)系；這種神經(jīng)保護(hù)作用能被腺苷A1受體拮抗劑DPCPX所抑制。
2 對慢性動脈性腦缺血的保護(hù)作用
Xiao L等［5］在大腦中動脈閉塞模型上觀察芍藥苷的作用，應(yīng)用大腦中動脈閉塞造成慢性（4周）一過性腦缺血大鼠模型，觀察腦梗塞面積、神經(jīng)系統(tǒng)癥狀、伸舌動作、水迷宮移動等指標(biāo)；結(jié)果發(fā)現(xiàn)1 d（10 mg/kg，2次/d）或7 d（2.5～10 mg/kg，2次/d）皮下注射芍藥苷法均能起減少腦梗塞面積、改善神經(jīng)系統(tǒng)癥狀等保護(hù)作用。
3 保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞作用
3.1 抑制細(xì)胞凋亡 研究證實(shí)［6］腦缺血-再灌注損傷后4h出現(xiàn)凋亡細(xì)胞，24 h達(dá)高峰，并持續(xù)到96 h。大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株P(guān)C12細(xì)胞廣泛應(yīng)用于神經(jīng)生理和神經(jīng)藥理學(xué)研究。孫蓉等［7］探討一氧化氮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡及芍藥苷的保護(hù)作用的機(jī)制，應(yīng)用MTT和乳酸脫氫酶活性測定細(xì)胞存活率，DNA凝膠電泳觀察DNA的斷裂情況，流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率、檢測線粒體跨膜電位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)硝普鈉(SNP)可誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡，細(xì)胞線粒體跨膜電位明顯下降，預(yù)先經(jīng)過芍藥苷處理后，SNP誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡明顯減少，同時(shí)明顯減弱一氧化氮對線粒體跨膜電位的影響，說明芍藥苷可抑制一氧化氮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與其穩(wěn)定細(xì)胞線粒體跨膜電位有關(guān)。
3.2 活化腺苷A1受體，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞已知的腺苷受體有4種亞型(A1、A2a、A2b及A3 受體)，均屬于與G蛋白耦聯(lián)的受體家族，可與相應(yīng)的G蛋白耦聯(lián)，介導(dǎo)廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，進(jìn)而調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶、鳥苷酸環(huán)化酶、離子通道及磷脂酶的活性［8］。腺苷作用于A1受體，可抑制神經(jīng)元的興奮性，從而降低能量的消耗；另一方面，腺苷可以擴(kuò)張局部腦血管，增加受損腦區(qū)的血流量，從而增加細(xì)胞的能量供應(yīng)［9］。Liu HQ等［10］研究發(fā)現(xiàn)芍藥苷有對帕金森病小鼠模型的神經(jīng)保護(hù)作用；皮下注射芍藥苷2.5及5 mg·kg-111 d，在注射第8天時(shí)開始注射MPTP 20 mg·kg-1，1次/d，共4次，觀察到芍藥苷能防止黑質(zhì)及紋狀體神經(jīng)纖維運(yùn)動徐緩或死亡；另一實(shí)驗(yàn)方法是先注射4次MPTP，在最后1次注射1 h后皮下注射芍藥苷2.5及5 mg·kg-13 d，1次/d，觀察到芍藥苷能減輕多巴胺能神經(jīng)變性的作用，且呈量-效關(guān)系；用5 mg·kg-1芍藥苷處理能明顯減少M(fèi)PTP誘發(fā)的促炎癥反應(yīng)因子增量調(diào)節(jié)及抑制小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及星形細(xì)胞的激活；每次注射芍藥苷前15 min應(yīng)用腺苷A1受體拮抗劑預(yù)處理，能拮抗芍藥苷的神經(jīng)保護(hù)作用；據(jù)此推測芍藥苷能活化腺苷A1受體，起神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用。
3.3 對抗興奮性氨基酸海人藻酸所致的神經(jīng)細(xì)胞損傷 吳玉梅等［11］探討芍藥苷是否促進(jìn)培養(yǎng)皮層神經(jīng)細(xì)胞的存活，并對抗興奮性氨基酸海人藻酸(KA)所致的神經(jīng)損傷，解剖分離15 d胚胎小鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞，接種于24孔板中加藥培養(yǎng)，臺盼藍(lán)染色細(xì)胞，相差顯微鏡及免疫組織細(xì)胞化學(xué)方法進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn):①加入芍藥苷20.8和41.6 mg·L-1培養(yǎng)4 d增加神經(jīng)細(xì)胞存活數(shù)量，降低死亡率；②加入KA 50 μmol·L-1 作用30 min，神經(jīng)元腫脹，失去折光性，核偏位，死亡率增高，預(yù)先加入芍藥苷20.8和41.6 mg·L-1 培養(yǎng)4 d，可對抗KA所致的神經(jīng)損傷，結(jié)果證明芍藥苷可增加神經(jīng)細(xì)胞存活數(shù)量，降低死亡率，對抗KA所致的興奮性神經(jīng)損傷，但其機(jī)理有待進(jìn)一步研究。
3.4 與腦星形膠質(zhì)細(xì)胞的關(guān)系Liu J等［12］研究芍藥苷對大鼠慢性腦供血不足的保護(hù)作用，持續(xù)結(jié)扎頸動脈7周后，處死大鼠，應(yīng)用免疫組化技術(shù)標(biāo)記腦海馬神經(jīng)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)慢性供血不足可致大鼠腦星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞增多，而應(yīng)用芍藥苷后這些細(xì)胞沒有增多；大鼠慢性供血不足后星形膠質(zhì)細(xì)胞中NF-Kβ表達(dá)增加，而芍藥苷能減少NF-Kβ表達(dá)。結(jié)果表明芍藥苷能減輕慢性腦供血不足引起的認(rèn)知障礙，可能機(jī)制是芍藥苷誘導(dǎo)相關(guān)腦神經(jīng)蛋白生成。我們知道星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用不僅僅是支持和營養(yǎng)神經(jīng)元，還參與了神經(jīng)元發(fā)育至神經(jīng)損傷的各種復(fù)雜過程。芍藥苷能抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性似與芍藥苷的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用矛盾。但吳玉梅等［13］研究發(fā)現(xiàn)芍藥苷對星形膠質(zhì)細(xì)胞活性有明顯的抑制作用，推測芍藥苷促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞活性的作用是一種直接的作用，而不是通過膠質(zhì)細(xì)胞間接影響神經(jīng)細(xì)胞。
3.5 阻斷鈉通道，抑制鈉內(nèi)流，減輕腦缺氧損傷 鈉通道失活，鈉鈣交換障礙，持續(xù)鈉向內(nèi)流是細(xì)胞缺氧損傷的主要機(jī)制。Zhang GQ等［14］應(yīng)用膜片鉗技術(shù)，研究芍藥苷阻斷小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞鈉通道，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以抑制頻率依賴及濃度依賴鈉通道方式，0.3 mmol/L芍藥苷把最大激活電位從-40mV提高到-30mV，增大穩(wěn)態(tài)激活曲線及失活曲線，鈉通道從失活態(tài)恢復(fù)的時(shí)間從（4.2±0.7）ms延遲到（9.8±1.2） ms。說明芍藥苷有阻斷腦海馬CA1區(qū)細(xì)胞鈉通道的作用。這可能是芍藥苷保護(hù)腦缺氧細(xì)胞損傷的機(jī)制之一。
3.6 對大腦海馬CA1區(qū)損害的保護(hù)作用 Tsuda T等［15］在鈷致大鼠癲癇模型上研究芍藥提取物對大腦海馬CA1區(qū)損害的保護(hù)作用，連續(xù)30 d給大鼠1 g/kg/d灌胃后，應(yīng)用鈷造成大鼠癲癇模型，可觀察到大腦皮層頻發(fā)棘波及大腦海馬CA1區(qū)損害能被芍藥提取物防護(hù)，單用芍藥苷或天然鞣酸沒發(fā)現(xiàn)類似作用，但聯(lián)用兩者有防護(hù)作用。
3.7 對細(xì)胞鈣超載損傷的保護(hù)作用 楊軍等［16］探討芍藥苷對大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤克隆株P(guān)C12細(xì)胞鈣超載損傷模型的保護(hù)作用及其機(jī)制，采用組織培養(yǎng)法，制備氧化鉀及N-甲基-D-門冬氨酸誘導(dǎo)的鈣超載損傷模型，結(jié)果形態(tài)學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)芍藥苷對兩種不同類型的鈣超載損傷模型中PC12細(xì)胞均具有明顯保護(hù)作用，MTT法活細(xì)胞測定提示芍藥苷可顯著提高損傷模型中PC12細(xì)胞存活數(shù)，減少胞內(nèi)乳酸脫氫酶滲漏，并顯著減少細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，說明芍藥苷對鈣超載所致PC12細(xì)胞損傷有顯著的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與抑制鈣離子內(nèi)流有關(guān)。另研究表明［17］，芍藥苷對咖啡因型、氯化鉀型、N-甲基-D-門冬氨酸(NMDA)型細(xì)胞內(nèi)超載損傷均具有保護(hù)作用，且隨著濃度的增加，芍藥苷保護(hù)作用更加明顯，強(qiáng)度依次為氯化鉀、咖啡因型和NMDA型。芍藥苷也能抑制藜蘆堿誘導(dǎo)的大鼠心房收縮和心律失常。這些均顯示它可能具有鈣通道阻斷作用［18］。
4 對小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用
孫蓉等［19］觀察芍藥苷對東莨菪堿致小鼠記憶形成障礙、亞硝酸鈉致記憶鞏固障礙和乙醇致記憶再現(xiàn)障礙的影響。采用小鼠跳臺法和Y一型迷宮法， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)芍藥苷對小鼠學(xué)習(xí)記憶功能有明顯的促進(jìn)作用，對東莨菪堿致小鼠記憶形成障礙、亞硝酸鈉致記憶鞏固障礙和乙醇致記憶再現(xiàn)障礙有明顯的改善作用，且呈一定的量效關(guān)系，說明芍藥苷對東莨菪堿、亞硝酸鈉和乙醇致小鼠記憶獲得、鞏固及再現(xiàn)障礙均有不同程度的改善作用。
Tabata K［20］研究芍藥苷對腺苷A1受體介導(dǎo)記憶障礙的作用，對小鼠訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)后24 h應(yīng)用選擇性腺苷A1受體激動劑能引起記憶行為損害，腹膜注射芍藥苷及腺苷A1受體拮抗劑DPCPX能減輕這種損害，體外實(shí)驗(yàn)顯示腺苷能劑量依賴性地降低棘波振幅及減少大腦海馬的長時(shí)程增強(qiáng)(LTP)的強(qiáng)直刺激，DPCPX能拮抗腺苷的這些作用，而單用DPCPX則對棘波振幅及LTP沒有影響；芍藥苷能拮抗腺苷的減少大腦海馬的長時(shí)程增強(qiáng)(LTP)的強(qiáng)直刺激作用，而不能拮抗腺苷的降低棘波振幅作用；結(jié)果說明芍藥苷能改善腺苷A1受體介導(dǎo)的認(rèn)知、記憶障礙。
Tabata K等［21］還通過記錄大鼠腦海馬CA1區(qū)的群峰電位，M1、M2受體拮抗劑東莨菪堿和選擇性M1受體拮抗劑哌吡卓酮均能抑制群峰電位的長時(shí)程增強(qiáng)，而M2受體拮抗劑AF-DX116則不能，單用芍藥苷不能起抑制作用，但能對抗東莨菪堿和哌吡卓酮的抑制作用，結(jié)果說明芍藥苷對抗M1受體拮抗劑的作用可能是芍藥苷改善因膽堿能功能障礙引起的空間認(rèn)知缺損的機(jī)制。
5 誘導(dǎo)熱休克蛋白生成
熱休克蛋白是一種分子伴侶，其功能由幫助蛋白質(zhì)正確折疊、移位、維持和降解，具有調(diào)節(jié)蛋白功能及抗蛋白質(zhì)毒性作用，有對細(xì)胞的結(jié)構(gòu)維持、更新、修復(fù)、免疫等有重要作用。機(jī)體應(yīng)激時(shí)誘生熱休克蛋白，在分子水平上對機(jī)體保護(hù)作用。Yan D等［22］研究發(fā)現(xiàn)而芍藥苷不但能加強(qiáng)誘導(dǎo)熱休克蛋白，也可直接誘導(dǎo)熱休克蛋白;應(yīng)用芍藥苷處理細(xì)胞能加強(qiáng)熱休克基因轉(zhuǎn)錄因子磷酸化及結(jié)合脫氧核糖核苷酸的能力，提示芍藥苷誘導(dǎo)熱休克蛋白的機(jī)制是活化熱休克基因轉(zhuǎn)錄因子，即使高劑量也未見產(chǎn)生毒性作用。
6 舒張動脈血管
Tsai HY等［23］發(fā)現(xiàn)單用芍藥苷對離體大鼠大動脈沒有作用，但能減輕藜蘆堿的收縮動脈作用，尤其是對有內(nèi)皮組織的大動脈，應(yīng)用藜蘆堿預(yù)處理能增強(qiáng)新福林和去甲腎上腺素的收縮動脈作用，去甲腎上腺素介導(dǎo)的藜蘆堿收縮動脈作用的舒張與NO及cGMP的增加有關(guān)，藜蘆堿收縮動脈作用是通過增加細(xì)胞內(nèi)鈣引起，而芍藥苷可抑制細(xì)胞內(nèi)鈣的增加，因此有減輕藜蘆堿的收縮動脈作用。
7 抗血栓形成作用
Ye J等［24］在光化學(xué)反應(yīng)微血管血栓形成模型上觀察到芍藥苷有抗血栓形成作用，芍藥苷能延長凝血時(shí)間；其機(jī)制可能與芍藥苷抑制花生四烯酸代謝，增強(qiáng)組織型纖維蛋白溶煤原活化劑活性，以及對抗氧自由基的作用。
8 結(jié)語
綜上所述，芍藥苷是芍藥的主要有效成分，在體內(nèi)能通過血腦屏障， 對腦缺血-再灌注損傷有保護(hù)作用。通過抑制細(xì)胞凋亡、 活化腺苷A1受體、阻斷鈉通道，抑制鈉內(nèi)流、減輕細(xì)胞鈣超載損傷等作用機(jī)制發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞作用。還有抗血栓形成、誘導(dǎo)熱休克蛋白生成、舒張動脈血管及鎮(zhèn)痛作用。也能改善小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。目前，有關(guān)芍藥苷的神經(jīng)保護(hù)作用研究僅限于動物實(shí)驗(yàn)，具體機(jī)理還不太清楚，有待進(jìn)一步深入研究。
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【摘要】 目的 探索結(jié)腸癌colo205細(xì)胞系對exosomes的分泌功能，并分析熱休克作用對表面蛋白CD44v6表達(dá)量的影響。方法 采用超速離心法分離colo205細(xì)胞分泌的exosomes和熱休克處理后colo205細(xì)胞分泌的exosomes(Heat shocked exosomes，HSExo)，經(jīng)220 nm微孔濾膜過濾純化后，在透射電鏡下觀察其形態(tài)，并用SDSPAGE方法分析細(xì)胞與exosomes的蛋白組成，Western Blot檢測表面CD44v6的表達(dá)情況。結(jié)果 經(jīng)透射電鏡觀察，正常exosomes與HSExo形態(tài)基本相似，均為圓形或橢圓形膜性囊泡，直徑大多在30～100 nm之間，且經(jīng)熱休克處理的colo205細(xì)胞及其分泌的HSExo，在CD44v6表達(dá)量上較正常colo205細(xì)胞及exosomes顯著上調(diào)(P
【關(guān)鍵詞】 結(jié)腸癌;exosomes;CD44v6;腫瘤免疫
外脂體是由細(xì)胞多囊體形成的一種膜性小囊泡，其來源十分廣泛，其特異功能與來源細(xì)胞密切相關(guān)：外脂體攜帶著許多種獨(dú)特的蛋白，如黏附蛋白，熱休克蛋白等，在信號傳導(dǎo)中起重要作用。作為一種免疫治療的新手段，外脂體可以應(yīng)用于腫瘤治療。CD44v6是CD44 的一種拼接變異體，其表達(dá)可改變腫瘤細(xì)胞表面細(xì)胞黏附分子的構(gòu)成和功能，有助于腫瘤細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)移潛能，起到介導(dǎo)細(xì)胞間黏附、參與信號傳遞等作用，并與腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)。目前，結(jié)腸癌外脂體腫瘤疫苗的研究才剛剛起步，主要是從LoVo、LS174T等細(xì)胞系中分離外脂體〔1，2〕，對其腫瘤免疫功能有較多的研究，但對結(jié)腸癌細(xì)胞分泌的外脂體表面相關(guān)蛋白的研究相對較少，尤其對其表面CD44v6的檢測至今在國內(nèi)外未見報(bào)道。因此，本課題組擬采用超速離心法從結(jié)腸癌細(xì)胞系中分離外脂體，對其表面分子CD44v6的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，并分析熱休克作用對CD44v6表達(dá)量的影響，為結(jié)腸癌亞細(xì)胞疫苗的研究及應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。
1 資料與方法
1.1 材料 RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清均購自美國Gibco公司，胰蛋白酶、對鈉十二烷基硫酸鹽(SDS)均購自美國Sigma公司，丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、預(yù)染蛋白Marker、均購自北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司，硝酸纖維素轉(zhuǎn)印膜購自美國PALL公司，鼠抗人CD44v6單克隆抗體、辣根過氧化物酶(HPR)標(biāo)記山羊抗小鼠IgG均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒、超敏化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所，人結(jié)腸癌colo205細(xì)胞株由吉林大學(xué)藥學(xué)院生物工程實(shí)驗(yàn)中心提供。JEM2000EX透射電子顯微鏡購自日本電子公司、OptimaTM LE80K 低溫超速離心機(jī)購自美國Beckman Coulter公司，Olympus IX70倒置顯微鏡購自日本Olympus公司。
1.2 結(jié)腸癌細(xì)胞的培養(yǎng)和熱休克處理 實(shí)驗(yàn)選用結(jié)腸癌Colo205細(xì)胞株，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液于37℃、5% CO2條件下進(jìn)行常規(guī)原代培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底80%后，擬提取exosomes，將培養(yǎng)細(xì)胞用不含小牛血清的RPMI1640洗滌2次，并繼續(xù)培養(yǎng)48 h，臺酚藍(lán)染色檢測細(xì)胞活力(細(xì)胞活力應(yīng)大于97%)。此后，細(xì)胞于43℃孵育2 h，再于37℃恢復(fù)4 h〔3〕，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)變化。
1.3 熱休克源性exosomes(Heat shocked exosomes，HSExo)和非熱休克源性exosomes的提取及純化〔4，5〕 收集結(jié)腸癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液，依次經(jīng)300 r/min離心5 min、1 200 r/min離心20 min和6 000 r/min離心30 min，去除上清液中的細(xì)胞碎片等顆粒后，再以100 000 r/min離心60 min，收集沉淀，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗1次。棄上清液，加入20 μl PBS重懸沉淀即為exosomes。-80℃凍存?zhèn)溆?，使用前?.22 μm濾膜過濾純化。
1.4 電鏡觀察分析 取5 μl exosomes和HSExo，滴于載樣銅網(wǎng)上，濾紙吸干液體，在滴加2%磷鎢酸染液，負(fù)染1 min，待白熾燈烤干后約10 min，用透射電鏡觀察并照相。
1.5 結(jié)腸癌細(xì)胞及exosomes表面蛋白的分離 取經(jīng)熱休克處理和未處理的結(jié)腸癌細(xì)胞和相應(yīng)的exosomes，分別放入細(xì)胞裂解液中，與冰上放置1 h，制得溶解物〔1〕。于100℃處理10 min，進(jìn)行蛋白質(zhì)變性，用二喹啉甲酸(BCA)法檢測蛋白濃度。
1.6 Exosomes表面蛋白CD44v6的檢測 設(shè)正常colo205細(xì)胞組、熱休克處理的細(xì)胞組、正常外脂體組和熱休克外脂體組，各組設(shè)3個復(fù)孔，經(jīng)蛋白濃度檢測后，各組以等量蛋白上樣，進(jìn)行8% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)。電泳后將凝膠中的蛋白質(zhì)通過濕法電轉(zhuǎn)移方法，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，并用含5%脫脂牛奶的Tris緩沖鹽溶液(TBS)封閉硝酸纖維素膜，37℃作用3 h，將鼠抗人CD44v6單抗用含5%脫脂牛奶的TBS以1∶1 000稀釋，膜與一抗置于封閉塑料袋內(nèi)，4℃過夜。用TBS洗膜3次，再與辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG 37℃下結(jié)合1 h，用TBS充分洗膜3次，經(jīng)ECL化學(xué)發(fā)光試劑作用顯色后，于暗盒內(nèi)曝光，X光片顯影定影后分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用Quantity one v4.62圖像分析軟件進(jìn)行分析，結(jié)果以x±s表示，組內(nèi)采用t檢驗(yàn)。
2 結(jié) 果
2.1 熱休克colo205細(xì)胞的觀察 未經(jīng)熱休克處理的colo205細(xì)胞大多處于貼壁生長狀態(tài)，少量懸浮生長;熱休克處理之后懸浮細(xì)胞明顯增多，但鏡下未見形態(tài)學(xué)改變，見圖1。圖1 正常和熱休克處理的colo205細(xì)胞(×200)
2.2 結(jié)腸癌colo205細(xì)胞源exosomes和HSexo的電鏡觀察 透射電鏡下可見exosomes和HSexo大小不一，直徑基本在30～100 nm之間，個別較大，二者形態(tài)基本相似，無明顯差別，均為圓形或橢圓形膜性囊泡，并且在局部有相互聚集的傾向，見圖2。
2.3 SDSPAGE結(jié)果 從SDSPAGE結(jié)果可見，在220 kD與105 kD之間，各樣品組均在一定位置出現(xiàn)條帶，但兩個細(xì)胞組與兩個exosomes組的條帶位置有較大差異，而針對細(xì)胞組和exosomes組的組內(nèi)比較條帶位置差異并不顯著。CD44v6的分子量約為190 kD，電泳結(jié)果顯示在此區(qū)域有蛋白條帶存在(1組為正常colo205細(xì)胞，2組為熱休克colo205細(xì)胞，3組為正常外脂體，4組為熱休克外脂體)。見圖3。圖2 exosomes和HSExo陽性圖片(×100 000)圖3 SDSPAGE結(jié)果
2.4 Western印跡結(jié)果分析 正常colo205細(xì)胞、熱休克處理的細(xì)胞、exosomes和HSexo 4組經(jīng)顯影定影后均可見清洗條帶。見圖4。用Quantity one v4.62圖像分析軟件對Western印跡結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果顯示經(jīng)熱休克處理后，CD44v6在細(xì)胞及exosomes上均出現(xiàn)了表達(dá)上調(diào)的現(xiàn)象(P
3 討 論
腫瘤來源的exosomes(Tumor Exosomes，TEX)，在形態(tài)學(xué)、密度以及一些膜標(biāo)志物的表達(dá)上與抗原提成細(xì)胞(APCs)來源的exosomes相似〔5〕。TEX中存在腫瘤抗原運(yùn)載系統(tǒng)以及與細(xì)胞靶向性有關(guān)的蛋白(CD9)，這表明exosomes是一種抗原傳遞系統(tǒng)，能將腫瘤抗原轉(zhuǎn)移到APCs。另外，TEX中含有許多腫瘤細(xì)胞所共有的共同抗原，TEX能將其轉(zhuǎn)移到DC，導(dǎo)致交叉性呈遞的CTL反應(yīng)〔6〕。熱休克反應(yīng)是機(jī)體受到高溫、缺氧、重金屬離子、紫外線照射等理化因素的作用后，所產(chǎn)生的一種保護(hù)機(jī)體免受損傷的應(yīng)激反應(yīng)。熱休克蛋白是在熱休克反應(yīng)作用下，啟動熱休克蛋白基因選擇性合成的一組高度保守的蛋白質(zhì)分子家族。近年來研究發(fā)現(xiàn)，人類腫瘤細(xì)胞中存在熱休克反應(yīng)，與腫瘤的生長、增殖及凋亡密切相關(guān)，表明熱休克處理結(jié)腸癌細(xì)胞的方法，使細(xì)胞某些蛋白的表達(dá)上調(diào)，TEX中相應(yīng)的蛋白含量也隨之增加〔1〕;另外，熱休克處理可以在一定程度上提高TEX的產(chǎn)量〔7〕。在本實(shí)驗(yàn)中，CD44v6表達(dá)上調(diào)的現(xiàn)象與相關(guān)研究一致，但并未發(fā)現(xiàn)熱休克作用可提高結(jié)腸癌源TEX的產(chǎn)量，所以認(rèn)為：不同細(xì)胞系的熱休克反應(yīng)往往有所區(qū)別，作用方式的差異常導(dǎo)致作用結(jié)果不盡一致，熱休克處理不一定提高每種細(xì)胞系exosomes的產(chǎn)量。熱休克作用會對exosomes產(chǎn)生影響，但作用機(jī)制還需進(jìn)一步探索與研究。
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