發布時間：2022-05-24 09:31:46
開篇：寫作不僅是一種記錄，更是一種創造，它讓我們能夠捕捉那些稍縱即逝的靈感，將它們永久地定格在紙上。下面是小編精心整理的1篇植物組織培養論文，希望這些內容能成為您創作過程中的良師益友，陪伴您不斷探索和進步。
論文關鍵詞:植物組織培養褐變酚類物質多酚氧化酶醌類物質
論文摘要:植物組織培養過程中，褐變問題普遍存在,與菌類污染和玻璃話現象并稱為植物組織培養的三大難題。針對褐變難題，本文結合相關資料，對影響褐變的因素作了全面分析，褐變的影響因素是復雜的，隨植物種類外植體的部位幾生理狀況培養基及培養條件的不同而危害的程度有所不同，對這些因素是內因外界影響作用作了分析并針對這些因素提出了相應的解決措施。
在許多植物組織培養過程中，常遇到褐變問題。褐變主要發生在外植體，在植物愈傷組織的繼代、懸浮細胞培養以及原生質體的分離與培養中也經常發生。褐變產物不僅使外植體、細胞、培養基等變褐，而且對許多酶有抑制作用，從而影響培養材料的生長與分化，嚴重時甚至導致死亡。本文探討植物組織培養中褐變現象的影響因素、機理及防范措施，對我們進行科學研究或工廠生產，包括植物組織的培養,原生質體、懸浮細胞和植物器官的培養都有著十分重要的現實意義。
1褐變原因及危害
褐變是指外植體在培養過程中,自身組織從表面培養基釋放褐色物質,以致培養基逐漸變成褐色,外植體也隨之進一步變褐而死亡的現象。褐變的發生與外植體組織中所含的酚類化合物數量多少及多酚氧化酶活性有直接關系。很多植物，尤其是木本植物都含有較高的酚類化合物，這些酚類化合物在完整的組織和細胞中與多酚氧化酶分隔存在，因而比較穩定。在切割外植體時，切口附近的細胞受到傷害，其分割狀態被打破，酚類化合物外溢。對于外植體本身來講，酚類物質從外植體切口向外溢出是一種自我保護性反應，可誘導植保素或無物理屏障的形成，以防止微生物侵染組織。但酚類很不穩定，在溢出過程中與多酚氧化酶接觸，在多酚氧化酶的催化下，迅速氧化成褐色的醌類物質和水，醌類物質又會在酪氨酸酶等的作用下，與外植體組織中的蛋白質發生聚合，進一步引起其他酶系統失活。從而導致組織代謝活動紊亂，生長停滯，最終衰老死亡。此外，由于組織的老化病變也會使多酚氧化酶激活而引起褐變。
2褐變產生的機理
2.1非酶促褐變
非酶促褐變是由于細胞受脅迫或其他不利條件影響所造成的細胞程序化死亡或自然發生的細胞死亡，即壞死形成的褐變現象，并不涉及酚類物質的產生。徐振彪等[1]將生長正常的愈傷組織轉移到含NaCl的培養基中，組織周圍尤其是接觸培養基部分發生褐變，但培養基中沒有看到擴散的褐化物質。當溫度升高時繼代保存時間過長，也會發生此類現象。但這種褐變若采取適當措施或者愈傷組織適應了脅迫環境就不再發生了[3]。
2.2酶促褐變
目前認為植物組織培養中的褐變主要是由酶促褐變引起的，培養材料變褐主要是由傷口處分泌的酚類化合物引起的[4]。酶促褐變如同一般的酶促反應，其發生必須具備三個條件，即酶、底物和氧。引起褐變的酶有多酚氧化酶(PPO)、過氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶等。從初次培養和繼代培養過程中試管苗的褐變程度和PPO的活性來看，表明PPO活性的高低是引起培養材料褐變的關鍵。引起褐變的酶的底物主要是酚類化合物，按其組成可分成3類:苯基羧酸（包括鄰羥基苯酚、兒茶酚、沒食子酸、莽草酸等），苯丙烷衍生物（包括綠原酸、肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、單寧、木質素等），第三類是黃烷衍生物（包括花青素、黃酮、蕓香苷等），但并非所有的酚類物質都是PPO的底物。
在正常發育的植物組織中,底物、氧氣、PPO同時存在并不發生褐變，是因為在正常的組織細胞內由于多酚類物質分布在細胞的液泡內，而PPO則分布在各種質體或細胞質中，這種區域性分布使底物與PPO不能接觸。而當細胞膜的結構發生變化和破壞時，則為酶創造了與PPO接觸的條件，在氧存在的情況下使酚類物質氧化成醌，進行一系列的脫水、聚合反應，最后形成黑褐色物質，從而引起褐變。
3褐變產生的影響因素
影響植物組織培養褐變的因子是復雜的，因植物的種類、基因型、外植體部位及生理狀態等不同，褐變的程度也有所不同。
3.1植物種類及基因型不同的植物和不同的基因型決定了不同的褐化程度。在組織培養中，品種褐化難易可能是與該品種中多酚類物質含量的多少及多酚氧化酶(PPO)活性的差異有關。
3.2外植體部位及生理狀態外植體的部位及生理狀態不同其褐化程度不同，同時，不同時期和不同年齡的外植體在培養中褐變的程度也不同。
3.3培養基成分培養基成分中的無機鹽、蔗糖濃度、激素水平等對褐變的程度的影響尤為重要。另外，其pH值也與褐變程度有較大關系。
3.4培養條件溫度過高或光照過強，均可加速被培養組織的褐變。不利環境條件都能造成細胞的程序化死亡，溫度是誘導程序化死亡的主要因素[1]。
4防止外植體產生褐變的對策
從理論上講,酶促褐變可以通過以下三種方法加以抑制:一是除去引起氧化的物質——氧；二是捕捉或減少聚合反應的中間產物；三是抑制有關的酶。實際操作上，下列措施是被認為行之有效的。
4.1適當外植體的選擇
取材時應注意選擇褐變程度較小的品種和部位作外植體。成年植株比幼苗褐變程度厲害，夏季材料比冬季及早春和秋季材料的褐變要嚴重。冬季的芽不易生長，宜選用早春和秋季的材料作為外植體。王異星[5]用荔枝無菌苗不同組織的誘導試驗表明，莖最容易誘導出愈傷組織，培養2周后長出淺黃色的愈傷組織；葉大部分不能產生愈傷組織或誘導出的愈傷組織中度褐變；而根極大部分不產生愈傷組織，誘導出的愈傷組織全部褐變。
4.2對外植體的處理
通過對較易褐變的外植體材料的預處理能減輕醌類物質的毒害作用。處理方法如下：外植體經流水沖洗后，在2-5℃的低溫下處理12-24小時，再用升汞或70%酒精消毒，然后接種于只含有蔗糖的瓊脂培養基中培養5-7天，使組織中的酚類物質部分滲入培養基中。取出外植體用0.1%漂白粉溶液浸泡10分鐘，再接種到合適的培養基中。若仍有酚類物質滲出，3-5天后再轉移培養基2-3次，當外植體的切口愈合后，酚類物質減少，這樣可使外植體褐變減輕或完全被抑制。何瓊英等[6]用抗壞血酸預處理香蕉吸芽外植體，能減輕外植體褐變，從而提高芽叢誘導率。
4.3適宜的培養基
培養基的成分與褐變程度有關，要考慮所選培養基的狀態和類型。
4.3.1適當的無機鹽濃度張妙霞等[7]在柿樹組織培養防止褐變所進行的試驗中，4種培養基的無機鹽以改良MS(大量元素減半)和1/2MS的效果最好，MS的效果較差，結果證明低濃度的無機鹽可促進外植體的生長與分化，減輕外植體褐變的程度。徐振彪[1]在對玉米幼胚耐NaCl愈傷組織的篩選表明，隨NaCl濃度升高，褐變現象加重。
4.3.2適當和適量的激素王異星[5]在荔枝的組織培養過程中，培養基中添加1mg/LBA+0.5mg/L2,4-D時，愈傷組織較堅硬，增殖緩慢，易產生褐變。培養基中添加1mg/LBA+1mg/L2,4-D時，愈傷組織淺黃疏松，增殖也快。
4.3.3培養基的硬度在一定范圍內，瓊脂用量大，培養基硬度大，褐變率低[8]，這可能是培養基的硬度影響了酚類物質的擴散速度的緣故。
4.3.4培養基中水的硬度的影響硬度低的蒸餾水褐變率低,而使用硬度較高的自來水,褐變嚴重,甚至會出現褐變死亡[8]。這可能是配制培養基的水改變了培養基中無機鹽的濃度,間接地影響了植物外植體的褐變。
4.3.5培養基的pH值在水稻體細胞培養中，pH值為4.5-5.0時MS液體培養基可保持愈傷組織處于良好的生長狀態，其表面呈黃白色，而pH值為5.5-6.0時，愈傷組織嚴重褐變[9]。一般來說，酸性環境(pH值為4.5-5.0)不利于褐變過程的發生[10]。
4.3.6培養條件如溫度過高或光照過強，光照會提高PPO的活性，促進多酚類物質的氧化，從而加速被培養的組織褐變。高濃度CO2也會促進褐變，其原因是環境中的CO2向細胞內擴散，細胞內CO32-增多，CO32-與細胞膜上的CO32-結合，使有效CO32-減少，導致內膜系統瓦解，酚類物質與PPO相互接觸，產生褐變[11]。因此，初期培養要在黑暗或弱光下進行。
4.4添加褐變抑制劑和吸附劑
褐變抑制劑主要包括抗氧化劑和PPO抑制劑。在培養基中加入偏二亞硫酸鈉、L-半胱氨酸、抗壞血酸、檸檬酸、二硫蘇糖醇等抗氧化劑都可以與氧化產物醌發生作用，使其重新還原為酚[12]。由于其作用過程均為消耗性的，在實際應用中應注意添加量，其中L-半胱氨酸和抗壞血酸均對外植體無毒副作用，在生產應用中可不受限制。在水稻細胞的培養基中，添加植酸(PA)，可防止褐變，PA分子中眾多的羥基產生抗氧化作用，使生色物質的含量下降或PA與PPO分子中的Cu2+結合，從而降低了其活力。陳學森等[13]在對植酸在銀杏組織培養中應用的研究中也證實了植酸具有抑制多酚氧化酶活性的作用。
常用的吸附劑有活性炭和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)?；钚蕴渴且环N吸附性較強的無機吸附劑，能吸附培養基中的有害物質，包括瓊脂中的雜質、培養物在培養過程中分泌的酚、醌類物質以及蔗糖在高壓消毒時產生的5-羥甲基糠醛等,從而有利于培養物的生長。粉末狀的活性炭與顆粒狀的活性炭相比吸附性更強，一般在培養基中加入1-4g/L的活性炭。在使用過程中應注意，盡量用最低濃度的活性炭來對抗褐變的產生，因為活性炭的吸附作用是沒有選擇性的，在吸附物質的同時，也會吸附培養基中的其他成分，對外植體的誘導分化會產生一定的負面影響[14]。而聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是酚類物質的專一性吸附劑，在生化制備中常用作酚類物質和細胞器的保護劑，可用于防止褐變[15]。
4.5進行細胞篩選和多次轉移
在組織培養過程中，經常進行細胞篩選，可以剔除易褐變的細胞。在外植體接種1-2天后應立即轉移到新鮮培養基中，能減輕酚類物質對培養物的毒害作用，降低抑制作用，使外植體盡快分生，連續轉移5-6次，可基本解決外植體的褐變問題。
論文關鍵詞:植物組織培養褐變酚類物質多酚氧化酶醌類物質
論文摘要:植物組織培養過程中，褐變問題普遍存在,與菌類污染和玻璃話現象并稱為植物組織培養的三大難題。針對褐變難題，本文結合相關資料，對影響褐變的因素作了全面分析，褐變的影響因素是復雜的，隨植物種類外植體的部位幾生理狀況培養基及培養條件的不同而危害的程度有所不同，對這些因素是內因外界影響作用作了分析并針對這些因素提出了相應的解決措施。
在許多植物組織培養過程中，常遇到褐變問題。褐變主要發生在外植體，在植物愈傷組織的繼代、懸浮細胞培養以及原生質體的分離與培養中也經常發生。褐變產物不僅使外植體、細胞、培養基等變褐，而且對許多酶有抑制作用，從而影響培養材料的生長與分化，嚴重時甚至導致死亡。本文探討植物組織培養中褐變現象的影響因素、機理及防范措施，對我們進行科學研究或工廠生產，包括植物組織的培養,原生質體、懸浮細胞和植物器官的培養都有著十分重要的現實意義。
1褐變原因及危害
褐變是指外植體在培養過程中,自身組織從表面培養基釋放褐色物質,以致培養基逐漸變成褐色,外植體也隨之進一步變褐而死亡的現象。褐變的發生與外植體組織中所含的酚類化合物數量多少及多酚氧化酶活性有直接關系。很多植物，尤其是木本植物都含有較高的酚類化合物，這些酚類化合物在完整的組織和細胞中與多酚氧化酶分隔存在，因而比較穩定。在切割外植體時，切口附近的細胞受到傷害，其分割狀態被打破，酚類化合物外溢。對于外植體本身來講，酚類物質從外植體切口向外溢出是一種自我保護性反應，可誘導植保素或無物理屏障的形成，以防止微生物侵染組織。但酚類很不穩定，在溢出過程中與多酚氧化酶接觸，在多酚氧化酶的催化下，迅速氧化成褐色的醌類物質和水，醌類物質又會在酪氨酸酶等的作用下，與外植體組織中的蛋白質發生聚合，進一步引起其他酶系統失活。從而導致組織代謝活動紊亂，生長停滯，最終衰老死亡。此外，由于組織的老化病變也會使多酚氧化酶激活而引起褐變。
2褐變產生的機理
2.1非酶促褐變
非酶促褐變是由于細胞受脅迫或其他不利條件影響所造成的細胞程序化死亡或自然發生的細胞死亡，即壞死形成的褐變現象，并不涉及酚類物質的產生。徐振彪等[1]將生長正常的愈傷組織轉移到含NaCl的培養基中，組織周圍尤其是接觸培養基部分發生褐變，但培養基中沒有看到擴散的褐化物質。當溫度升高時繼代保存時間過長，也會發生此類現象。但這種褐變若采取適當措施或者愈傷組織適應了脅迫環境就不再發生了[3]。
2.2酶促褐變
目前認為植物組織培養中的褐變主要是由酶促褐變引起的，培養材料變褐主要是由傷口處分泌的酚類化合物引起的[4]。酶促褐變如同一般的酶促反應，其發生必須具備三個條件，即酶、底物和氧。引起褐變的酶有多酚氧化酶(PPO)、過氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶等。從初次培養和繼代培養過程中試管苗的褐變程度和PPO的活性來看，表明PPO活性的高低是引起培養材料褐變的關鍵。引起褐變的酶的底物主要是酚類化合物，按其組成可分成3類:苯基羧酸（包括鄰羥基苯酚、兒茶酚、沒食子酸、莽草酸等），苯丙烷衍生物（包括綠原酸、肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、單寧、木質素等），第三類是黃烷衍生物（包括花青素、黃酮、蕓香苷等），但并非所有的酚類物質都是PPO的底物。
在正常發育的植物組織中,底物、氧氣、PPO同時存在并不發生褐變，是因為在正常的組織細胞內由于多酚類物質分布在細胞的液泡內，而PPO則分布在各種質體或細胞質中，這種區域性分布使底物與PPO不能接觸。而當細胞膜的結構發生變化和破壞時，則為酶創造了與PPO接觸的條件，在氧存在的情況下使酚類物質氧化成醌，進行一系列的脫水、聚合反應，最后形成黑褐色物質，從而引起褐變。
3褐變產生的影響因素
影響植物組織培養褐變的因子是復雜的，因植物的種類、基因型、外植體部位及生理狀態等不同，褐變的程度也有所不同。
3.1植物種類及基因型不同的植物和不同的基因型決定了不同的褐化程度。在組織培養中，品種褐化難易可能是與該品種中多酚類物質含量的多少及多酚氧化酶(PPO)活性的差異有關。
3.2外植體部位及生理狀態外植體的部位及生理狀態不同其褐化程度不同，同時，不同時期和不同年齡的外植體在培養中褐變的程度也不同。
3.3培養基成分培養基成分中的無機鹽、蔗糖濃度、激素水平等對褐變的程度的影響尤為重要。另外，其pH值也與褐變程度有較大關系。
3.4培養條件溫度過高或光照過強，均可加速被培養組織的褐變。不利環境條件都能造成細胞的程序化死亡，溫度是誘導程序化死亡的主要因素[1]。
4防止外植體產生褐變的對策
從理論上講,酶促褐變可以通過以下三種方法加以抑制:一是除去引起氧化的物質——氧；二是捕捉或減少聚合反應的中間產物；三是抑制有關的酶。實際操作上，下列措施是被認為行之有效的。
4.1適當外植體的選擇
取材時應注意選擇褐變程度較小的品種和部位作外植體。成年植株比幼苗褐變程度厲害，夏季材料比冬季及早春和秋季材料的褐變要嚴重。冬季的芽不易生長，宜選用早春和秋季的材料作為外植體。王異星[5]用荔枝無菌苗不同組織的誘導試驗表明，莖最容易誘導出愈傷組織，培養2周后長出淺黃色的愈傷組織；葉大部分不能產生愈傷組織或誘導出的愈傷組織中度褐變；而根極大部分不產生愈傷組織，誘導出的愈傷組織全部褐變。
4.2對外植體的處理
通過對較易褐變的外植體材料的預處理能減輕醌類物質的毒害作用。處理方法如下：外植體經流水沖洗后，在2-5℃的低溫下處理12-24小時，再用升汞或70%酒精消毒，然后接種于只含有蔗糖的瓊脂培養基中培養5-7天，使組織中的酚類物質部分滲入培養基中。取出外植體用0.1%漂白粉溶液浸泡10分鐘，再接種到合適的培養基中。若仍有酚類物質滲出，3-5天后再轉移培養基2-3次，當外植體的切口愈合后，酚類物質減少，這樣可使外植體褐變減輕或完全被抑制。何瓊英等[6]用抗壞血酸預處理香蕉吸芽外植體，能減輕外植體褐變，從而提高芽叢誘導率。
4.3適宜的培養基
培養基的成分與褐變程度有關，要考慮所選培養基的狀態和類型。
4.3.1適當的無機鹽濃度張妙霞等[7]在柿樹組織培養防止褐變所進行的試驗中，4種培養基的無機鹽以改良MS(大量元素減半)和1/2MS的效果最好，MS的效果較差，結果證明低濃度的無機鹽可促進外植體的生長與分化，減輕外植體褐變的程度。徐振彪[1]在對玉米幼胚耐NaCl愈傷組織的篩選表明，隨NaCl濃度升高，褐變現象加重。
4.3.2適當和適量的激素王異星[5]在荔枝的組織培養過程中，培養基中添加1mg/LBA+0.5mg/L2,4-D時，愈傷組織較堅硬，增殖緩慢，易產生褐變。培養基中添加1mg/LBA+1mg/L2,4-D時，愈傷組織淺黃疏松，增殖也快。
4.3.3培養基的硬度在一定范圍內，瓊脂用量大，培養基硬度大，褐變率低[8]，這可能是培養基的硬度影響了酚類物質的擴散速度的緣故。
4.3.4培養基中水的硬度的影響硬度低的蒸餾水褐變率低,而使用硬度較高的自來水,褐變嚴重,甚至會出現褐變死亡[8]。這可能是配制培養基的水改變了培養基中無機鹽的濃度,間接地影響了植物外植體的褐變。
4.3.5培養基的pH值在水稻體細胞培養中，pH值為4.5-5.0時MS液體培養基可保持愈傷組織處于良好的生長狀態，其表面呈黃白色，而pH值為5.5-6.0時，愈傷組織嚴重褐變[9]。一般來說，酸性環境(pH值為4.5-5.0)不利于褐變過程的發生[10]。
4.3.6培養條件如溫度過高或光照過強，光照會提高PPO的活性，促進多酚類物質的氧化，從而加速被培養的組織褐變。高濃度CO2也會促進褐變，其原因是環境中的CO2向細胞內擴散，細胞內CO32-增多，CO32-與細胞膜上的CO32-結合，使有效CO32-減少，導致內膜系統瓦解，酚類物質與PPO相互接觸，產生褐變[11]。因此，初期培養要在黑暗或弱光下進行。
4.4添加褐變抑制劑和吸附劑
褐變抑制劑主要包括抗氧化劑和PPO抑制劑。在培養基中加入偏二亞硫酸鈉、L-半胱氨酸、抗壞血酸、檸檬酸、二硫蘇糖醇等抗氧化劑都可以與氧化產物醌發生作用，使其重新還原為酚[12]。由于其作用過程均為消耗性的，在實際應用中應注意添加量，其中L-半胱氨酸和抗壞血酸均對外植體無毒副作用，在生產應用中可不受限制。在水稻細胞的培養基中，添加植酸(PA)，可防止褐變，PA分子中眾多的羥基產生抗氧化作用，使生色物質的含量下降或PA與PPO分子中的Cu2+結合，從而降低了其活力。陳學森等[13]在對植酸在銀杏組織培養中應用的研究中也證實了植酸具有抑制多酚氧化酶活性的作用。
常用的吸附劑有活性炭和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)?；钚蕴渴且环N吸附性較強的無機吸附劑，能吸附培養基中的有害物質，包括瓊脂中的雜質、培養物在培養過程中分泌的酚、醌類物質以及蔗糖在高壓消毒時產生的5-羥甲基糠醛等,從而有利于培養物的生長。粉末狀的活性炭與顆粒狀的活性炭相比吸附性更強，一般在培養基中加入1-4g/L的活性炭。在使用過程中應注意，盡量用最低濃度的活性炭來對抗褐變的產生，因為活性炭的吸附作用是沒有選擇性的，在吸附物質的同時，也會吸附培養基中的其他成分，對外植體的誘導分化會產生一定的負面影響[14]。而聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是酚類物質的專一性吸附劑，在生化制備中常用作酚類物質和細胞器的保護劑，可用于防止褐變[15]。
4.5進行細胞篩選和多次轉移
在組織培養過程中，經常進行細胞篩選，可以剔除易褐變的細胞。在外植體接種1-2天后應立即轉移到新鮮培養基中，能減輕酚類物質對培養物的毒害作用，降低抑制作用，使外植體盡快分生，連續轉移5-6次，可基本解決外植體的褐變問題。
【摘 要】林木育種是推動林業產業可持續發展的基礎性工作。近年來，針對國內水土流失、土地沙漠化等生態問題，國家加大了對林業發展的重視程度，各級政府和林業部門也積極響應國家“綠色發展”理念，擴大林木種植面積。在這種情況下，林業發展對優質樹種的需求量不斷上升，而傳統的樹種培養周期較長，短時間內難以滿足地區林業發展需要，植物組織培養技術具有繁殖速度快、苗木質量高的優點，在現代林木育種中受到了廣泛的應用。
【關鍵詞】植物組織培養 林木育種 品種改良
植物組織培養是利用植物的某一組織或器官，在無菌環境下進行培養，并最終生產成完整植株的無性繁殖方法。隨著相關生物技術的不斷成熟和發展，植物組織培養已經廣泛的應用于植物育種工作中，在推動我國林業產業發展中發揮了重要作用。文章首先分析了組織培養技術在林木育種中的具體應用，隨后對其應用意義進行了論述，最后就組織培養技術的應用前景進行了總結展望。
1 組織培養技術在林木育種工作中的具體應用
1.1 實現苗木的快速、優質繁殖
目前，利用植物組織或器官實現繁殖育苗主要有三種形式：一是誘導母本植株上的腋芽發育，生成新的植株；二是誘導植株組織形成新的體胚，然后在利用特殊培養方式，促使體胚發育成新的植株；三是將植物組織誘導生成新的愈傷組織，利用愈傷組織的再分化能力，生成新的植株芽體，實現擴繁目的。三種林木育種方式各有優缺點，因此在開展植物組織培養時，應當結合實際情況，做到有針對性的科學選擇。
例如，在一些地理位置相對偏遠、交通不便的原始林區，由于人工管理困難，在林木種植上選擇松樹、柏樹林為主。這類樹木由于生長環境相對惡劣，因此對樹種的質量要求較為嚴格，以此來提高樹種移植后的成活率。在組織培養技術選擇上，通常以誘導母本腋芽發育方式為主，確保培養出的樹種能夠完全繼承母本優良形狀，在短時間內適應移植后的新環境。而在城鎮郊區或是一些交通便利的農村地區，林業發展多以速生林為主，例如楊樹、桉樹、槐樹等。這類林木的優點在于生長速度快、經濟價值高，因此對于樹種的需求量也相對較大。在選擇組織培養方式上，多以誘導愈傷組織培養新植株的方法，來提高單位時間內的樹種培養速度。誘導植株組織培養方式主要適用于果樹樹種繁育，一來是果樹生長周期相對較長，對于樹種需求量較為緩和，二來是果樹對于樹種的優良性質要求較高，誘導植株組織的培養方式能夠實現“基因優選”功能，確保果樹經濟價值的實現。
1.2 植物組織、細胞及器官功能分析
植物組織培養所選用的必須是具有完全遺傳信息的組織或器官，包括母本植株的莖、葉、胚芽等，雖然這些組織或器官中的遺傳信息都是相同的，但是其培養效果也會受培養環境、培養基營養成分等外界因素的影響。根據這一生物特性，可以對植物的組織和器官的形成過程、結構特性進行技術分析。例如，更加大量的植物組織培養實驗表明，以植物莖作為組織培養對象，培養過程中植株的細胞膜的通透性更強，對于外界病毒入侵的抵抗力更明顯，根據這一實驗結論，我們在進行植物組織培養時，可以有針對性的選取母本植物的組織或器官。例如松樹雖然具有較高的生態價值和經濟價值，但是幼苗期的松樹抗病蟲能力較低，很容易發生病害侵襲影響，影響松樹幼苗的成活率。通過改良植物組織培養技術，能夠極大的改善這一影響因素。
1.3 植物組織培養中的滅菌工作
在植物組織培養中，最重要的一點就是要防止組織或器官受到外界細菌、病毒、微生物的干擾。目前，植物組織培養大多數在無菌室內進行，但是這只是從硬件方面確保了工作環境的安全，除此之外，操作人員還應當保持良好的工作習慣，例如要保持操作臺干凈整潔，刀具、儀器使用前后都要做好消毒處理、佩戴標準消毒作業設備等。
植物組織培養實驗室內的滅菌方法主要分為物理法和化學法，其中物理法主要包括加熱、蒸煮、射線處理、無菌水清洗等，化學方法主要是利用一些特殊的化學制劑，例如雙氧水、高錳酸鉀、漂白粉、酒精等。不同的化學藥品所針對的細菌種類也不盡相同。但是無論采取何種滅菌措施，都不可能達到完全滅菌的效果。尤其是一些帶有芽孢組織的細菌和霉菌，生存力較強，即便是采取消毒措施后也既有可能存活下來，一旦遇到富含營養物質的培養基，這些細菌和霉菌就會大量繁殖。因此，植物組織培養實驗室內應當定期做好消毒措施，嚴格執行消毒標準，真正實現“無菌操作”。
2 植物組織培養技術在林木育種中的意義和展望
由于組織培養周期短，增殖率高及能全年生產等特點，加上培養材料和試管苗的小型化，這就可使有限的空間培養出大量的植物，在短期內培養出大量的幼苗。組織培養突出的優點是“快”，通過這一方法在較短時期內迅速擴大植物的數量，以一個莖尖或一小塊葉片為基數，經組織培養一年內可增殖到10000-100000株。
不可否認的是，現階段的植物組織培養仍然面臨一些技術和操作上的問題，其中主要集中在以下幾方面：首先，繁殖效率和繁殖質量之間的矛盾問題日益突出，在近幾年植樹造林活動的影響下，各地區的林業建設活動規模不斷擴大，無形之中增加了植物組織培養的工作壓力。部分管理人員盲目追求經濟利益，將一些未達到移植條件的植株銷售給林業部門，導致樹苗成活率低。因此，如何做好植物組織培養速率與市場需求之間的矛盾，成為當前組織培養單位所面臨的首要問題。其次，培養過程中不可避免會出現變異植株，也會造成一定的苗木資源浪費。
“綠色發展”理念被納入“十三五”發展規劃中，為林業的可持續發展指明了方向。未來一段時間內，隨著林業產業規模的不斷擴大，對于樹種、苗木的需求量也會逐漸攀升，植物組織培養能夠很好的滿足當前林木育種的各種需求，具有廣闊的發展潛力和應用推廣價值。
摘要：對園藝植物組織培養教學體系進行了研究，針對其在教學中存在的問題進行客觀分析，通過制訂科學合理的教學大綱、優化實驗教學內容、建立開放式實驗室及改革考核辦法，來強化教學效果，全面培養學生的綜合技能。
關鍵詞：園藝植物組織培養；教學改革；教學實踐
《園藝植物組織培養》是園藝專業的重要專業課程。園藝專業按照“厚基礎、寬口徑、強能力”的原則，修訂了適應學分制要求的專業人才培養方案。園藝植物組織培養這門課程對于培養園藝方面的專業應用型人才具有十分重要的作用。
一、園藝植物組織培養課程在園藝專業中的重要地位
近年來，農業效益化和都市化進程的不斷發展使農業科研院所和農業現代化園區的組培項目的數量迅猛增加，同時，新興的組培企業也越來越多。在這種情況下，有效結合植物組織培養課程和生產實際，縮短畢業生的實際工作能力和社會需求的差距同時提高學生的實踐和適應能力就顯得尤為重要。因此，通過改革和完善園藝植物培養課程的教學內容、手段和條件，合理構建園藝植物組織培養課程的特色，可以有效將企業實際工作環節融入到教學過程中，從而更好地實現培養園藝專業人才的目標。
二、園藝植物組織培養課程在教學中的存在的問題
1.教材編寫難以適應現代教學模式。在編排園藝植物組織培養教材的過程中，相關人員應該通過全面編排學科包含的所有知識點的方式來保證教材內容的完整性和學術性。而在實際教學過程中，如果教材內容太過詳細，教師容易產生依賴心理而完全按照教材內容進行生硬的傳授灌輸，從而減少教學過程中與學生互動的積極性，直接導致學生對教師的教學失去興趣和信心。這種教學方式與現代教學倡導的以學生為主體的探究式教學方式相矛盾。而這種教學方式所培養出的學生缺乏學習的主動性和創新性。
2.傳統教學方式難以實現對學生實踐能力的培養。實驗教學的傳統教學模式基本是以教師為主。通常情況下，教師在上課之前事先準備好所需的實驗材料并設置好具體的實驗流程。在實驗教學課程中學生需要根據教師設置好的實驗流程進行具體的實驗操作。一般來說，傳統的實驗方法無法真正發揮效力，因為植物組織培養以實驗技術水平為發展的根本，其側重于實驗者實踐能力，對操作水平有著極高的要求。植物組織培養在教學實踐中要高度重視實踐技能，在教學活動中要確保學生的主體地位，鼓勵學生自主探究，通過學生自我實踐提升植物組織培養技能，進而體現出園藝植物組織培養課程的宗旨。
3.傳統教學模式難以實現教育目標。傳統園藝植物組織培養的教學目標的定位相對較低，只是簡單地要求對知識和技術的一般性認識和了解，缺乏對知識和技術能力的深入性探討和研究的要求。然而，傳統的園藝植物培養的教學方法和教學模式相對來說比較落伍，填鴨式的灌輸教學模式也比較陳舊。在這樣的教學方法和模式下，學生只能了解到相對空洞的理論性知識，更無法達到現代教育的教學目標。因此，在實際的教學過程中，教師不但要尊重課程本身的發展規律及其特點，還要重視培養學生的實踐能力，樹立全新的教學觀念，積極采用多媒體等新技術手段，激發學生學習的主動性，構建良好的學習氛圍，鼓勵學生自主學習，培養學生的創新能力，從而有效深化學生對植物組織培養理論知識的認識。
三、提升園藝植物組織培養教學效果的對策
1.合理規劃理論教學內容。在信息無比豐富的知識爆炸時代，學生從來不滿足于單一知識的學習。當下學生不僅要學習理論知識，更要掌握有效學習的能力，還要學習將理論知識和社會實踐有效結合起來。植物組織培養課程不僅對學生提出了扎實掌握課程理論知識的要求，還提出了領會和掌握植物組織培養的實用技術的要求。另外，學生還應對植物組織培養方面世界前沿的高端技術有一定的認識和了解，同時，還要具備將理論知識應用到社會實踐生活中的能力。學生在學習過程中所掌握的技術和知識水平存在差異，因此，教師應該因材施教并根據學生的實際情況合理調整教學內容和教學順序，從而提高教學效率。
2.改革實驗教學內容、手段。（1）尊重學生實驗活動的主體性。在新的教育教學大綱指導下，實驗教學獲得了革新，在實驗中要充分尊重學生的主體性，提升學生獨立動手能力。實驗課程以小班制為基礎，每班人數控制在25人以內，在實驗過程中教師要盡量縮短講授時間，在對實驗目的、要求、方法、注意事項講解完畢大膽鼓勵學生自主實驗。學生根據教師對實驗的講解以及自身知識獨立實驗，在獨立探究中自主解決實驗中所出現的問題，若出現無法解決的問題應主動向教師提問，面對學生的提問，教師要給予針對性的指導。（2）實施開放實驗室制度。傳統實驗室由教師控制，在教師的控制下，學生在實驗室進行實驗活動，實驗活動的準備以及實驗所需材料均有教師主導，學生的實驗活動只是對教師實驗示范的機械重復，在這種傳統實驗教學模式下，學生難以準確采集實驗材料，不會科學構建實驗流程，對實驗的反饋也僅僅停留于理論知識，這對于學生自學學習能力的培養和探究學習能力的提升是極為不利的。為了實現現代化實驗教學模式，教師可以針對學生進行基礎實驗訓練，然后根據學生的實踐能力全面開放實驗室。學生在與教師的溝通后可以進行課外實驗，教師也可以根據學生的實驗能力鼓勵學生自主探索實驗。
3.現代教學手段和方法的靈活應用。（1）教學方法的靈活運用。園藝植物組織培養是現代生物學重要組成部分，以遺傳學、微生物學、植物生理學、植物學等學科為基礎，因而在進行教學中，教師可以提出其他學科教學專業的問題為引子，激發學生們的學習積極性，或者以生活中的真實事件為課程導入，讓學生對事件給予反饋，提升學生課堂參與度，在師生互動中有利于營造良好的課堂氛圍。（2）教學手段的靈活運用。植物組織培養是一門操作性很強的課程。因此，教師應該合理采用直觀性較好的教學方法。在實際教學過程中，教師可以將實物直觀展現在學生面前，使學生對課程內容有直觀形象的了解和認識。比如，教師可以帶領學生走進組織培養實驗室，在對實物的實地參觀過程對教學內容進行詳細介紹，從而幫助學生深刻記憶設備名稱和特征。再比如，講解植物離體培養成苗過程等內容相對較為復雜而且耗時較長。對于這種情況，教師可以采用多媒體技術手段輔助教學，將實驗整個過程制作成內容豐富的課件，然后，通過多媒體課件的展示，使學生形象地理解教學內容并加深實驗過程的理解。（3）深入植物組織培養工廠。園藝植物組織培養技術與社會生活緊密聯系。在我國，植物組織培養的工廠已經十分常見，很多工廠都通過植物組織培養在工廠內進行蔬菜、果樹和花卉等植物的機械化繁殖。植物的繁殖不再受到傳統方式的時間和空間的局限，從而實現了工廠式的周年連續生產。植物組織培養對植物生長控制因子實現了人工調節，在可控制的環境內實現植物快速繁殖，滿足社會的需求。同時，引入植物脫病技術，不但可以有效提升植物的質量，還可以提高植物健康繁殖的速度。總體來說，植物組織培養的發展前景十分樂觀。
4.考評方式多樣化?？荚u直接反映出學生對《園藝植物組織培養技術》課程的學習成效，如果教師只依據卷面成績來對學生進行學習效果評價，那么就會讓整個考評過程缺失客觀性和有效性。因此，教師在對學生進行課程考評的時候，就可以把多種考評方式結合在一起，并從多個方面去對學生的學習情況做出客觀的評價，從而讓課程的考評能夠實現客觀性和有效性。比如：教師可以把理論知識考評、實驗考評、技能實際應用能力考評這三者合理地結合在一起，并讓它們按照一定比例進行分數劃分，對學生的學習成果進行全方位的考評。
四、結語
隨著我國園藝植物組織培養技術地不斷提高和發展，大多數農林院校為了更好地進行園藝植物組織培養的教學都將《園藝植物組織培養》這門課程設置為學生的必修或選修課程。由于園藝植物形態變化相對較大而且種類偏多，園藝植物組織培養教學活動的開展應以園藝植物組織培養技術和理論為先決條件，并根據不同園藝植物的不同特點，從而使學生扎實掌握基礎理論知識，并將其與實踐操作有效結合。另外，教師在授課過程中要合理把控好授課重點，尤其是對植物組織培養專業特征的明確。
摘要 通過對植物組織培養課程教學方法、教學手段、教學內容及教學評價的實踐探索，總結改進，加強實踐教學環節，以培養學生的綜合技能和創新能力。
關鍵詞 植物組織培養；教學實踐；實驗教學
植物組織培養是一項近年來迅速發展的生物技術，已滲透到生物學科的各個領域，成為生物學的重要研究技術和手段[1]，并廣泛應用于農業、林業、工業和醫藥業，產生了巨大的經濟效益和社會效益，成為當代生物科學中一門較有生命力的學科。植物組織培養是生物技術應用專業和園林技術專業的職業技能模塊之一，學生通過該課程的學習，掌握植物組織培養的基礎理論、基本知識和基本操作技能，最后達到用植物組織培養技術進行植物脫毒快繁的全過程。目前，多數農林院校都已開設植物組織培養課程[2]。漢中職業技術學院農林系依托優秀的教學團隊和植物組織培養良好的市場前景，經過充分考察論證，在2010年成立植物組織培養實驗室，并于2010―2011學年在生物技術及應用、園林技術及應用2個專業2個年級3個班開設此課程，經過1年的課程教學，取得良好的教學效果和社會評價，現就教學過程進行探討。
植物組織培養技術是一門實踐性較強的課程，實驗課是該課程教學中的重要環節。為保證學生熟練掌握組織培養技術，學院把課程的重點放在培養學生的實際動手能力上。為了保證學生在掌握組織培養的理論基礎的同時，加強其實踐操作能力的培養，學院在教學中進行了一些改革嘗試。
1 改驗證性實驗為探索性實驗，培養學生的思維能力和認識能力
傳統的實驗多為驗證性實驗，即學生在實驗課上對課本中的實驗結論進行驗證，這雖然能使學生加深對理論的理解，但不利于其思維能力、認識能力的培養和提高，特別是對于學情復雜的高職學生。因此，根據該課程的特點，學生在教師指導下，進行探索性實驗，效果會更好。如所用培養基配方不同，植物生長效果也各異。教師在教學中并不是直接將這些實驗方法告訴學生，而是指導學生根據所學的理論知識進行探索性實驗，最后通過實驗和分析，得出最佳的方案或結果，使學生認識到接種外植體、材料大小、取材季節、滅菌方法等均對實驗結果有較大影響。這樣不僅加深了學生對理論知識的理解，培養了學生的思維能力和觀察能力，提高了實驗效果，還提高了學生的動手能力。
2 運用多種教學資源，改進教學方法，變單一教學方法為多種教學方法綜合運用
漢中職業技術學院在實驗實訓室安裝了投影教學設備，教師可在實驗室對學生進行該門課程的講授，課程教學結合現代多媒體教學手段，采用了講與練結合、精講與多練，包括先講后練、先練后講、講中有練及練中有講等多種教學方式，讓學生切身參與到教學活動中來。實驗室既是操作實踐室又是多媒體教室，真正做到教、學、做一體化。在教學環節的組織上，應加強討論式、啟發式、參與式的教學[3]，以推動現代教學方式的應用。充分利用多媒體、錄像、參觀等教學手段，使學生能夠在學中做，在做中學。植物組織培養是一門實踐性很強的課程[4]，但又離不開理論教學。理論部分主要采用多媒體課件講解，同時配合錄像、實物標本等多種教學形式進行。在實踐教學的環節中，邊實驗邊學習，以學生對植物組織培養基本技能的掌握為主，鍛煉學生的動手操作和理論聯系實際的能力。在講到組培室的構造及儀器設備的使用時，教師改變老式的講授方法，放手讓學生自主學習，對照設備看說明書，并和同學一起探討使用方法及注意事項，這樣既鍛煉了學生的學習能力，又打破了填鴨式的灌輸，收到很好的效果。學生做的組培苗分類放置，每次上課時都可以看到他們親手做的組培苗發生的變化，培養了學習興趣，提高了動手的積極性。在講到組培苗的褐化和玻璃化以及組培苗的污染時，可把學生做壞的組培苗單獨放置，一邊講解，一邊答疑解惑，和學生互動，形象直觀，加深了學生對知識的理解。學院還與漢中市植物研究所、漢中市農科所聯系，組織學生參觀組培中心，使學生對室外煉苗移栽和馬鈴薯微型種薯的培育等一整套組培技術有了系統的、直觀的認識，把枯燥的學習變成了快樂的實踐。
3 因材施教，突出重點
漢中職業技術學院生物技術和園林技術同時開課，教學團隊根據實際情況，重新編排教材，設計為6個學習情境，教學重點突出在生產上廣泛應用的組織培養技術，但根據專業的特點，內容有所側重。生物技術專業偏重于馬鈴薯脫毒組培苗和甘薯組培苗，而園林專業則偏重于花卉的組織培養教學，如菊花、蘭花的組培技術。教學過程從簡單到復雜，循序漸進，一步步掌握組培技術并上升到高層次的對整個專業認知。
4 人人參與，培養集體意識
由于學生水平層次不齊，學習態度不一。所以在組培課上，把學生按照男女性別、學習能力和動手能力的高低進行交叉搭配分組，相互配合共同完成項目任務，通過合作，每個人都有了鍛煉機會，都參與到課程情境中，增強了責任心，提高了團隊意識，提升了班級凝聚力。
5 實行學習與考證相結合制度
為了更好地適應社會發展的需要，該門課程采取學習與考證相結合的制度，設有培養基制作工、接種工等工種技能鑒定，考核合格后發放相應工種資格證，通過率達到97%，實現了技能訓練和生產實戰一體化，獲得了用人單位的一致歡迎和好評。
6 積極完善，不斷創新
雖然組培課教學在短短一年的時間里就有了如此大的進步，但由于條件有限，還有許多需要改進的方面：一是要進一步加大實驗實訓投入，增加實驗設備，建立專用溫室大棚，為組培課的教學實訓提供良好的配套條件。二是要進一步搭建產學合作平臺，和科研單位緊密合作，充分利用本行業的企業資源，開展社會服務，走向社會化，真正做到學以致用。
摘 要：文章在對苔蘚植物的特征及組織培養研究簡史進行簡要介紹的基礎上，重點介紹了國內外學者對苔蘚植物組織培養材料及基質的選擇、外植體的消毒方法、培養基成分的選擇及培養條件的篩選等4個方面的研究進展。
關鍵詞：苔蘚植物；組織培養；消毒方法；培養基
苔蘚植物是植物界中比較特殊的一個植物類群，主要生活在陰濕的環境中，是一類由水生向陸生過渡的重要的原始高等植物。苔蘚植物生活史為典型的異型世代交替，孢子體則寄生于配子體上生活，孢子在產生新的配子體過程中還需要經過一個原絲體階段。目前，全世界大約有2.3萬種苔蘚植物，其種類僅次于被子植物。
苔蘚植物能夠蓄積大量水分，因此對水土保持與涵養、森林及某些附生植物的發育都有極其重要的作用。此外，苔蘚植物還含有脂類、萜類、黃酮類、生物堿、醌類等活性物質，因此具有極高的藥用價值。
苔蘚植物的組織培養歷史可以追溯到1902年Haberlandt的研究和1905年Goebel等人的研究，此后的50余年時間內，科學家的關注點更多的集中于被子植物組織培養上，對苔蘚植物的組織培養幾無涉及。1957年，Allsopp利用石地錢和小葉苔的孢子進行組織培養，首次成功獲得相應愈傷組織及再生葉狀體。此后，世界范圍內的關于苔蘚植物組織培養的實驗研究逐漸展開并取得了一定的成果。
1 苔蘚植物組織培養供試材料及基質
目前，可以用于苔蘚植物組織培養的材料主要是苔蘚植物的配子體、孢子體和原絲體，此外還可以利用其生殖器官、芽孢、游離原生質體等。1960年，Ward以Knudson培養基培養金發蘚和波葉仙鶴蘚的孢子并獲得其無菌原絲體，并在添加了蔗糖的基本培養基中利用該無菌原絲體誘導獲得了相應的愈傷組織及再生植株。2003年，高永超等利用牛角蘚配子體莖段誘導獲得相應愈傷組織，并探討了蔗糖及大量元素對愈傷組織細胞生長的影響。2007年，于傳梅利用膨葉唇蘚苔和溪苔的葉狀體、柳葉蘚的莖段、短葉蘚和江岸立碗蘚的孢子進行組織培養，獲得了相應的愈傷組織或再生植株。
2 苔蘚植物組織培養供試材料的消毒
可用于苔蘚植物外植體消毒的試劑包括乙醇、次氯酸鈉、升汞等，不同的供試材料和不同部位的外植體所用消毒劑有所不同。 Saboljevic等研究表明，適用于Aloina aloides孢子和配子體消毒的次氯酸鈉濃度分別為120.00g?L-1和90.00g?L-1。于傳梅（2007）研究表明，適用于膨葉唇蘚苔和溪苔的葉狀體消毒的試劑為0.1%次氯酸鈉，消毒時間為5分鐘。梁書峰（2010）研究表明，適用于真蘚外植體消毒的方法是：先用70%乙醇處理5秒，然后用5%次氯酸鈉處理30秒鐘，其外植體存活率可以達到70%；而適用于東亞砂蘚外植體消毒的方法則是0.1%氯化汞消毒5秒或10秒，用次氯酸鈉消毒會導致東亞砂蘚外植體變紅而無法存活。
3 苔蘚植物組織培養供試材料培養基成分的選擇
目前，用于苔蘚植物組織培養的基本培養基如苔蘚植物組織培養常用的培養基有MS培養基、Knop培養基及Benecke培養基等。適用于不同苔蘚植物外植體培養和植株再生的基本培養基的種類不同，培養基中的成分也有所不同。RANI的研究表明，最適宜促使小珠蘚配子囊形成的GA3濃度為10-7mol?L-1。陳靜文（2006）對小立碗蘚組織培養研究結果表明，適于小立碗蘚組織培養的培養基為添加有0.5%葡萄糖和0.8%瓊脂的K2培養基。于傳梅（2007）研究表明，適用于短葉蘚包子萌發的培養基為分別添加了1%蔗糖和瓊脂（pH6.2）的Knop培養基或Benecke培養基。魏志穎（2015）研究表明，Beneck培養基最適于山墻蘚原絲體擴展及配子體生長，培養基中瓊脂含量與山墻蘚生長速度呈現負相關，蔗糖可明顯促進原絲體的形成和擴展生長，當蔗糖濃度為15g?L-1時，分化產生的芽體數目最多，培養基中的IAA、IBA、2，4-D可以顯著促進山墻蘚莖部伸長生長，但2，4-D同時會加速其衰老，6-BA則會促使莖尖端細胞膨大成球狀，KT則可以誘導產生愈傷組織。
4 苔蘚植物組織培養供試材料培養條件的選擇
影響苔蘚植物組織培養的培養條件有很多，如溫度、光照、pH、水分和濕度等，不同的苔蘚植物材料在組織培養中對上述條件要求有所不同。Vashishta（1987）在25℃條件下對3種苔蘚植物組織培養研究表明，光照強度為3500lx時，3種苔蘚植物原絲體均開始生長并發育良好，且產生芽數也最多。陳靜文（2006）對3種蘚類植物組織培養的研究表明，適于真蘚和小立碗蘚生長發育的培養條件是（25±1）℃，3500lx和光照周期為12h/12h；適于小蛇苔組織培養的條件是（18±1）℃，3000lx和光照周期為12h/12h。劉應迪等（2001）對3種蘚類植物組織培養研究表明，適于垂蘚和大羽蘚生長發育的濕度為70～80%，而適于濕地匍燈蘚生長發育的濕度則為80～90%。崔巍（2012）對毛尖紫萼蘚的組織培養研究結果表明，適于毛尖紫萼蘚原絲體生長及配子體再生的溫度為（23±1）℃，最適光照條件是3000lx和光照周期為12h/12h，適于其原絲體生長的Prat培養基pH為5.5，而適于其進行擴展生長的Benecke培養基pH則為6.0。
目前，國內外對苔蘚植物組織培養的研究還相對較少，且研究內容也多局限在孢子萌發或原絲體發育方面，對其繼代培養及擴大培養則研究較少，未來的苔蘚植物組織培養可以更加側重于這一方面，以此從苔蘚植物中獲取更多的對人類有益的次生代謝產物及抗逆基因，使其更好的為人類服務。
作者簡介：鄭艷冰（1976-），女，黑龍江省黑河市人，副教授，碩士研究生，主要從事植物遺傳學研究。
摘要：以西南鳳尾蕨（Pteris wallichiana）的成熟孢子為外植體，以MS、1/2MS為基本培養基，研究了植物生長調節素對西南鳳尾蕨離體組織培養的影響。結果表明，不同細胞分裂素和生長激素配比對西南鳳尾蕨的組織培養影響不同，最適誘導培養基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 2.0 mg/L；最適增殖培養基為MS+6-BA 1.0 mg/L +NAA 1.0 mg/L+AC 1.0 g/L，最高增殖倍數為7.05倍；最適生根壯苗培養基為1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L，生根率達到90%以上。
關鍵詞：西南鳳尾蕨（Pteris wallichiana）；植物生長調節素；組織培養
西南鳳尾蕨（Pteris wallichiana），為鳳尾蕨科鳳尾蕨屬大型陸生植物，生長于海拔800～2 000 m的林下溝谷或林緣，分布于中國西南及臺灣、廣東、廣西等地[1]。其味苦、澀、性涼，具有清熱止痢、定驚、止血的功能，主治痢疾、小兒驚風、外傷出血等癥[2]。西南鳳尾蕨葉形優美、葉色青翠碧綠，具有較高的園林觀賞價值和藥用價值。藥用蕨類植物含有生物堿、黃酮類、酚類等多種活性物質，對多種疾病具有明顯的治療作用[3]。
隨著觀賞植物的發展和對蕨類藥用植物的利用，人們對蕨類植物的需求量日益增大。由于繁育技術不過關，野外采挖對野生蕨類植物資源造成嚴重的破壞，人類活動的干擾加之植物本身的原因使蕨類資源受到威脅[4]。在傳統的繁殖方法上，蕨類主要是依靠孢子繁殖和分株繁殖，而孢子繁殖在自然環境中的成苗率很低，分株繁殖則需要時間長并且得到的有效苗數量少，不能在短期內滿足大量種苗的需求[5]。因此采用生物組織培養技術，可以有效在短時間內提高西南鳳尾蕨的繁殖速度和質量。為了更好地開發西南鳳尾蕨中藥資源和觀賞價值，本研究通過在培養基中添加不同的植物生長調節素，對西南鳳尾蕨優良植株組織培養技術進行探討和研究，為西南鳳尾蕨的組培快繁提供技術基礎。
1 材料與方法
1.1 試驗材料
供試西南鳳尾蕨樣品采自廣西壯族自治區藥用植物園科研基地內野生健壯無病蟲害的植株，選取其成熟孢子為外植體。
1.2 試驗方法
1.2.1 外植體的消毒 取西南鳳尾蕨帶有成熟孢子的葉片，先用流水清洗葉片表面塵土污垢，然后用洗潔精溶液擦拭，并置于燒杯中進行流水沖洗15～20 min，再移至超凈工作臺上，用75%乙醇滅菌15～20 s，無菌水沖洗1 遍，用0.1% HgCl2浸泡8～14 min進行消毒，無菌水浸泡清洗3～4 次，每次約5 min，清洗時用玻棒不斷攪拌，利于徹底洗出汞。然后將材料移置于滅菌的器皿內，用無菌濾紙吸干葉片表面水分后，用消毒好的解剖刀將孢子接種到培養基中。
1.2.2 培養基的選擇 孢子誘導、繼代增殖培養基以MS為基本培養基、添加蔗糖30 g/L、瓊脂4 g/L，同時設不同的激素配比，孢子誘導培養基的激素配比分別設置為：6-BA 0.5 mg/L+NAA（0.1、0.5、1.0）mg/L；6-BA 1.0 mg/L+NAA（0.5、1.0、1.5）mg/L；繼代增殖培養基設不同激素配比的配方為：6-BA（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5）mg/L+NAA 0.1 mg/L+AC 1.0 g/L；6-BA 1.0 mg/L+NAA（0.1、0.5、1.0、1.5、2.0） mg/L+AC 1.0 g/L；生根培養基以MS、1/2MS為基本培養基，并在每升加入蔗糖30 g、瓊脂4 g，設不同激素配比4種，分別為：MS+NAA 0.5 mg/L、MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L、1/2MS+NAA 0.3 mg/L、1/2MS+6-BA 0.5 mg/L +NAA 0.5 mg/L。以上培養基的pH均為5.8。
1.2.3 培養條件 設置其培養條件為溫度（25±3） ℃，光照度20～30 μmol/（m2?s），光照時間12 h/d，進行孢子離體誘導、繼代增殖與生根培養。
2 結果與分析
2.1 消毒條件的篩選
以0.1% HgCl2為消毒劑，設計1組消毒時間試驗，分別設置5、8、11、14和17 min 5個時間梯度，將外植體接種于培養基20 d后統計污染率和成活率。結果（表1）表明，樣品經0.1% HgCl2溶液消毒時間11 min時，消毒的效果最好，成功率達到80%。處理時間大于11 min時污染率降低，但死亡率明顯的上升，當消毒時間為17 min時死亡率高達70%。而處理時間小于11 min時死亡率下降，但污染率較高，不利于外植體的誘導萌芽。
2.2 孢子離體誘導試驗
以MS為基本培養基，采用不同的激素配比對孢子進行離體誘導，試驗結果見表2。結果表明，當6-BA濃度不變時，添加不同濃度NAA對西南鳳尾蕨的孢子誘導產生影響，當NAA濃度在0.1～2.0 mg/L時，隨著濃度的升高，有利于孢子的誘導，形成的芽苗質地緊密，數量較多。6-BA 1.0 mg/L+NAA 2.0 mg/L組合時孢子的誘導率最高，試驗重復多次均得到相同的結果。
2.3 不同外源激素對西南鳳尾蕨苗繼代增殖的影響
將西南鳳尾蕨的無菌芽接入含有不同激素配比的繼代增殖培養基上，每天觀察接入芽的微小變化，10 d后逐漸萌發出新芽，繼而芽數慢慢增多，30 d后進行統計和觀察芽苗增殖的情況。結果（表3）表明，在6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+AC 1.0 g/L的繼代培養基上，對西南鳳尾蕨的葉叢增殖有明顯的促進作用，在NAA 0.1～1.0 mg/L濃度范圍內，隨著NAA的濃度增大，增殖系數不斷增大，但當NAA增加到1.5 mg/L時增殖系數反而有所下降。在B8號（6-BA 1.0 mg/L +NAA 1.0 mg/L+AC 1.0 g/L）培養基中，苗的葉片濃綠，生長情況良好，該培養基中增殖倍數最大，且植株健壯，芽苗的質量較好。
2.4 不同外源激素對西南鳳尾蕨苗生根的影響
將誘導出的繼代苗單切接入不同激素組合的西南鳳尾蕨生根培養基中，培養30 d后進行觀察并統計生根率。結果（表4）表明，西南鳳尾蕨試管苗在添加不同濃度生長激素的MS、1/2MS培養基上均能生根，苗的顏色濃綠，有少數的苗根部出現微黃，觀察發現4種生根培養基誘導生根的情況，根粗大小依次為C4、C3、C2、C1，在生根培養基C4中生根效果最好，植株粗壯呈墨綠色，平均根數16.3，平均根長3.07 cm，平均的苗高8.1 cm，生根率均達到90%以上。而以1/2MS為基本培養基的生根培養基無論在生根率、根粗和苗高都優于MS為基本培養基的生根培養基。
2.5 再生苗的移栽
將西南鳳尾蕨的試管苗經過壯苗生根培養后，挑選生長旺盛、健康根系發達的試管苗移入溫室內放置，松開蓋子并保持瓶內水分充足。3 d后取出試管苗洗凈根部培養基，移栽于栽培的基質中，每天噴灑少量的水，基質以排水良好，不易發霉為宜。同時適度的遮陰，保持一定的濕度。移栽15 d左右，葉片開始慢慢的舒展，2個月后成活率達到90%。
3 小結與討論
在培養基中添加不同生長調節素如細胞分裂素和生長素，細胞分裂素常與生長素相配合，用以調節細胞分裂、細胞伸長、細胞分化和器官形成，是植物快速生長所必需的因素，是誘導植物產出芽、生根的關鍵因素[6，7]。不同植物或同一植物在不同的培養階段組織培養體系所需要的生長調節素濃度和種類的組合配比是不相同的[8]。
本研究采用孢子進行離體誘導試驗，發現孢子在6-BA 1.0 mg/L+NAA 2.0 mg/L配比的誘導培養基中，獲得了較為理想的協調作用效果，出現綠芽點進而形成葉叢團。研究表明，多種植物生長調節素之間的協同作用要比單獨一種激素的使用效果更好[9]。本研究結果也表明，在西南鳳尾蕨的芽苗增殖和生根的培養中，6-BA、NAA的配合使用更利于西南鳳尾蕨的生長。此外，還受到光照度、活性炭、溫度的影響。適當的調整光照度，不僅有利于植物的生根，還能對株高和增殖率產生促進作用?；钚蕴磕芮宄囵B基中植物組織在代謝過程中產生的對培養物有不良或毒副作用的物質，提高培養物體內可溶性蛋白和總糖的含量，以利于植物的生長[10]。在試驗中發現，西南鳳尾蕨在培養一段時間后，底部會出現褐化的情況。相對而言，在培養基中添加適量的活性炭能減少西南鳳尾蕨試管苗的褐化現象。
摘 要：全國職業院校技能大賽推動了職業院校專業的教學改革，《植物組織培養》課程以植物組織培養比賽項目為依托，根據技能大賽競賽試題，參照相關的職業資格標準、行業標準和技術領域的職業崗位（群）的任職要求，對課程內容、課程的組織與實施、教學方法與考核評價等方面進行了探索與實踐。
關鍵詞：植物組織培養；職業技能大賽；課程改革
全國職業院校技能大賽“植物組織培養”賽項通過競賽實際操作，檢驗參賽選手在真實的工作環境與條件下進行植物組織培養技術的操作能力和選手的職業素質，操作技術主要考核母液配制、培養基制作、無菌轉接3個基本能力。通過競賽檢驗高職學生進行優良品種和無病毒苗木的快速繁育和培育的能力，培養他們的團隊合作能力，從而提升學生的職業能力；在推進學校與企業合作的同時實現工學結合的人才培養模式，推進園林園藝類專業建設與教學改革，培養行業高素質技能型人才。自2011年以來，“植物組織培養”賽項共組織了3次全國大賽，即2011年、2012年和2014年。我院共組織參加省賽3次，分別在2011年獲得省賽三等獎，2012年獲得省賽三等獎，2014獲得省賽二等獎，并取得國賽二等獎。作為植物組織培養賽項的指導老師，筆者在6a來全程指導訓練與教學工作，不斷進行新的教學探索和嘗試。
《植物組織培養》課程教學改革以技能大賽為鍥機，結合學院2012年的第3輪教學改革，進行項目化教學改革，項目組成員2013年參與編寫“A”聯盟項目化教材。課程教學改革旨在以賽促改，以賽促教，以賽促練，以賽促學[1]。課程考核改變傳統的以理論試卷為主的模考核式，加重技能考核比重，結合平時考核、筆試、實際操作等多種考核形式，合理評定學生的成績。
1 技能大賽背景下課程教學內容的選取
全國職業院校技能大賽是引領職業院校教學改革和技術創新的重要手段[1]。植物組織培養競賽項目是體現新知識、新技術、新技能的競賽，競賽試題以國家職業標準規定的知識和技能要求為基礎，結合高職技能型人才培養要求和農業生產崗位需要。
植物組織培養項目比賽內容主要包括MS母液化合物配制、MS培養基配制（不需滅菌）及馬鈴薯組培苗繼代培養的無菌操作。技能比賽主要是要求學生熟練使用組織培養相關儀器設備，能進行種苗的工廠化生產和管理[2]。本課程根據技能大賽中出現的試題、設備和技能考核內容，開發符合高職學生職業能力培養、體現專業技能應用的實訓項目[3]。按照課程內容與職業標準對接、教學過程與生產過程對接、學歷證書與職業資格證書對接的要求，圍繞工作崗位所需知識和能力進行課程教學，以培養職業能力為本位，結合三級花卉園藝師職業資格標準和全國職業院校技能大賽競賽項目，重新組織和設計教學內容（見圖1）。例如，大賽的一個技能考核內容為馬鈴薯脫毒苗繼代繁殖的無菌操作，本課程根據該考核內容，重新對課程內容進行規劃，調整并增加了馬鈴薯試管苗的脫毒實訓項目。
圖1 課程模塊與學習項目設計
《植物組織培養》課程采用基于工作過程的課程設計思路，按照植物組織培養崗位對從業人員知識、能力和素質要求，以植物組織培養的工作過程和工藝流程安排教學，組建教學項目，在教學模塊中穿插進各崗位技能，使培養的學生能夠獨立從事植物組織培養各個崗位的工作[4]（見圖2）。
圖2 企業工作流程與典型任務分析
2 教學模式與方法
根據課程教學目標和內容的設置，建立理論與實踐相結合的課程體系[5]。理論教學與實踐教學相結合即實踐課與理論課一體化，邊理論、邊實踐，理論夠用，實踐求精，實踐教學課時占到總課時數的50%以上，并形成相對獨立的實踐教學體系，在實踐教學中挑選出幾項基本技能，反復操作，不斷強化。
實施實踐教學過程中，以小組為單位，每小組有2名學生組成（參照技能大賽要求）。教學過程為：（1）各小組領取工作任務單；（2）小組成員自己明確每個成員的任務；（3）查閱資料及教師示范完成上述工作任務單實驗，并寫出相應的操作步驟（課余完成）；（4）方案實施：依照具體的方案實施；（5）評估：在實施過程中，存在哪些問題并及時解決這些問題；（6）檢測：學生對所做實驗結果進行成果展示，教師加以考核。
實踐教學分小組訓練（2人一組），增加操作的反復次數，單人考核；定期開展技能比賽，結合每年11月份的學院技能大賽（原科技創新節）進行課程操作考核，同時備選第2年的省技能大賽選手。植物組織培養操作考核內容與技能大賽接軌，也主要包括MS化合物母液配制、MS培養基配制及組培苗繼代培養的無菌操作。
3 “理實一體化”項目化教學教材建設
項目組成員參與編寫高職高專規劃教材《植物組織培養》（汪本琴主編），并選作教材。該教材將理論和實訓結合起來，以任務驅動引出理論知識，以單元實訓目標進行實訓安排；教材的側重點在操作技能，理論以夠用為度，根據實訓需要解決的問題，引出理論知識；要求理論知識淺顯易懂，簡潔明了，可操作性強。
4 教師隊伍建設
高職技能大賽植物組織培養項目考察更多的是學生的技能水平，這不僅為老師提供了非常好的自我檢驗的機會，也對教師提出了更高的要求，從根本上扭轉了教師過去那種重理論、輕技能的教學思想。技能大賽使指導老師認識到學生技能培養的重要性，樹立起技能教育的理念[6]。技能大賽要求指導教師在具有良好專業知識素養的同時，具有較高水平的操作能力、較強的項目設計與指導能力以及良好的教學組織能力，能引導學生自己發現知識、提高技能。我院教師隊伍培養通過參與科技服務項目、考評員培訓、參與校內外實訓基地建設等等，提高教師的專業實踐技能。在植物組織培養課程的教學過程中，由課程負責人組織建立了一個教學團隊，豐富實踐經驗的企業專業技術人員、實驗室管理人員和企業能工巧匠參與實踐教學，共同制定教學大綱、教學計劃等，并集中對學生的基本技能和提升技能進行專項講解和訓練，在提高學生的專業技能的同時建立一支結構合理、素質優良、技術過硬的專兼職結合的教師隊伍。
5 教學質量評價體系
課程考核采取以過程性評價為主的多樣化評價措施。評價考察學生在知識、技能、素質方面是否達到目標，全方位、多角度的反映一個學生的真實成績和綜合能力[3]。過程考核是教師結合每個學生在完成各個典型工作任務時的具體表現，考核的指標涉及學生的出勤，資料準備情況、任務分工合理情況、項目實施過程的完成效果及速度、報告總結及成果展示等方面。以技能考核為主，分多次進行，貫穿于整個教學過程中。最后綜合理論考試、平時考核和技能考核等幾項成績給學生一個綜合的評價。本課程考核具體做法為：過程性評價（60%）+終結性評價（40%）。其中過程性評價中崗位技能（即隨堂現場考核）60%，學習過程40%（其中考勤20%，實驗報告和總結20%）。終結性評價即期末測試，其中技能操作考核50%，理論筆試50%。這樣的考核方式不但調動了學生參與學習的積極性和主動性，而且充分體現了職業教育學生為主體的特點，有利于全面培養學生的職業能力。
6 結語
植物組織培養技術廣泛應用于優良品種快繁、脫毒種苗生產、種質資源保存等方面[2]?！爸参锝M織培養”賽項推動了高職院校園藝技術、園林技術等專業的教育教學改革。我院植物組織培養課程團隊通過組織參加技能大賽，不斷提高自身能力，改革課程教學，更新教學內容，教學過程主要在組培實驗室中進行，實踐教學時分組訓練，單人考核，并在課堂開展技能考核。技能大賽使課程教學團隊進一步明確了教學標準，并把實踐教學訓練體系做實、做細；技能大賽使學生對職業操作規范、產品質量標準和操作水平有了明確的認識，加快了學生職業技能的發展、專業技能的提高和加強了團隊合作的意識。隨著植物組織培養技術的快速發展和我國教育教學改革的深人實施，只有不斷探索和采用具有創新性的教學理念、方法和手段，才能充分調動學生學習的積極性，提高學生的職業能力。
摘 要：本試驗以報春花葉片、莖段作為外植體，進行了初代組織培養，并進行增殖、生根培養。結果表明：75%的酒精（0.5 min）+0.1%升汞（8 min）具有很好的消毒作用;MS +6-BA 1.0 mg?L-1+NAA 0.2 mg?L-1是不定芽分化的最佳培養基配比;MS+6-BA 1.0 mg?L-1 +NAA 0.2 mg?L-1是不定芽增殖的最佳培養基配比;1/2MS+NAA 0.2 mg?L-1是生根的最佳培養基配比。
關鍵詞：報春花;外植體;培養基
報春花 （Primula malacoides Franch.）又名小種櫻草、七重樓，報春花科報春花屬，葉片長卵形或圓形，葉緣有齒，葉柄長5 cm左右?；ㄝ愀?0～30 cm，花冠高腳碟狀。多生長于荒野、田邊，原產于中國的云南、貴州，各地栽培，頗具觀賞性。
報春花原產中國，草本植物。喜氣候溫涼、濕潤的環境和排水良好、富含腐殖質的土壤，不耐高溫和強烈的直射陽光，多數亦不耐嚴寒。葉基生，全株被白色絨毛。花通常2型，排成傘形花序或頭狀花序。花期為12月至次年4月，早春開花為本屬植物的重要特性，其中文名報春和學名均含有早花的意思。近年來發展很快，已成為當前一類重要的園林花卉。
組織培養又叫離體培養，通常指從植物體中分離出符合需求的組織（器官、細胞、原生質體等），在人工無菌操作條件下，進行培養從而獲得再生的完整植株，或者生產出具有經濟價值的其他產品的技術。本試驗以報春花葉片、莖段為外植體，進行了初代組織培養，并進行增殖、生根培養，在建立報春花組織培養無菌體系的基礎上，對比了外植體不同滅菌方法對滅菌效果的影響，以及不同激素濃度對報春花葉片、莖段芽分化、不定芽增殖及其生根的影響。
1 材料和方法
1.1 試驗材料
使用材料取自盆栽報春花的葉片和莖段。
1.2 試驗材料的處理
組織培養前，先從室內培養的盆栽植株上取生長旺盛的報春花葉片和嫩莖作外植體，取材后放入燒杯里，用大量的水洗去表面附著物后，再放到自來水管下進行二次沖洗（時間約60 min），然后放入到瓶中，在超凈工作臺上再迅速用無菌蒸餾水沖洗3遍后等分為2份。每種消毒劑處理15瓶，每瓶接種4塊，處理方法見表1。最后，用無菌蒸餾水沖洗6次。將葉片橫切和縱切后切成1 cm×1 cm大小，將嫩莖切成1 cm左右的莖段作外植體用。
1.3 培養基配比
基本培養基為MS，瓊脂為6 g，蔗糖濃度為3%，pH 值為5.8。初代培養基為：（1）MS+6-BA 0.5 mg?L-1+NAA 0.1 mg?L-1;（2）MS+6-BA 0.5 mg?L-1+NAA 0.2 mg?L-1;（3）MS+6-BA 1.0 mg?L-1+NAA 0.1 mg?L-1;（4）MS+6-BA 1.0 mg?L-1+NAA 0.2 mg?L-1;（5）MS+6-BA 2.0 mg?L-1+NAA 0.1 mg?L-1;（6）MS+6-BA 2.0 mg?L-1+NAA 0.2 mg?L-1。增殖培養基為：（7）MS+6-BA 1.0 mg?L-1+NAA 0.1 mg?L-1;（8）MS+6-BA 1.0 mg?L-1+NAA 0.2 mg?L-1。生根培養基為：（9）1/2MS+NAA 0.1 mg?L-1;（10）1/2MS+NAA 0.2 mg?L-1。培養室內溫度為（25±2） ℃，光照強度1 500～2 000 lx，每天光照12 h，補光燈在光照不夠的條件下及時補光。
2 結果與分析
2.1 不同消毒劑處理的消毒效果
進行初代培養10 d后對120瓶培養情況進行統計，結果見表2。處理Ⅰ、處理Ⅱ的消毒效果差異明顯，處理Ⅱ的消毒效果是處理Ⅰ的17倍，因此單獨使用酒精對報春花外植體進行消毒處理，污染率高，效果不太好;而用70%酒精（0.6 min）+0.1%HgCl2（10 min）對報春花外植體消毒效果明顯。
2.2 不同外植體誘導愈傷組織的時間
經過初代培養10 d后，對每種培養基中莖段和葉片愈傷組織形成情況進行統計，從表3可看出，由于培養基配比不同，如果培養基配比合適，報春花葉片在第11天就可以形成愈傷組織，而莖段需要在第15天左右才能形成，其誘導時間比用葉片作為外植體的時間要長約4 d左右。
2.3 激素對初代培養的影響
將經過消毒組合Ⅱ處理好的外植體接種到初代培養基1～6，培養11 d后，大部分葉片的切塊邊緣首先開始膨大，長出淡綠色的愈傷組織，并呈疏松的顆粒狀，有部分葉片在切口處直接產生不定芽;接種20 d后愈傷組織表面出現綠色芽點，開始分化出0.2～0.5 cm的不定芽，35 d后頂芽萌動并長出側芽和分枝。
表4是第36天出芽的外植體統計數，激素的影響由表4中可以看出。在培養過程中還發現，當6-BA 2.0 mg?L-1、NAA0.1 mg?L-1時，在后期出現部分芽苗玻璃化、失綠現象;當NAA 0.2 mg?L-1、6-BA 2.0 mg?L-1時，分化出的不定芽形態明顯弱小;當6-BA 1.0 mg?L-1、NAA 0.2 mg?L-1時，誘導率較高，而且芽苗生長健壯，芽苗利用率也好。因此，初代培養的最適培養基配比為MS+6-BA 1.0 mg?L-1+NAA 0.2 mg?L-1。
2.4 激素對增殖培養的影響
將初代培養得到的芽叢和分枝切割成帶1～2個節的小段，轉接到培養基7～8上，約15 d后，就可以不斷長出大量的芽和分枝，培養基7和8中的芽都有增殖，但是培養基配比8的效果好，分化叢生芽芽體健壯，數量多，長勢良好，適合葉、莖段的繼代培養。當NAA為0.1 mg?L-1時，有部分芽生長良好，但部分芽體長勢較略差，長不高，影響叢生芽的大量繼代增殖（表5）。
2.5 激素對生根培養的影響
切取分化增殖所得到的高約2～3 cm生長健壯的叢生芽苗，將分枝切成帶有2個節的莖段，轉接種到添加不同濃度NAA的生根培養基9～10中。在生根培養進行到第30天的時候，對叢生芽的生根情況進行了統計，結果見表6。
當在1/2MS基本培養基中添加NAA濃度為0.1 mg?L-1（培養基9）時，生根率為85.0%，平均生根數達到12.6條，根長為1. 0 cm左右。當添加NAA濃度為0.2 mg?L-1（培養基10）后，誘導的叢生芽生根率升高，達到97.5%，平均生根數有13.8條左右，并且根粗壯，苗長勢良好，根長為1.4 cm左右。
3 結論與討論
由于報春花葉片肉質光滑，易于表面滅菌消毒，無菌操作簡單，切割過程也容易操作，瓶苗移栽后管理較粗放，組培繁殖極易見效率，經濟效益亦是可觀的。
因為植物體表面常附有各種各樣的微生物，無菌操作過程中，對于植物材料表面的消毒尤為重要，因為一旦帶進培養基，微生物就會迅速滋生造成植物材料死亡。75%酒精（0.5 min）+0.1%HgCl2（8 min）的消毒處理有更強的殺菌能力和穿透力，而且有濕潤作用，對報春花葉片和莖段的消毒處理效果明顯。
植物激素的種類和配比，是使植物組織分化出苗和快速增殖的重要因素，通過此次不同梯度培養基配比，發現雖然都能使植物分化出苗和增殖，但是低濃度和高濃度的激素配比使植物分化出苗較慢，同時細胞分裂素和生長素比例過高，導致玻璃化苗的產生，其中MS+6-BA 1.0 mg?L-1+NAA 0.2 mg?L-1激素配比最佳，利于報春花愈傷組織的生長和分化，進行初代培養;MS+6-BA 1.0 mg?L-1+NAA 0.2 mg?L-1是最有利于增殖的培養基;最適生根培養基為1/2MS+NAA 0.2 mg?L-1。
【摘 要】植物組織培養是一門實踐技能要求極高的專業課程，將開放性實驗應用于植物組織培養教學改革中，是為了更好地進行課程建設，培養學生的創新能力，提升學生的綜合素質。
【關鍵詞】開放性實驗 教學改革 植物組織培養
植物組織培養是一門以基礎理論知識作為指導，以準確直觀的實踐操作為衡量標準的理實一體化課程。對于教學而言，相較于基礎理論知識，實踐教學顯得更為重要。隨著傳統實踐教學模式固有弊端的凸顯，因材施教、分層教學的開放性實驗教學模式逐漸成為教學改革的發展方向。
一 植物組織培養教學改革
1.植物組織培養課程的特點
第一，實驗課程比重大。植物組織培養是指采用無菌操作方法，培養植物的離體細胞組織、器官，使其再生成為完整植株的技術。植物組織培養是以操作技術為優秀，實驗技能要求很高的課程。因此，實踐教學模式很大程度上決定了這門課程開設效果的成敗。第二，前沿科技對課程沖擊很大。植物組織培養技術起源于20世紀初，在快繁種苗等多個方面取得了巨大的成績。隨著前沿科技的不斷更新，植物組織培養技術的發展也是日新月異，教學本身也存在著知識更新問題。
2.植物組織培養課程中存在的問題
植物組織培養是在科學實驗和生產實踐中發展起來的新型學科，是實驗技術性較強的學科之一，教材雖然歷經數次修訂，但目前仍存在不少問題。第一，理論教學比例過重，實踐技能熟練度不高。相較于理論教學的扎實，實踐技能培訓成為教學的薄弱環節。由于師資力量的不足、課時安排的限制等問題，學生的實際操作能力遠遠低于企業要求。第二，學校教育與社會生產的脫節。企業為了保證生產效益，所采用的是最先進的設備儀器及最頂尖的生產工藝。相較之下，學校從實驗設備到理論知識都是無法和企業相提并論的，這也造成了這門課程教學的另一難題。
二 開放性實驗的開展
開放性教學是一種從時間、地點、內容、方法和手段上對學生全方位開放的教學模式。開放性實驗是以“學生為優秀、教師為輔”，強調在基礎性實驗的前提下，合理設計教學方法，以調動學生主動參與實驗為目的。
1.開放性實驗與傳統實驗的異同
第一，開放性實驗與傳統實驗的聯系。開放性實驗是以傳統實驗為基礎的。在傳統實驗中存在部分驗證性的基礎實驗，其目的是要學生熟悉操作規范、掌握實驗的基本技能以及提高實驗效率。只有充分掌握了實驗的基本技能，才能通過閱讀大量資料、結合操作技能、合理設計實驗并嚴格且完善地開展實驗。開放性實驗是基礎實驗的總結、提高和升華。第二，開放性實驗與傳統實驗的區別。（1）目的不同：傳統實驗主要以驗證為目的，開放性實驗不是看重結果，而是追求在整個實驗中學生所表現出的能力。（2）主體不同：傳統實驗是以教師為主導，學生只需按照實驗指導書做實驗。而在開放性實驗中，學生才是主體和主導，教師從旁協助，適當地提出修改意見，并不參與實驗步驟的制定、儀器的選擇等具體環節。
2.開放性實驗的實現
第一，開放性實驗室的建立。隨著開放性實驗的發展，實驗室的地位日益提高，廣大師生迫切要求實驗室運行方式的突破。建設開放性實驗室不能局限于時間和空間上的開放，更為重要的是教學體制、內容、方法、觀念上的開放。開放性實驗室的建立不僅有利于實踐教學改革，也能充分利用實驗設備儀器，同時有助于學生綜合素質的提升和教師專業領域及教學水平的提高。第二，考核方式改革。開放性實驗教學要求教師具備更高的知識素養、操作能力、協調能力以及靈活應變的能力，教學設計成為重中之重。學生在設計實驗、完成實驗以及實驗后的分析總結，都可以體現學生的學習能力和對知識點的把握。因此，考核模式不僅應看實驗結果，也應該結合整個實驗過程本身。強化對學生實驗過程的考核，既是充分調動學生實驗的積極性，也使考核更加完善和科學。
三 開放性實驗在植物組織培養教學改革中的探索
1.確定典型工作任務，優化教學內容
為了達到培養學生綜合素質的目的，我們采取了一系列的措施，包括：修改人才培養方案，加大實踐教學比重；聘請企業能工巧匠，促進校企結合；優化實驗設計，培養學習興趣；開放實驗室，促進學生主動參與實驗等。
2.建立開放性實驗室
結合本校的基本情況，將開放實驗條件較好的基礎實驗室作為開放性實驗室以及加速植物組織培養實驗室的建設。具體措施有：購置先進的儀器設備，建立和完善開放性實驗室管理的規章制度，組建無菌室等。
3.以賽促改
2014年4月，我系參加了陜西省高等職業院校技能大賽，在植物組織培養比賽中獲得第三名的成績。一方面，比賽促進了我們對開放性教學的重視，成績也是對我們實踐教學改革工作的認可和鼓勵。另一方面，學生也更加重視實踐操作能力，為日后就業練好扎實的基本功。
綜上所述，開放性實驗在植物組織培養教學改革中發揮了效果，隨著植物組織培養課程改革的逐步完善，開放性實驗將會在更多的實踐教學中發揮作用。
摘要：以金果欖（Tinospora capillipes Gagnep.）幼嫩莖段為外植體，添加不同濃度的6-芐基腺嘌呤 （6-BA）、吲哚-3-丁酸 （IBA）、萘乙酸（NAA）、激動素（KT）、赤霉素（GA），研究不同培養基對金果欖試管苗誘導、增殖和生根的影響。結果表明，金果欖啟動培養的最佳培養基為MS+1.0 mg/L 6-BA +0.5 mg/L KT +0.1 mg/ L 2，4-D，腋芽誘導率達95.1%；增殖的最佳培養基為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L GA+0.2 mg/L NAA，增殖系數達到16.1；生根的最佳培養基為1/2MS+0.2 mg/L IBA +0.4 mg/L NAA，30 d時生根率為85.4%，10 d后煉苗移栽到塘泥和河沙（3∶1，體積比）的混合基質中，30 d后移栽成活率可達87.3%以上。
關鍵詞：金果欖（Tinospora capillipes Gagnep.）；莖段；組織培養；誘導；生根
金果欖（Tinospora capillipes Gagnep.）為防己科青牛膽屬常綠纏繞藤本植物，主產于四川、湖南、廣西、湖北、貴州等地，具有清熱解毒、利咽止痛的功效，主治咽喉腫痛、癰疽疔毒、泄瀉、痢疾、脘腹熱痛等[1-3]。金果欖塊根含掌葉防己堿（Palnmtine）和咖倫賓（Colmtfifin）、巴馬汀、藥根堿、非洲防己堿、千金藤堿、蝙蝠葛堿和木蘭花堿[4-6]等成分，民間廣泛用于治療胃痛?，F代藥理學研究表明，金果欖有明顯的抗炎鎮痛、抗菌、抗腫瘤、降血糖、抗應激及解毒等作用，又被喻為可替代抗生素的天然藥物[5]。由于長期采挖，金果欖野生資源日趨枯竭，人工種植和撫育勢在必行。另外，金果欖雌雄異株，授粉受到環境影響極大，自然結實率低。在資源調查和引種中發現，雄株遠多于雌株（約50∶1），結果機會大大減少，且種子有明顯的休眠期，發芽率較低[7]。因此，種源缺乏是金果欖資源銳減的主要原因。目前，金果欖扦插繁殖未獲得成功，而組織培養快速繁殖是現代生物技術，且在香蕉、羅漢果、石斛等作物上已取得成功[8-10]，并應用于生產，但金果欖組培繁殖研究鮮見報道。利用MS培養基為基礎培養基，添加不同濃度和不同種類的激素，在多種植物組織培養中已獲得成功。本試驗以金果欖的幼嫩莖段為外植體進行消毒，用不同類型植物生長調節物質對叢生芽進行誘導、增殖、生根培養，分析各種植物生長調節物質對金果欖組織培養的影響，從而為金果欖人工繁殖和大規模推廣栽培提供有利依據。
1 材料與方法
1.1 材料
本試驗以廣西藥用植物園科研圃栽植的金果欖多年生幼嫩枝條為外植體材料。
1.2 方法
1.2.1 材料處理 將生長旺盛、無病蟲害的金果欖多年生幼嫩枝條剪下，剪成1.5～2.0 cm長且帶芽的莖段，放入0.1%的洗滌劑中浸泡8～10 min，然后于自來水下沖洗20 min，取出放入經高壓滅菌的無菌水中潤洗2次。經以上處理后，再將外植體放入75%的乙醇中消毒30 s，然后放入0.1%的HgCl2溶液中消毒7 min， 無菌水沖洗5次。用無菌濾紙吸干材料上的水分， 選擇不變色、無褐化的莖段橫切成面積為0.8 cm ×1.2 cm 的帶芽小塊，供接種用。
1.2.2 培養方法
1）啟動培養。將經過消毒處理的莖段分別接種在添加了不同組合、不同濃度生長激素的MS培養基上進行啟動培養，生長素的類型及濃度為6-BA（0.5、1.0、1.5 mg/L）、KT（0.5、1.0、1.5 mg/L）、2，4-D（0、0.1、1.5 mg/L），每瓶接種1個莖段，每個處理接種20瓶，3次重復，培養30 d后觀察記錄誘導效果。
2）增殖培養。將在啟動培養基上成功誘導出來的芽進行增殖培養，培養30 d后統計增殖系數。
3）生根培養。將獲得的有效不定芽（株高1.5～2.0 cm）接種于1/2MS培養基上進行壯苗培養，培養20 d后轉入生根培養基中誘導生根，每個處理接種5株，3次重復，培養30 d后統計生根情況。
4）培養條件。所述培養基均為MS基本培養基（含26 g/ L蔗糖、5.0 g/L瓊脂，pH 5.8），培養溫度為（25±2）℃ 、光照時間為12 h/d （日光燈，光照度2 000 lx ）。
2 結果與分析
2.1 金果欖莖段啟動培養
由表1可知，不同組合生長激素對金果欖莖段的啟動培養效果不同，帶腋芽的莖段培養10 d左右有不同程度的萌發，6-BA和KT均能起到較好的誘導作用，當6-BA濃度為1.0 mg/L，KT濃度為0.5 mg/L，2，4-D濃度為0.1 mg/L時，金果欖莖段誘導率達到95.1%，但當6-BA濃度一定，KT和2，4-D濃度過高時，誘導的部分叢生芽出現玻璃化現象。培養基中添加2，4-D后，芽的長度明顯增長，但部分出現愈傷組織，說明6-BA和KT為金果欖腋芽誘導的主要因素，而2，4-D對腋芽的誘導作用不大，其主要作用在于愈傷組織的誘導。金果欖莖段腋芽萌發的最適培養基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT +0.1 mg/L 2，4-D。
2.2 金果欖莖段增殖培養
將金果欖帶芽莖段接種于附加不同濃度的6-BA和一定濃度GA、NAA的MS培養基中，每個處理接種30瓶，每瓶接種3個莖段，經過2～3周培養可形成大量叢生芽。結果表明（表2），在4號培養基MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L GA+0.2 mg/L NAA上，金果欖叢生芽增殖系數最大，達到16.1，芽生長狀況也較好，雖然5號培養基中叢生芽的生長狀況也良好，但其增殖系數比4號培養基低，且出現了少量的愈傷組織，而在不添加任何激素的基本培養基上培養，金果欖叢生芽增殖系數最低，且生長緩慢，叢生芽較細弱。
2.3 壯苗與生根
將4號增殖培養基上誘導出來的金果欖叢生芽接種到壯苗培養基（添加0.5 g/L活性炭、0.1 mg/L IBA）上進行壯苗培養，20 d左右苗可長粗、長壯，然后將長至3～5 cm高的健壯試管苗接種于1～9號生根培養基中， 20 d 左右，苗基部根原基突起；一個月后，從根原基上長出白色新根，每株生根4～10條，根長2.3～7.5 cm。
不同濃度的生長激素及其組合均能誘導組培苗生根，但不同生長激素及其組合誘導苗生根的表現不同。如表3所示，只添加IBA的情況下，隨著IBA濃度的增加，金果欖叢生芽生根率提高，生根速度加快，與對照存在明顯差異，但根較細小，容易折斷，不利于移栽成活；只添加NAA的情況下，金果欖叢生芽生根雖比只加IBA的粗，但生根數減少；以NAA與IBA配合使用可提高金果欖生根率，其生根速度也加快，根粗，根數多，平均生根數最大為9.8±2.33。因此，綜合各項指標，在誘導金果欖生根時，以3號生根培養基1/2 MS+0.2 mg/L IBA +0.4 mg/L NAA為佳，接種后21 d即開始生根，30 d時生根率為85.4%，40 d后可達95%以上。
2.4 煉苗和移栽
煉苗、移栽基質和光照度對瓶苗移栽成活率都有很大影響，金果欖苗高約5 cm時開始煉苗。移栽前先閉瓶煉苗6 d，再將培養瓶蓋打開，放到全天自然光照，溫度25 ℃的通風條件下煉苗3 d，移栽時用鑷子將試管苗從培養瓶中取出，洗干凈根部培養基，放入添加了2 mg/L NAA的無菌水中浸泡10 min，移栽入已滅菌過的基質中（塘泥∶河沙=3∶1，體積比）， 移栽后7～10 d用塑料薄膜保濕，上面再覆蓋一層報紙，保持光照度以遮光率為60%左右為宜，空氣濕度85%以上，每天噴霧1次，10 d左右長出新根，移栽成活率達87.3%以上。
3 小結與討論
金果欖啟動培養的最佳培養基為MS+1.0 mg/L 6-BA +0.5 mg/L KT +0.1 mg/ L 2，4-D，其中6-BA和KT為腋芽誘導的主要因素；金果欖莖段增殖的最佳培養基為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L GA+0.2 mg/L NAA，生根的最佳培養基為1/2 MS+0.2 mg/L IBA +0.4 mg/L NAA，接種21 d后可開始生根，30 d時生根率為85.4%，可邊煉苗邊生根，10 d后
[摘要] 為提高藥用植物的產量和品質，增強我國藥用植物產業的競爭力，該文對藥用植物大規模組織培養的現狀、存在的問題及對策進行了分析。盡管生物技術是藥用植物生產最快捷、最有前途的手段之一，但仍存在諸如培養材料穩定性、轉基因藥用植物安全性、培養條件優化等方面的問題。因此，針對藥用植物自身特點，建立完善健全的評價體系，是保證藥用植物大規模組織培養可持續發展的關鍵舉措。
[關鍵詞] 藥用植物；組織培養；生物技術
隨著市場需求量的日益增漲，藥用植物不僅僅應用于傳統醫學保健和治療中，還作為化學藥品的原料，應用廣泛。許多藥效顯著、需求量大的植物源化學成分在生產上主要依賴于藥用植物的提取、純化，如紫杉醇、青蒿素等。然而，由于生態環境的破壞造成土地和其他自然資源的減少和惡化，以及藥用植物有效成分提取效率低下，植物原料質量參差不齊等不足，使得我國藥用植物有效成分的生產，面臨諸多問題和挑戰。借助于先進的科學技術手段，可以提高藥用植物的生產效率和品質、減輕資源壓力，對增強我國藥用植物產業的競爭力，發揮其應有的巨大潛力，并使之能夠可持續發展具有重要的意義。
生物技術是藥用植物生產最快捷、最有前途的手段之一。應用生物技術進行中藥材生產有以下幾個優點：①藥材（或活性成分）的生產可以在人為控制條件下進行，不受季節、氣候條件與土壤環境等因素的制約，可排除病蟲害的侵襲與農藥殘留量的困擾，嚴格控制藥材質量。②可進行特定的生物轉化反應，生產人們需要的活性成分。③通過活性成分生物合成路線進行遺傳操縱，提高目的物的產量。④通過加入或刪除基因而改變其遺傳特性，達到大幅度提升產量或合成新的活性產物[1]。從而改良品種或創造新物種，或加速繁殖植物個體，或獲得有用物質。
由于植物細胞具有全能性，即單個細胞在適宜的環境下可分化發育成植株，并具有整株植物所具有的合成化合物的能力，因此組織培養技術是藥用植物大規模生產的重要手段之一。藥用植物組織培養的研究工作取得了較大進展：已有百余種植物次生代謝產物通過組織培養技術獲得，近半數次級代謝產物的含量超過原植株，部分已進人中試和工業化生產規模。目前這項技術已發展成為一門精細的實驗技術，在選材消毒、接種培養、誘導篩選、繼代保存、分離鑒定等方面建立了一整套完整的技術方法[2]。越來越多的藥用植物已經進入大規模組織培養階段，本文針對藥用植物大規模培養組織培養的現狀，對大規模組織培養過程中的相關問題進行了分析和探討。
1 研究現狀
目前，藥用植物組織培養主要有2個方面：一是直接培養和收獲這些組織和器官，如不定根、不定芽、小鱗莖等。二是通過組織和器官培養獲得再生植株，從而進行快速繁殖，生產大量無病毒種苗以滿足藥用植物人工栽培的需要。近40年來，我國經離體培養獲得試管植株的藥用植物至少有200種[3]，涉及常用中藥和民族藥物的基原植物以及珍稀瀕危藥用植物、等。在利用植物組織培養直接生產藥物的研究方面也取得了很大進展，目前從各種培養物中產生的藥用成分已有約百余種，其中人參皂苷、人參皂苷元、三七皂苷、甘草甜苷、甜葉菊苷、柴胡皂苷、薯蕷皂苷、熊果苷、莨菪堿、小檗堿、總黃酮、蒽醌等[4]藥用成分含量等于甚至高于原植物。
我國以組織培養技術為基礎的毛狀根培養及其增殖技術也發展迅速，目前已利用人參、丹參、黃芪等建立了農桿菌轉化器官培養系統。韓國人參不定根和毛狀根的培養已經達到了工業化的程度，所用反應器的規模已經達到了10 t。Jeong等的實驗表明，在5 L的生物反應器中，經過39 d的培養，毛狀根的生物量是接種時的55倍[5]。黃芪毛狀根在3，5，10 L容器中培養，經21 d培養產量（干重）就可達10 g?L-1，黃芪毛狀根中皂苷、黃酮、多糖、氨基酸等含量類似于黃芪藥材，而粗皂苷和可溶性多糖的含量還稍高于藥用黃芪[6]。利用10 L的球狀氣升式反應器實現了丹參毛狀根的大規模培養，并利用 75 L的氣升式反應器進行了進一步的放大培養，表明利用氣升式反應器進行丹參毛狀根初級放大和中試規模的培養是可行的[7]，它為今后丹參毛狀根的工業化生產奠定了基礎。
2 存在的問題及對策
2.1 培養材料的穩定性重視程度不夠 很多藥用植物的不定根和毛狀根被當成實驗材料來進行實驗研究[8-9]，同時越來越多的組織培養材料被應用到實際生產中，隨著藥用植物組織培養的大規模生產，有望為名貴、珍稀瀕危植物資源的持續開發與利用以及綠色原料藥的生產開辟一條新途徑[5-7]。但是由于藥用植物組織培養條件、生長因子和操作的不可控性，在培養過程中有可能發生染色體變異，倍性的改變或產生突變體等，這些變異可能對藥用植物組織的生產和化學成分產生影響。因此，不能一味的追求生長量，還有必要對培養材料的穩定性進行相應的評價。
目前，有關藥用植物組織培養材料的穩定性研究較少，有關組培苗遺傳穩定性研究的內容和方法主要包括：①染色體核型和數目分析[10]；②無性繁殖過程中的遺傳穩定性[11-12]（RAPD，SSR等）；③對于轉基因植株還要檢測外源基因存在、整合和表達情況[13-15]（PCR，Southern雜交，western blot雜交等）。
2.2 轉基因藥用植物的安全性評價及標準有待于進一步確立 藥用植物的基因工程與農作物的遺傳轉化有著不同的側重點，即在轉基因藥用植物植株的篩選和評價過程中，轉基因事件對藥用植物有效成分乃至藥效的影響是首要考慮因素。利用根癌農桿菌Ti質粒轉化形成的冠癭瘤組織和發根農桿菌Ri質粒轉化形成的毛狀根作為培養系統生產有用的植物次生代謝產物，是當今藥用植物生物技術研究的熱點之一。冠癭瘤組織和毛狀根作為轉基因材料，其安全性評價研究一直處于空白狀態。
目前轉基因植物的安全性問題主要集中在2個方面，一個是環境安全性，另一個是食品安全性。由于藥用植物不同于農作物、蔬菜等，因此其轉基因安全性評價也應有所不同。首先，在環境安全性方面，由于藥用植物冠癭瘤組織和毛狀根均在可控的條件下進行培養，因此不涉及轉基因材料作為一個新物種進入生態系統可能對生態平衡產生負面效應的情況。在食品安全性方面，由于一般藥用植物的生產僅用于提取有效部位或成分，或者單獨作為一味藥物來使用，因此除了那些藥食同源的藥用植物以外，其他可考慮納入藥品的安全性管理體系進行評價和管理。重新評價藥物有效性和安全性是轉基因藥用植物安全性評價的優秀內容，但由于大多數中藥有效成分和療效機制不明確，轉基因藥用植物的藥效評價問題成為關鍵難點問題。
2.3 規?；a過程中培養條件的優化需重視 愈傷組織誘導、細胞培養、芽分化、繼代、生根是藥用植物組織培養的主要步驟，嚴格控制組織培養過程中培養基的各營養成分用量以及激素濃度和配比是保證藥用植物大規模生產成功的關鍵。在培養程序建立之后，遵循植物生長規律對細胞、組織的生長發育進行改進，如通過改變光質來調節外植體的脫分化、再分化以及有用代謝物的產生；配制培養基時采用適合于植物生長的pH；尋找新的碳源代替糖類，以減少污染。在利用組織培養技術進行大規模工廠化生產中，這些問題都需要做更深入的探討與摸索[16]。
2.4 適合植物組織和細胞培養的生物反應器尚有待研究解決 生物反應器是實現植物細胞和組織大規模工廠化生產的關鍵因素之一，其具有工作體積大、單位體積生產能力高、物理和化學條件控制方便、不受時間和地點限制等許多優點，這為植物組織培養生產天然產物的商業化開辟了廣闊前景。但要真正實現工業化和商業化尚受到來自生物本身和工程技術上的諸多限制，需在以下幾個方面加強研究：①根據不同植物組織和器官培養的生物學和工程要求，進一步創新反應器系統和培養工藝；②結合現代分子生物學技術，從分子基因和細胞代謝水平深人探索反應器中微環境對植物組織生長和次生代謝的作用機制；③建立新型植物組織培養反應器系統的放大規律，實現培養過程的工業化；④將反應器培養技術、現代儀器分析手段和智能專家控制系統進行集成，實現植物組織大規模培養過程的在線優化控制和自動化[17]。
2.5 植物次生代謝產物合成途徑研究平臺建設有待加強 對于藥用植物來說，藥用植物組織的大規模培養技術不僅是要提高生物量，最理想的應用是能夠大幅度提高藥用植物有效成分的含量。但是，由于大部分藥用植物有效成分的代謝途徑并不明確，甚至難以確認具有臨床價值的有效成分，因此對藥用植物有效成分相關功能基因進行發掘、鑒定等有利于解析其有效成分代謝途徑。組織培養技術是進行功能基因基礎研究的必要的技術平臺，研究和建立高效的藥用植物基因轉化體系，可為深入研究藥用植物有效成分的代謝途徑、發掘和鑒定相應的功能基因等提供重要的研究手段，大大提高藥用植物的基礎研究的水平，從而推動學科的發展。
3 小結
藥用植物大規模組織培養技術的研究是多學科交叉綜合的結果，涉及到植物化學、分子生物學、生化反應動力學等許多層面。充分利用先進的理論體系作指導，利用生命科學的研究模式[18]，從宏觀的形態，藥理藥效到微觀的基因、化學成分來分析和闡述藥用植物細胞、器官的性狀，從而指導藥用植物大規模組織培養的研究與應用。
藥用植物大規模組織培養研究和應用具有廣闊的發展空間，同時也蘊藏著巨大的經濟價值和社會價值。我國具有得天獨厚的藥用植物資源和市場優勢，加強藥用植物大規模組織培養研究將有利于我國藥用植物資源的可持續利用和發展。與此同時，應依據藥用植物自身特點，建立完善健全的評價體系，是保證藥用植物大規模組織培養可持續發展的關鍵舉措。
摘要：本文提出了高職《植物組織培養技術》課程項目化教學改革的必要性，在分析了目前課程教學中存在問題的基礎上，重新設定教學目標，并應用于項目化教學改革實踐，取得了明顯成效。
關鍵詞：高職；項目化教學；植物組織培養
近年來，我國高職教育取得了長足的發展。高職教育的人才培養模式已由過去的傳統教育方式逐漸向“工學結合、頂崗實習”的模式轉變。[1]《植物組織培養技術》課程是園藝技術專業一門實踐性很強的課程，依據園藝技術專業工作任務與職業能力分析表中的植物組織培養工作項目設置。其目的是培養學生組建應用性植物組織培養室，應用組培技術進行花卉、苗木等良種快繁與無病毒種苗生產的能力。對于植物生產這一園藝技術專業的優秀工作崗位而言，植物組織培養技術打破了傳統農業生產模式，技術含量高，經濟效益特別突出，具有重要的現實意義。隨著現代農業的不斷推廣，植物組織培養技術必將在植物生產中發揮越來越重要的作用。為實現高職教育園藝技術專業的培養目標，提升學生的就業競爭力，滿足企業用人需求，需要進行基于企業真實生產任務的課程項目化教學改革。所謂項目化課程，是指以工作任務（項目）為中心，選擇、組織課程內容，并以完成工作任務為主要學習方式的課程模式。[2]本文是對《植物組織培養技術》課程項目化教學改革實踐過程中的思考和體會。
一、植物組織培養技術課程中存在的主要問題
原有的植物組織培養課程是以知識傳授為主要特征的學科課程模式，根據傳統的教材框架，依照植物組織培養的概念與發展等知識點逐步展開。學生學完之后，理論很懂，但無法應用于實際，表現在不能獨立組建實驗室，不能應用組培技術進行植物生產。實行項目化課程改革以后，針對高職學生特點和培養目標，組培課程的設計思路轉變為以“組建實驗室應用組培技術開展植物生產”這一優秀工作任務為依據，以實驗室設計、培養基配制、愈傷組織培養、器官培養、組培工廠化生產這些項目為載體，讓學生在完成具體項目的過程中學會完成相應工作任務，并構建相關理論知識，發展職業能力。圍繞優秀能力構建課程內容。
二、教學目標重新設定
《植物組織培養技術》是園藝技術專業的一門專業平臺課，授課對象為園藝技術專業二年級學生。根據工作崗位要求和杭州市部分企業的調研，重新設定了《植物組織培養技術》課程的知識目標、能力目標和素質目標。
三、項目化教學改革實踐
（一）教學內容
教學項目的設定應該將理論知識和實踐技能結合在一起，與企業實際工作有直接關系，并且具有一定難度。[3]按照這樣的要求，具體教學項目設置如表2。
（二）教學方法
教學體現培養學生職業崗位能力和創新精神，不拘泥于課程體系的完整性和學科性，而突出植物組織培養職業崗位的實踐作為取舍教學內容的依據。將單項操作與綜合實踐相結合，根據植物組織培養的技術環節多而且各項技術間關系密切的特點，隨著課程教學的進展，一個接一個，一環套一環，有序進行，使每個學生牢固掌握每項基本操作，練好基本功。在進行單項技術操作訓練之后，安排綜合實習。要求每個學生針對某一植物的特點，從培養基配制，到外植體的選取、消毒、接種、培養、試管苗的馴化與移栽等全過程進行實踐，并進行最后的實踐成果展覽，達到完整掌握植物組織培養基本技能的目的。建設設備完善、功能較好的校內外生產實踐基地（校外為浙江傳化生物技術有限公司），配備具有豐富實踐經驗的指導教師，聘請浙江傳化生物技術有限公司具有實踐經驗的專業人員擔任部分教學工作和實訓指導。學生實訓的成品要達到合格商品的要求，能產生利潤。使學生充分理解植物的應用及創造性，同時也培養了學生的成就意識。
四、項目化教學改革后教學效果顯著提高
在項目化課程教學實施過程中，教學效果的評價主要應關注學生。[4]項目化教學改革后，先后在杭州職業技術學院園藝技術專業2010、2011、2012級進行教學實踐，結果證明，教學效果明顯優于改革前。通過項目化教學改革，將課堂與企業實踐操作結合，課堂建立在實訓中心和企業生產車間，讓學生在操作中享受成品產生利潤的快樂；與浙江傳化生物技術有限公司緊密聯系，該企業優勢明顯，是全國園藝行業的龍頭企業，吸收他們的新品種、新工藝、園藝行業新的生產流程，拓展了學生的知識面；課程考核與產品相結合，將學生的產品作為考核關鍵內容，增強了學生的責任感；課程教學改革由校企雙方指導老師共同參與，雙方老師共同授課，隨時根據生產一線實際需求調整授課內容，激發了學生的學習興趣。
作者簡介：鄭慧?。?980―），男，浙江省杭州市，杭州職業技術學院，講師，園藝技術專業教師。
摘要：控制污染是植物組培苗工廠化生產中重要的技術環節。該文主要污染的原因、外植體的選取與消毒、組織培養過程中各環節操作等方面，討論了減少污染的措施和方法。
關鍵詞：植物組織培養 污染 防治
0 引言
植物組織培養又稱植物克隆，指通過無菌操作把植物的外植體接種于人工配制的培養基上，在人工控制環境下進行離體培養的一套技術。植物組培苗的工廠化生產在我國發展速度很快，組織培養技術日趨完善，在市場競爭中，如何降低成本是提高經濟效益的首要問題，組織培養中污染率的增加勢必引起組培苗成本的提高，經濟損失很大。因此，組織培養中降低污染率是工廠化生產中不可忽視的技術環節。植物組織培養過程中造成污染的原因是多方面的，應根據具體情況從不同方面預防解決。
1 污染的原因
污染是指在組織培養過程中培養基和培養材料滋生雜菌，導致培養失敗的現象。在培養過程中污染是經常發生的。污染的原因，從病原菌方面來分析主要有細菌及真菌兩大類。真菌性污染主要指霉菌引起的污染。一般接種后3-10d可在培養基中發現各種顏色的菌斑。真菌性污染，一般多由接種室內的空氣不潔凈、超凈工作臺的過濾效果不理想、操作不慎等原因引起。細菌性污染的主要癥狀是材料附近出現黏液狀物，或在材料附近的培養基中出現混濁和云霧狀痕跡。一般在接種后1-2 d即可發現。細菌性污染除外植體帶菌或培養基滅菌不徹底外，主要是操作人員的不慎造成。除要求操作人員嚴格按照無菌操作程序操作外，外植體帶菌引起的污染與外植體的種類、取材季節、部位、預處理方法及消毒方法等密切相關。[1]
2 污染的預防措施
2.1 外植體
2.1.1 外植體的選取
外植體的選取和預處理首先應控制外植體采摘的季節、時間和部位。外植體一般在材料休眠末期或萌動前期取材較為有利，因為此時材料積累了較豐富的營養和內源激素，其抵抗病菌的能力較強、同時病菌也還未活躍起來。其次應選取無病毒的外植體，如外植體帶有病毒，則應采取預栽管理、促發新枝、黃化處理、熱擊處理、添加抗生素等措施進行處理，以培養出無病毒的外植體。
2.1.2 外植體的消毒
外植體的滅菌處理外植體采摘后，通過表面滅菌、深滅菌或其他處理去除所帶病菌，這也是接種前的重要工作。外植體消毒常用的藥劑有：70-75% 的乙醇溶液，0.1%-0.2%的升汞溶液、漂白粉的飽和溶液。（1）表面滅菌。先將采摘外植體洗去泥土，用洗潔劑浸泡、沖洗，必要時用軟刷或脫脂棉球擦洗材料表面，然后將其剪成適宜大小，再進行深滅菌。（2）深滅菌。經過表面滅菌后，仍有雜菌存在于外植體表面或內部，必須經過深滅菌處理才能獲得不帶菌的外植體，如添加消毒劑或抗生素、使用混合消毒液、水浴、灼燒、真空減壓滅菌、磁力攪拌滅菌、超聲波振動滅菌以及多次消毒等。但值得一提的是，目前對材料內部污染還沒有令人滿意的滅菌方法。
2.2 組織培養過程中各環節操作
造成這類污染的主要原因有：環境條件不潔；操作人員不遵守操作規程自身帶菌；操作人員操作不規范，超凈工作臺的過濾裝置能力欠佳等。
2.2.1 改善環境條件
接種室與培養室要定期消毒與凈化，接種前工作臺或接種箱要開紫外燈30min以上。培養室的相對濕度應控制在7O%左右，濕度太高時可用抽濕機除濕。在接種結束時，也應清潔接種室的地面，相對濕度太高時可以用抽濕機除濕，并定期用甲醛熏蒸。[2]
2.2.2 操作人員應嚴格執行實驗操作
穿戴專用的無菌鞋、工作服、工作帽、口罩及發罩，用消毒液洗手；接種過程中不應頻繁開啟接種室門窗；定期打掃或用甲醛熏蒸培養室和接種室，檢查超凈工作臺的衛生質量：及時處理被污染的培養瓶，而不應隨意棄置，以防病菌傳播。
2.2.3 添加抗生素
植物體中的內生細菌潛伏得較深，表面消毒無法將其消除，這種污染在外植體的初期培養中（前幾代的繼代培養），不易被肉眼察覺，隨著繼代次數增加，菌量逐漸累積發展，才在培養基上顯現出來。一旦發現培養基被污染應立即剔除，并對接種室和培養室進行紫外燈照射或藥液熏蒸。但是，在使用抗生素時必須弄清抑制的病菌種類、使用的抗生素是否對培養的植物組織有不良影響以及抗生素的使用濃度和處理時間。由于能對所有微生物都有效的抗生素是不存在的，因此抗生素也不能完全代替滅菌技術，而最好的方法就是將其添加在培養基中作為防止污染的輔助措施。
2.2.4 其他
對接種材料要嚴格把關，淘汰被污染的接種材料；檢查滅菌鍋的質量，如嚴格執行實驗操作后仍有污染現象，則應及時檢查滅菌鍋的性能；檢查培養容器是否存在污染問題，培養容器大多用塑料蓋、膠塞、棉塞或薄膜等封口，其中塑料蓋使用太久后易老化、密封性較差，也會造成污染。培養瓶要充分洗凈并消毒，滅菌后不應放在空氣中太長時間，一般于滅菌后1-2d接種為宜，以減少污染。
3 展望
在植物組培苗的工廠化生產過程中，由于污染造成生產成本偏高或產品不合格的情況時有發生，嚴重影響了組培苗的工廠化生產進程，因此開展污染防治的研究顯得非常迫切。通過對組培外植體的處理和嚴格無菌操作等措施均能夠有效降低污染率，但在防治污染方面還有很多問題需進一步研究。目前，組織培養的工作不僅集中在無菌操作空間、無菌培養空間及高效抗生素的獲得上，開創新的組織培養方法及培養條件也是研究的重點領域之一，總而言之，控制或降低污染率是植物組織培養的關鍵技術之一，同時也是組織培養工作效率高低的重要指標之一。從組織培養的全過程來看，每一環節都可能出現污染，為了實現低污染率在組織培養中除了加強無菌意識，提高無菌操作各環節的技術規程外，還要注重無菌操作訓練，提高操作水平，同時在培養基中針對性的加入抑菌劑、抗菌素。[3]
摘要 以植物組織培養技術實驗課為例，從教學內容設計、考核方式等細節進行創新，通過分析改革效果，表明創新該課程可調動學生學習的積極性，增強其意志品質，同時還分析了改革的不足之處及下一步對策。
關鍵詞 植物組織培養技術；教學；考核；創新
植物組織培養技術的發展已有100多年的歷史，該項技術的誕生、發展也催生了生物技術的快速發展[1]。
安徽科技學院是安徽省首批應用型本科示范性建設高校，大力提高本科教學質量、培養創新創業人才是學校的根本任務和目標。根據《植物組織培養技術》實驗課程實踐性強、與理論結合緊密的特點，2010年對2008級農藝教育專業2個班共77名學生開展了對該門課程教學模式、考核方法改革創新的嘗試，同學期的89名同學仍然以講授、操作驗證性實驗項目為參照，探索改革創新的優點與不足，為進一步改革創新提供思路。
1 設計與實施研究性教學內容
研究性教學的特征之一是教學內容的綜合性[2-3]。以《植物組織培養技術》實驗課為例，對比研究性實驗項目和驗證性實驗項目可知，前4個項目是需要學生掌握的是基本實驗操作技術，即要求學生了解移液器、高溫消毒器、電子天平及刀剪鑷滅菌器等組培常用儀器的使用方法，明確最常用的MS基本培養基母液及常用的激素的用途、配制方法及使用濃度，通過掌握1個最常見的培養基配方的配制及滅菌操作，同時結合掌握外植體滅菌及無菌操作，了解植物組織培養一整套的基本操作程序（表1）。
下一步實施中，將77名學生分為16組，每組4～5人，在4位經驗豐富的實驗教師指導下，查詢國內外相關資料，由學生自主選擇植物，按照3條技術路線的1條具體實施（圖1）。
2 創新考核方式
對進行研究性實驗的2008級農藝教育專業2個班，重新制定了學生實驗成績的評定方法。一是增加了隨堂考核環節。為了讓學生牢固掌握組培的基礎環節，在講解完《培養基配制與滅菌》章節的內容后，立即給各小組發放1張有不同配方的紙條，要求各小組在10 min內完成配方內各類元素及激素、瓊脂、蔗糖的計算，錯誤的組別扣除一定的平時分，并要求其重新計算直到正確為止。二是將平時的觀察次數列入考核項目。由于《植物組織培養技術》實驗內容涉及到植物在離體條件下生長的各環節，需要多觀察、多分析，故設定該環節，亦是為了讓學生能及時掌握質量性狀（顏色、是否污染等）和數量性狀（增殖苗數、生根數等）的統計方法、鍛煉其試驗的認真態度，通過對不同現象的分析和探索，加強師生之間的交流。三是整體和個體相結合的全面考核環節。除了有實驗報告和總結之外，為了更好地了解每個學生參與實驗情況，在學期結束時首先安排各組組長全面總結、陳述該組實驗的設計、遇到的問題、解決的方法以及實驗結果，進而由教師對每位同學就實驗中的問題進行隨機提問，視學生對實驗的熟悉程度、回答問題情況進行綜合評判，給出實驗成績，每組由2位老師把關，取其分數進行平均，即得出該同學的最終實驗成績（表2）。
3 創新效果評價
鑒于實驗評分的人為性及2種教學方式的巨大差異性，從真正掌握理論知識和實驗操作角度考慮，以不同年份、不同班級的同一份期末試卷為標準，期望通過縱向和橫向對比，用卷面成績反映出2種教學方式的差異。
由表3可知，進行縱向比較，3年中成績以2010年的平均成績最高，達80.30分，優秀比率最多，達20.51%，不及格率最低，為3.21%，個人最高成績出現在2009年，最低成績出現在2011年。對2010年進行橫向比較，開展研究性教學班級的平均分為80.60分，而驗證性實驗的班級僅為80.07分，說明2010年的總體80.30分的平均分的貢獻主要來源于開展研究性實驗的班級，且其不及格率僅為2.99%，但其優秀人數要低于驗證性實驗班級。說明經過學生主動學習、探索的過程，有助于學生更加熟練掌握組培的流程，清楚理論課上的定義、步驟在具體實驗中的重現以及各項操作的注意事項、每個步驟的意義，但同時由于每組僅實施3種不同技術路線的1個，忽視了其他2條路徑特定環節的操作細節，因而出現了平均成績較高但成績優秀的學生比例不多的現象。
4 結語
研究性教學是讓學生在獨立的探索、思考和實踐的研究過程中吸收知識、應用知識、分析問題和解決問題[4]。其改革的目的是強調學生由被動學習到主動探索、思考、實踐的過程，因而具有更高的挑戰性。從現場考核、實驗操作、卷面成績等方面都反映出新的實驗課教學方法所產生出的可喜效果。一是調動了學習的積極性，提高了學生動手能力及團隊意識。研究性教學所涉及的實驗路線是一個完整的組培過程，學生在具體實施前會查詢國內外資料，自我設計配方并配制，定期觀察結果、分析并解決問題。經過上述鍛煉，組內學生之間會加強相互溝通，從自身的認知度來闡述出現問題的原因及解決的途徑，調動了學習的積極性，提高了自身動手能力和團隊合作意識。二是增強學生的意志品質，加強師生交流。對首次接觸《植物組織培養技術》實驗課程的學生來說，其難點集中于外植體污染、合適培養基和激素配方的篩選、煉苗等環節。多數組別在解決外植體污染問題時至少要經過2～3次的實驗，對學生的意志品質有了更高的要求，且通過在解決問題時主動與指導教師及時溝通，加強了師生之間的交流，明晰問題出現的原因、解決途徑并進行總結。因而，在此過程中，指導教師不再是單純的知識傳授者，而是學生學習的引領者、參與者和學習顧問。
另外，實驗課程教學的創新中也反映出一些問題，一是時間設置較短。基于植物生長規律，近2/3組別只完成了實驗路線中1/2，僅有2組完成了全部內容環節。二是部分同學存在“搭便車”現象[5]。通過實驗考核環節，發現少數同學不能回答本組實驗中出現的問題，甚至個別同學無法說出培養基和激素配制的步驟，反映其只是掛名，參與度較低、責任心較差。三是考核環節需細化。此次考核系通過2位老師隨機提問來了解學生對實驗的掌握程度，并未細化學生對實驗操作、配方配制、國內外研究進展的了解。上述問題可以分別通過選擇組培周期短的植物、延長實驗時間、平時加強與每一位參與學生的交流及根據重要性給各考核環節分別賦分的方式予以解決，同時這也對指導教師提出了更高的要求，即及時更新和拓寬知識面、不斷提高科研水平。
一、考情分析
植物組織培養在農業生產中的應用、動物細胞培養的過程及影響因素一直是高考命題的熱點。命題會利用信息材料為背景以圖解的形式考查有關植物組織培養的相關知識，或結合植物育種、動物細胞培養等知識進行綜合考查。
二、復習建議
本部分題目中常出現操作流程圖或裝置圖，如植物組織培養的操作流程圖、動物細胞培養過程圖等，復習過程中要注意運用列表比較的方法分析不同技術手段的異同點，注意掌握各種技術手段中的特殊點和關鍵環節；要善于識別這些圖解，要知道圖中所表示的物質、結構和過程，知道每個環節的操作要點，并對一些現象進行正確分析。
三、知識梳理
（一）植物組織培養
1.原理：植物細胞具有全能性。
2.過程。
3.植物組織培養過程的幾點說明。
（1）外植體的選擇與制備。
①選擇外植體時，由于外植體的脫分化難易因植物種類、器官來源及生理狀況的不同而有很大差異，因此，選擇哪些作為外植體應注意。一般來講，煙草、胡蘿卜、植物的花和幼嫩的組織脫分化相對較易，而植物的莖、葉和成熟的老組織則較難。
②制備外植體首先要消毒，其次要選取有形成層（形成層細胞易脫分化）的部分。
（2）嚴格的無菌條件。
植物組織培養用的培養基含有植物生長發育所需要的各種營養物質，這些營養物質同樣為細菌等微小的生物提供了適合的營養。在這種培養基上，細菌等微小的生物比植物細胞具有更強的新陳代謝能力，它們比植物細胞生長、繁殖得更快，而且它們會產生毒素，使培養的植物細胞很快中毒死亡。因此，植物組織培養要想取得成功，必須有效地防止細菌等的污染，保證培養材料、培養基、培養用具嚴格無菌。
（3）完全的營養條件。
離體的植物細胞失去了植物的自養能力，所以需要為其提供包括水、有機營養、礦質營養、維生素等營養物質。
（4）光照條件。
離體的植物細胞、組織和器官脫分化形成愈傷組織時，需避光處理；而愈傷組織再分化形成植物幼苗時，需光照處理。
（5）激素調控。
①生長素類含量＞細胞分裂素類含量：誘導植物組織脫分化和根原基形成。
②生長素類含量＜細胞分裂素類含量：誘導愈傷組織再分化和芽原基形成。
③赤霉素類：促進分化的叢芽和小植株快速生長。
【易混警示】分化、脫分化、再分化。
比較內容脫分化再分化分化過程外植體愈傷組織愈傷組織幼苗形成體
特點排列疏松、高度液泡化的薄壁細胞有根、芽需要條件a.離體；b.適宜的營養；c.生長素/細胞分裂素的比例適中；d.不需光a.離體；b.適宜的營養；c.生長素/細胞分裂素的比例高（或低）誘導生根（或生芽）；d.光照在個體發育中，相同細胞的后代在形態、結構和生理功能上發生差異的過程，具有普遍性、持久性、穩定性和不可逆性；分化的結果是形成不同的組織器官，幫助個體完成正常的生長發育4.植物組織培養技術的應用。
（1）植物繁殖的新途徑。
①微型繁殖。
實質植物組織培養原理植物細胞的全能性條件培養基中加入細胞生命活動所需的水、礦質元素和小分子有機物，還有激素，更重要的是所有加入的物質必須是無菌的，操作過程必須是在無菌條件下操作，這樣繁殖的幼苗才是無毒的微型繁殖
技術的
優點a.能保持親本的一切優良性狀，子代個體具有的遺傳物質與親本一樣
b.選材少，培養周期短，繁殖率高
c.不受自然生長季節的限制，便于自動化管理，有利于進行工廠化培養范圍作物脫毒，人工種子中的胚狀體、不定芽、頂芽和腋芽的獲得采用的技術均是微型繁殖②作物脫毒：a.解決方法：切取一定大小的莖尖進行組織培養，再生的植株就有可能不帶病毒，從而獲得脫毒苗。b.理論基礎：植物分生區附近病毒極少，甚至無病毒。c.特點：繁殖速度快；幼苗遺傳背景均一；不受季節和地區限制。
③人工種子（如下圖）。
人工種子主要由三部分組成:
a.胚狀體(分生組織),它相當于天然種子的胚,是有生命的物質結構；
b.供胚狀體維持生命力和保證其在適宜的環境條件下生長發育的“人工胚乳”；
c.具有保護作用的“人工種皮”。
【特別提醒】人工種皮是保證包裹在其中的胚狀體順利生長發育成小植株的關鍵部分，針對植物種類和土壤等條件，在人工種子的包裹劑中還可以加入適量的養分、無機鹽、有機碳源以及農藥、抗生素、有益菌等。為了促進胚狀體的生長發育，還可以向人工種皮中加入一些植物生長調節劑。
（2）作物新品種的培育。
①單倍體育種：花藥離體培養過程就是植物組織培養過程。
a.原理：整個單倍體育種過程的原理是染色體變異，其中的花藥離體培養是利用細胞的全能性。
b.過程：通過花藥離體培養獲得單倍體植株，染色體加倍后當年可得到穩定遺傳的優良品種，極大地縮短了育種年限。如下圖：
花藥離體培養單倍體幼苗種水仙素誘導染色體數目加倍純合子
②突變體的利用。
a.來源：植物組織培養過程中，由于培養細胞一直處于不斷分生狀態，容易受到培養條件和外界壓力的影響而產生突變，從這些突變的個體中可以篩選出對人們有用的個體，培育新品種。如下圖：
b.實質：植物組織培養。
c.形成原因:培養細胞一直處于不斷分生的狀態，容易受外界一些條件的影響而發生突變。
③細胞產物的工廠化生產：可以利用植物組織培養技術大量生產某些細胞產物，如蛋白質、脂肪、糖類、藥物、香料、生物堿等。
【易混警示】單倍體育種和突變體利用的比較。
項目原理優點成果單倍體
育種染色體變異明顯縮短育種年限單育1號煙草品種，11號水稻和京花1號小麥品種等突變體
利用基因突變產生新基因，大幅度改良某些性狀抗花葉病毒的甘蔗；抗鹽堿的野生煙草等（二）動物細胞培養
1．概念：從動物機體中取出相關的組織，將它分散成單個細胞，然后，放在適宜的培養基中，讓這些細胞生長和增殖。
2．操作流程。
3.過程解讀。
（1）原理：細胞增殖。
(2)動物細胞培養的條件。
①充足的營養供給――微量元素、無機鹽、糖類、氨基酸、促生長因子、血清等。
②適宜的溫度、適宜的pH。
③氣體環境：O2、CO2。
④無菌、無毒環境培養液和培養用具殺菌消毒
培養過程加抗生素殺菌
定期更換培養液，清除代謝產物
（3）動物細胞要分散成單個細胞培養的原因：分散成單個細胞、細胞群（團）后容易培養，細胞所需的營養容易供應，其代謝廢物容易排出；而用大塊組織培養時，內部細胞的營養供應和代謝廢物的排出都較困難，因此，這些細胞在體外長時間的生存和生長就較困難。同時，分散成單個細胞培養，可使得在細胞水平操作的其他技術得以實現。
（4）選取幼齡動物的組織、器官作為材料的原因：動物細胞培養時，一般選取幼齡動物的組織、器官，其細胞的分化程度較低,增殖能力強,有絲分裂旺盛，容易培養。
（5）胰蛋白酶在培養過程中的作用及與原代培養和傳代培養的聯系。
原代培養和傳代培養一般均需對細胞進行胰蛋白酶細胞分散處理，區分兩種“培養”的關鍵是看用胰蛋白酶處理的對象。
①第一次：用胰蛋白酶對剪碎的動物組織進行處理，分散后培養，即為原代培養。
②第二次：細胞培養過程中出現接觸抑制，用胰蛋白酶使其從瓶壁上脫離下來，分散到多個培養瓶中繼續培養，即為傳代培養。
（6）細胞貼壁和接觸抑制。
懸液中分散的細胞很快就貼附在瓶壁上，稱為細胞貼壁。細胞數目不斷增多，當貼壁細胞分裂生長到表面相互接觸時，細胞就會停止分裂增殖，這種現象稱為細胞的接觸抑制。
4.植物組織培養與動物細胞培養的比較。
比較項目植物組織培養動物細胞培養培養基的物
理性質固體培養基液體培養基(合成培養基)原理細胞的全能性細胞的增殖培養的成分水、礦質元素、維生素、蔗糖、氨基酸、瓊脂等葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素、動物血清等結果新的植株或組織新的細胞系或細胞株目的①苗木的快速繁殖；②培養無病毒植株；③生產藥物、香料等；④制備人工種子；⑤單倍體育種獲得細胞或細胞的產物（如單克隆抗體）取材植物細嫩的部位或花藥等動物胚胎或出生不久的幼齡動物的器官或組織其他條件均為無菌操作，需要適宜的溫度、pH、O2等條件【特別提醒】①兩種技術手段培養過程中都進行了有絲分裂，都是無性繁殖，都可稱克隆，都不涉及減數分裂。
②植物組織培養最終產生新個體，體現了細胞的全能性；動物細胞培養產生大量細胞，不形成新個體，故不能體現細胞的全能性。
【易混警示】原代培養和傳代培養的辨析。
原代培養傳代培養可有兩種表述：a.細胞懸液第一次在瓶中培養，沒有分瓶培養之前的細胞培養；b.第1代細胞的培養與傳10代以內的細胞培養同樣有兩種表述：a.細胞懸液培養一段時間后，分瓶再進行的細胞培養；b.傳10代以后的細胞培養四、典例展示
例1.通過植物組織培養技術可以快速繁殖、生產藥物及培育無病毒的植物等。據圖甲、表乙回答問題。
離體的植物器官、組織或細胞①愈傷組織②胚狀體培養植物體
圖甲植物組織培養過程
表乙：植物的花芽分別在含有不同比例的生長素和細胞分裂素的培養基中的生長狀況
A組B組C組D組E組生長素03ppm3ppm0.03ppm0細胞分裂素00.2ppm0.002ppm1.0ppm0.2ppm花芽生
長狀況仍是組
織切塊形成愈
傷組織愈傷組織
分化出根愈傷組織分
化出嫩芽稍生長(1)離體的植物器官、組織或細胞能夠被培養成新的植物體的原因是。
(2)用植物組織培養方法誘導離體的植物組織形成具有生根發芽能力的胚狀體結構，若包裹上人造種皮，制成人工種子，可能解決有些作物品種繁殖能力差、結子困難或發芽率低等問題。胚狀體來源于離體的植物體細胞，其形成過程中要經過的生理變化大體上是圖甲中［］和［］過程，在此過程中被培養的細胞始終受的調節(［］內填序號)。
(3)應用植物組織培養技術培養莖尖或根尖組織可獲得無病毒植株，其原因是。
(4)從表乙的實驗結果可看出：生長素和細胞分裂素是實驗中的兩種重要物質。其中，新芽形成必需的條件是；而在培養形成完整新個體過程中，對它們的調控關鍵是。
解析：(1)植物組織培養的原理是細胞的全能性。(2)①是脫分化，得到愈傷組織，②是再分化，得到胚狀體。(3)植物的根尖或莖尖分裂快，病毒尚未來得及侵染。培養莖尖或根尖組織可獲得無病毒植株。(4)由表乙D組看出，細胞分裂素的濃度大于生長素的濃度，脫分化出嫩芽。在不同培養期，細胞分裂素與生長素的濃度和比例不同，分化的器官就不同，在組織培養過程中，其濃度和比例非常關鍵。
答案：(1)植物細胞的全能性(2)①脫分化②再分化植物激素(3)植物的莖尖或根尖很少被病毒感染，甚至無病毒(4)細胞分裂素的濃度大于生長素的濃度適當調控好不同培養期的培養基中細胞分裂素與生長素的濃度和它們的比例
例2.（2014?甘肅秦安一中第一次檢測卷）某研究小組為測定藥物對體外培養細胞的毒性，準備對某種動物的肝腫瘤細胞（甲）和正常肝細胞（乙）進行細胞培養。下列說法不正確的是（）
A．在利用兩種肝組織塊制備肝細胞懸液時，也可用胃蛋白酶處理
B．為了防止細胞培養過程中細菌的污染，可向培養液中加入適量的抗生素
C．細胞培養應在含5%CO2的恒溫培養箱中進行，CO2的作用是維持培養液的pH
D．將數量相等的甲、乙細胞分別置于相同適宜條件下培養，一段時間后，會觀察到甲細胞的數量比乙細胞的數量多
解析：胃蛋白酶最適pH是1.5，而一般細胞培養在pH是6.5~8.0，所以不能用胃蛋白酶處理，A項錯誤?？股乜梢杂行б种萍毦姆敝?，所以可以加入適量抗生素，B項正確。細胞培養過程中，5%CO2的作用是調節細胞培養液的pH值，故C項正確。因為肝腫瘤細胞在適宜條件下具有無限增殖的能力，而普通細胞沒有此特性，所以D項正確。
答案：A
例3.回答下列有關動物細胞培養的問題。
(1)在動物細胞培養過程中，當貼壁細胞分裂生長到細胞表面時，細胞會停止分裂增殖，這種現象稱為細胞的。此時，瓶壁上形成的細胞層數是。要使貼壁的細胞從瓶壁上分離下來，需要用酶處理，可用的酶是。
(2)隨著細胞傳代次數的增多，絕大部分細胞分裂停止，進而出現的現象；但極少數細胞可以連續增殖，其中有些細胞會因遺傳物質發生改變而變成細胞，該種細胞的黏著性，細胞膜表面蛋白質(糖蛋白)的量。
(3)現用某種大分子染料，對細胞進行染色時，觀察到死細胞被染色，而活細胞不被染色，原因是。
(4)檢查某種毒物是否能改變細胞染色體的數目，最好選細胞分裂到期的細胞用顯微鏡進行觀察。
(5)在細胞培養過程中，通常在條件下保存細胞。
解析：（1）在動物細胞培養過程中，細胞會表現出接觸抑制現象，此時是單層細胞。用胰蛋白酶可以使貼壁細胞從瓶壁上分離開來。（2）隨著細胞傳代培養代數的增多，絕大部分細胞分裂停止，進而出現衰老甚至死亡的現象，但極少數細胞可以連續增殖，有些細胞會因遺傳物質改變而變成不死性細胞。（3）由于活細胞的細胞膜具有選擇透過性，大分子染料不能進入活細胞內，而死細胞的細胞膜喪失選擇透過性，大分子染料能夠進入死細胞內而著色。（4）由于細胞分裂中期染色體形態固定、數目清晰，因此可作為顯微鏡觀察染色體數目的最佳時期。（5）冷凍或超低溫、液氮條件下，細胞中酶的活性降低，細胞新陳代謝的速率降低，故適宜保存細胞。
答案：(1)相互接觸接觸抑制單層(或一層)胰蛋白酶(2)衰老甚至死亡不死性（大大）降低減少(3)由于活細胞的細胞膜具有選擇透過性，大分子染料不能進入活細胞內，故活細胞不被染色(或由于死細胞的細胞膜喪失了選擇透過性，大分子染料能夠進入死細胞內)(4)中(5)冷凍(或超低溫、液氮)
五、鞏固訓練
1.（2013?北京市東城區期末卷）右圖表示一定條件下將胡蘿卜的離體組織培育形成試管苗的過程。下列有關敘述不正確的是（）
A．需在無菌條件下將離體組織接種到培養基中
B．圖中①②過程分別表示脫分化和再分化
C．利用此過程獲得的試管苗均為純合子
D．此實驗說明分化的植物細胞仍具有全部的遺傳信息
2.植物組織培養依據的原理、培養過程的順序及誘導的植物激素分別是（）
①體細胞全能性②離體植物器官、組織或細胞③根、芽④生長素和細胞分裂素⑤生長素和乙烯⑥愈傷組織⑦再分化⑧脫分化⑨植物體
A．①、②⑦⑥⑧③⑨、④
B．①、②⑧⑥⑦③⑨、④
C．①、⑥②⑨⑧③⑦、⑤
D．①、②⑨⑧⑥⑦③、⑤
3.下列關于動物細胞培養的敘述中，錯誤的是（）
A．用于培養的細胞多取自動物胚胎或幼齡動物
B．培養過程中需要使用胰蛋白酶等獲得細胞懸液
C．動物細胞培養時要保證氧氣供應，不能通二氧化碳
D．動物細胞培養時的培養基是液體培養基，并要加入血清
4.下列與動物細胞培養有關的表述中，不正確的是（）
A.動物細胞培養需要無菌、營養、適宜的溫度和pH等條件
B.用胰蛋白酶作用于離體的動物組織，使其分散成單個細胞
C.放入CO2培養箱中培養動物細胞的主要目的是為了滿足細胞對CO2的需求
D.細胞株一般具有恒定的染色體組型、生化特性等
5.（2013?吉林省吉林一中高三第二次摸底考試卷）植物組織培養是克隆植物的一種方法，過程如下圖所示，請回答相應的問題。
(1)為了獲得脫毒植株，外植體往往取自植物的花芽、葉芽等處的分生組織，其原因是。
(2)培養皿中的培養基除添加營養物質外，還需要添加植物激素，其目的是誘導外植體。
(3)在生產實踐中為獲得大量的細胞產物，如紫杉醇，可將①放入液體培養基中，經機械作用分散成單個細胞，制備成細胞浮液，再經過即可獲得大量細胞。
(4)組織培養過程需要植物生長和繁殖的最適條件，否則在光學顯微鏡下可能觀察到發生異常，進而使植物出現遺傳不穩定甚至不育。
(5)植物組織培養技術不僅應用于花卉和果樹的快速大量繁殖以及脫毒植株的獲取，還廣泛用于、、等育種過程中。
6.制造人工種子的原理是在組織培養得到的“胚狀體”的最外面用一層有機膜包裹，并在薄膜以內放入一些營養物質，這層膜和這些營養物質分別具有種皮和胚乳的功能（如下圖所示）。在制造過程中還可以加入某些農藥、菌肥等。據此材料回答下列問題：
（1）胚狀體來源于離體的植物體細胞，其形成過程中要經過的生理變化大體上是和。在這一過程中被培養的細胞始終受的調節。
（2）從保證人造種子正常生命力及生態系統物質循環上來看，其外部薄膜應具有等的特點。
7.（2013?福建福州期中卷）下圖是動物細胞培養的基本過程示意圖。請據此回答：
（1）容器A取材于動物胚胎或幼齡動物的原因是。
（2）容器B中一般先用酶處理，消化組織中的膠原纖維，這利用了酶的性，這樣做是為了使細胞分散開來，便于細胞與充分接觸。
（3）C瓶內的培養為，這一時期的細胞具有恒定的、和生化特性等。
（4）為了把C瓶中的細胞分散到D瓶中，用處理，然后配制成，再分裝。
（5）在D瓶中正常培養了一段時間后，發現細胞全部死亡。原因是。
參考答案
1.C2.B3.C4.C
5.（1）這些部位很少受到病毒等病原體的侵害
（2）脫分化和再分化
（3）愈傷組織細胞分裂
（4）染色體結構和數目
（5）植物體細胞雜交育種基因工程育種單倍體育種
6.（1）脫分化再分化植物激素
（2）半透性（透水、透氣性）和能被微生物降解
7.（1）細胞分裂旺盛
（2）胰蛋白專一培養液
（3）原代培養染色體組型病毒敏感性
（4）胰蛋白酶細胞懸浮液
（5）細胞沒有發生癌變
摘要： 《植物組織培養》是生物專業的必修課，也是一門系統性、實踐性很強的課程。為提高學生的實踐技能，培養創新型人才，本文從優化教學內容，改革教學手段，加強實驗考核，全面評價學生能力等方面進行了討論。
關鍵詞： 《植物組織培養》 理論教學改革 實驗教學改革
植物組織培養是指從植物體分離出符合需要的組織、器官或細胞，原生質體等，通過無菌操作，在人工控制條件下進行培養，使其再生細胞或完整植株的技術。植物組織培養技術幾十年來得到迅速發展，已滲透到生物學科的各個領域，成為生物工程技術中一個重要的組成部分和基本研究手段之一[1]，目前這項技術已廣泛應用于生產中，如利用單倍體育種，胚培養，體細胞雜交等技術來培育植物新品種，對無性繁殖植物進行脫毒，快速繁殖苗木，生產次生代謝物質，保存種質資源等[2]?！吨参锝M織培養》是生物學專業的必修課，同時也是一門理論性、實踐性很強的課程，通過課程學習，使學生掌握組織培養的基本原理和基本技術，為以后從事基礎研究、苗木生產等工作奠定基礎。面向21世紀知識經濟時代，應樹立知識、能力、素質并重的觀念，由只重視知識傳授向融傳授知識、培養能力和提高素質為一體轉變，突出素質教育和創造型人才的培養[3-4]。因此，在新形勢下進行課程改革，提高學生的理論水平和實踐操作技能迫在眉睫。
1.理論教學改革
《植物組織培養》課程內容很多，近幾年來，理論教學的學時數不斷縮減。為此需要優化教學內容，講授基本理論和基礎知識，把內容精簡成四個教學模塊。一是實驗室和儀器設備，主要介紹實驗室的布局安排、所需的主要工具及儀器設備，安排在實驗室里進行現場教學，既少用學時又利于學生理解，加深印象。二是培養基選擇和制備，使學生明確各種藥品的作用和培養基的配置方法。三是器官培養，以根尖、莖尖、葉片、花瓣等器官為主要材料，講授外植體選擇和消毒處理方法，無菌接種技術，培養產物的統計方法。四是組織培養的應用，主要講授脫毒技術，離體快繁技術，花藥培養技術等。后三個模塊主要采用多媒體進行講授。在講授中，重點講解原理和技術，理論聯系實際，注重實用性。充分發揮多媒體教學的優勢，用豐富的圖片、視頻等進行形象說明。如在講解接種時，把步驟分解成幾個圖片，同時附上錯誤步驟的圖片，這樣清晰明了。并且避免一味“滿堂灌”，運用多種教學手段，適時采用對比、總結、討論等方式，如總結各種培養基的特點，對比各種消毒劑的效果，討論各種外植體的消毒方法、接種方式，也安排一定的章節由學生自學或學生講解，如室內培養和幼苗移栽環節。總之要充分發揮學生主體，教師主導的作用，調動和激發學生的積極性和興趣，啟發學生思考，變被動學習為主動學習。通過四個模塊的教學就使學生對整個組織培養有了系統的理解，為今后從事相關工作奠定了堅實的基礎。
2.實驗教學改革
2.1教學內容改革
學生實驗是《植物組織培養》課程的重要教學部分，其目的是使學生鞏固和加深所學理論知識，培養學生觀察、分析、解決問題的能力，嚴謹、求實的作風。恰當安排實驗內容是提高學生實踐動手能力、科學實驗能力的關鍵所在。開設實驗室的布局和儀器購置實驗，使學生能合理安排實驗用房熟練操作常用的接種、滅菌、培養的儀器設備。以4人小組為單位，開設培養基母液和培養基配置及滅菌實驗，要求小組能熟練進行藥品的稱量，倍數換算，滅菌。最后小組內交流經驗，達到人人勝任的要求。開設接種實驗，學生在接種后標記姓名，統計污染率，鍛煉學生的無菌操作能力，要求人人過關。以上實驗屬于基礎技能培養。我們還開設能力提升實驗，以4人或8人小組為單位，開設2種植物的離體培養實驗。具體做法是小組成員確定培養材料，學生可自由選擇植物的葉片、花瓣、種子等材料，查閱資料確定具體培養方案，包括設計培養基類型，消毒劑種類和消毒時間，和指導教師商討后開始實施。教師全程跟蹤，指導學生操作。本實驗提高了學生興趣，培養了學生大膽動手、改革創新的能力，也鍛煉了學生的設計能力，同時這也是一個綜合性實驗，鍛煉了學生外植體消毒、無菌接種、培養等多種技能。
2.2實驗考核改革
對實驗進行考核是評價學生實驗能力的方法，也是督促學生學習的手段之一。要求學生在課前預習實驗的內容，理解操作步驟，并寫出報告，做到心中有數，達到事半功倍的效果。教師根據學生的理解程度打分。在實驗中，要求學生能認真操作，相互配合，并逐一對學生的操作水平和熟練程度進行打分，對于分數低的學生重點指導，督促其練習。要求在課下及時整理實驗內容書寫實驗報告，重點寫明實驗的過程，尤其是實驗的關鍵環節，并著重分析實驗結果，提出改進意見。這種考核方式注重了學生的基礎實驗知識，操作技能，設計能力，尤其是學生的動手能力和解決問題的能力，完全改變了過去只注重實驗報告尤其是實驗結果的考核方式。在學期末還要進行實驗考試，重點是考查學生的藥品配置、無菌操作等基本技能。實驗成績分數低的學生需重新實踐，合格后才能參加期末理論考試。這一系列的措施使學生在課前進行預習，上課認真操作，課下及時總結實驗結果，增強了實驗課的教學效果，提高了學生實驗技能，培養了學生的創新能力。
組織培養技術發展迅速，教師要不斷探討新的教學方法才能提高教學質量，培養學生的創新能力，適應社會發展的需要。
